一种三七皂苷类成分的分析方法

摘要

本发明提供了一种三七皂苷类成分的分析方法，包括三七皂苷的含量测定和指纹图谱测定，具体包括供试品溶液的制备、对照品溶液的制备以及采用超高效液相色谱测定复方丹参滴丸中三七皂苷类成分的含量和指纹图谱。本发明采用相同的色谱条件，可以同时测定三七皂苷类成分的含量与指纹图谱，具有很好的线性、重复性、稳定性和回收率，有助于更加全面控制复方丹参滴丸的质量。

权利要求

1.一种三七皂苷类成分的分析方法，包括三七皂苷类成分的含量测定和指纹图谱测定，其特征在于，包括以下步骤：(1)供试品溶液的制备：取复方丹参滴丸，精密称定，加入氨水溶液，超声；过ODS柱，依次用水、甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，过滤，即得；

(2)对照品溶液的制备：分别精密称取三七皂苷R1对照品、人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品适量，用甲醇溶解并稀释，即得；

(3)三七皂苷类成分的含量测定：取所述供试品溶液和对照品溶液，采用超高效液相色谱进行分析，测定三七皂苷类成分的含量；

(4)三七皂苷类成分的指纹图谱测定：取所述供试品溶液，采用超高效液相色谱进行分析，得到指纹图谱；

其中，所述超高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱为C18色谱柱，流动相A相为乙腈，流动相B相为水，梯度洗脱，洗脱过程如下：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备为：取复方丹参滴丸10-30丸，精密称定后置于15ml刻度管中，加入0.5％-10％的氨水溶液1-10ml，超声至溶解；过1.0cm内径的ODS小柱，用50ml水洗后用100％甲醇洗脱至10ml容量瓶并定容，摇匀过

0.22μm有机滤膜，即得。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对照品溶液的制备为：分别精密称取三七皂苷R1对照品、人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品适量，用甲醇溶解并稀释，制成含三七皂苷R1浓度为0.01-0.1mg/ml、人参皂苷Rg1浓度为0.1-0.5mg/ml、人参皂苷Re浓度为0.01-0.06mg/ml、人参皂苷Rb1浓度为0.1-0.5mg/ml的混合对照品溶液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱采用紫外检测器，检测波长为200-210nm。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述检测波长为203nm。

说明书

一种三七皂苷类成分的分析方法

技术领域

[0001] 本发明属于中药领域，具体涉及一种三七皂苷含量测定及指纹图谱分析的检测方法。

背景技术

[0002] 复方丹参滴丸是由丹参、三七和冰片制成的滴丸剂，在临床上广泛用于冠心病、心绞痛的预防、治疗、急救，现已成为国内心血管市场上的主导品牌之一。复方丹参滴丸的主要成分为丹参素（danshensu,Da）、原儿茶醛（protocatechuic aldehyde,Pra）和丹酚酸B（salvianolic acid B,Sal B）。

[0003] 目前药典中复方丹参滴丸的含量测定方法为：以丹参素钠为对照品，采用高效液相色谱法测定丹参素的含量，具体方法为（：1）对照品溶液的制备：取丹参素钠对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.16mg（相当于丹参素0.14mg）的溶液，即得；（2）供试品溶液的制备：取复方丹参滴丸5丸，置10ml量瓶中，加甲醇适量适量，超声处理2小时，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取滤液即得；（3）分别精密吸取对照品溶液5μl与供试品溶液5-10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

[0004] 中药指纹图谱是目前能够为国内外广泛接受的全面评价中药质量模式的一种方法。美国FDA在植物药制品指导原则中允许申报者提供产品的色谱指纹图谱资料，德国药用植物学会、英国草药典、印度草药典以及加拿大药用及芳香植物学会也都把指纹图谱作为质量控制标准的内容之一。国内学者谢培山也认为，中药质量需综合评价，指纹图谱分析是对中药及制剂进行综合宏观分析的可行手段之一。但有关于复方丹参滴丸中的三七皂苷类成分的指纹图谱方面的研究在国内外尚未见报道。

[0005] 复方丹参滴丸上市十余年中逐步建立了完善的工艺质量控制体系，目前正在以药品的形式进行FDA申报研究。但是，复方丹参滴丸组分中含量测定组分仍然较低，提升产品工艺质量控制水平，需要针对其中更多的中药化学成分进行深入研究，从而更加准确地把握产品质量，降低用药风险，同时为国际注册提供支持。

[0006] 复方丹参滴丸中，臣药三七的主要活性成分是三七皂苷和人参皂苷，而三七皂苷是三七区别于人参的特有活性成分。但是目前对于复方丹参滴丸中的三七皂苷类成分还没有有 效的专属性的分析方法。

[0007] 为了更好地控制复方丹参滴丸的质量，需要一种三七皂苷类成分的分析方法，包括三七皂苷类成分的含量测定和指纹图谱测定方法，尤其是对三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的指纹图谱鉴别方法及定量方法。

发明内容

[0008] 本发明的目的在于提供一种三七皂苷类成分的分析方法，包括三七皂苷的含量测定和指纹图谱测定。

[0009] 根据本发明所述的三七皂苷类成分的分析方法，包括以下步骤：

[0010] （1）供试品溶液的制备：取复方丹参滴丸，精密称定，加入氨水溶液，超声；过ODS柱，依次用水、甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，过滤，即得；

[0011] （2）对照品溶液的制备：分别精密称取三七皂苷R1对照品、人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品适量，用甲醇溶解并稀释，即得；

[0012] （3）三七皂苷的含量测定：取所述供试品溶液和对照品溶液，采用超高效液相色谱进行分析，测定三七皂苷的含量；

[0013] （4）三七皂苷的指纹图谱测定：取所述供试品溶液，采用超高效液相色谱进行分析，得到指纹图谱。

[0014] 根据本发明的实施方式之一，所述供试品溶液的制备为：取复方丹参滴丸10-30丸，精密称定后置于15ml刻度管中，加入0.5%-10%的氨水溶液1-10ml，超声至溶解；过1.0cm内径的ODS小柱，用50ml水洗后用100%甲醇洗脱至10ml容量瓶并定容，摇匀过0.22μm有机滤膜，即得。

[0015] 根据本发明的另一实施方式，所述对照品溶液的制备为：分别精密称取三七皂苷R1对照品、人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品适量，用甲醇溶解并稀释，制成含三七皂苷R1浓度为0.01-0.1mg/ml、人参皂苷Rg1浓度为0.1-0.5mg/ml、人参皂苷Re浓度为0.01-0.06mg/ml、人参皂苷Rb1浓度为0.1-0.5mg/ml的混合对照品溶液。

[0016] 根据本发明的再一实施方式，所述超高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱为C18色谱柱，流动相A相为乙腈或甲醇，流动相B相为水，梯度洗脱；紫外检测器，检测波长为200-210nm。

[0017] 优选的，所述流动相A相为乙腈，所述梯度洗脱的梯度为：

[0018]

[0019]

[0020] 为减小溶剂对样品分析的影响，本发明优选乙腈-水为流动相系统。

[0021] 考察了多种梯度洗脱的梯度条件，在本发明所述的梯度洗脱的梯度条件下，4个三七皂苷类成分均达到了基线分离，且各个色谱峰全被有效分离，峰形均较为尖锐直立，亦能满足指纹图谱的要求。

[0022] 优选的，所述超高效液相色谱的检测波长为203nm。

[0023] 三七皂苷类成分的常用检测方法有紫外检测、蒸发光散射检测。紫外检测法简便、成熟稳定、线性范围广、仪器普及，因此优选紫外检测法。三七皂苷类成分在紫外末端200-210nm范围内均有紫外吸收，其最大吸收波长为203nm，因此本发明优选203nm为三七皂苷类成分的紫外检测波长。

[0024] 本发明的另一目的在于提供一种三七皂苷类成分的指纹图谱。

[0025] 根据本发明的实施方式之一，所述指纹图谱是由8个共有指纹峰构成的。

[0026] 以2号峰人参皂苷Rg1为参照峰，7个共有峰的相对保留时间RSD均＜0.1%，相对峰面积RSD除8号峰外均＜3.0%，8号峰峰面积因分离情况影响，RSD较大为8.74%。

[0027] 根据本发明的另一实施方式，所述指纹图谱是由5个共有指纹峰构成的。

[0028] 优选的，所述5个共有峰相对于参比峰的相对保留时间和相对峰面积分别为：

[0029] 1号峰，相对保留时间为0.77min，相对峰面积为0.19；

[0030] S号峰，相对保留时间为1.00min，相对峰面积1；

[0031] 2号峰，相对保留时间为1.04min，相对峰面积0.11；

[0032] 3号峰，相对保留时间为1.93min，相对峰面积0.64；

[0033] 4号峰，相对保留时间为2.46min，相对峰面积0.13；

[0034] 与S峰相比，其余各峰的相对保留时间和相对峰面积均应在规定值的±5%以内。

[0035] 以峰面积最大的人参皂苷Rg1为参照峰，排除峰面积小于参照峰峰面积5%的共有峰， 以及不同仪器、不同色谱柱条件下相对出峰位置变化较大的色谱峰，得到由5个共有峰组成的复方丹参滴丸中三七皂苷类成分的指纹图谱。该指纹图谱以人参皂苷Rg1为参照峰，其余4个共有峰的相对保留时间RSD均＜0.1%，相对峰面积RSD均＜3.0%。

[0036] 根据本发明，样品与所述指纹图谱经中国色谱指纹图谱相似度评价系统计算，相似度在0.8-1.0之间。

[0037] 本发明所述样品为复方丹参滴丸，采用本发明所述方法测定待测样品中的三七皂苷类成分的含量，然后经中国色谱指纹图谱相似度评价系统计算与本发明所述指纹图谱的相似度。本发明所述的中国色谱指纹图谱相似度评价系统是由中国药典委员会颁布的。

[0038] 优选的，样品与所述指纹图谱经中国色谱指纹图谱相似度评价系统计算，相似度不低于0.9。

[0039] 本发明采用相同的色谱条件，可以同时测定复方丹参滴丸中三七皂苷类成分的含量与指纹图谱，具有很好的线性、重复性、稳定性和回收率，有助于更加全面控制复方丹参滴丸的质量。附图说明：

[0040] 图1不同色谱柱的分离情况考察试验结果一，色谱柱①Aqucity UPLCTM BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)。

[0041] 图2不同色谱柱的分离情况考察试验结果二，色谱柱②Waters Aqucity UPLCTM HSS T3(2.1×100mm，1.8μm)。

[0042] 图3不同色谱柱的分离情况考察试验结果三，色谱柱③Aqucity UPLCTM BEH SHIELD RP C18(2.1×100mm,1.7μm)。

[0043] 图4流动相梯度比例的考察试验的典型色谱图，色谱柱③Aqucity UPLCTM BEH SHIELD RP C18(2.1×100mm,1.7μm)，对应梯度洗脱程序见表2。

[0044] 图5流动相梯度比例的考察试验的典型色谱图，色谱柱①Aqucity UPLCTM BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)，对应梯度洗脱程序见表3。

[0045] 图6三七药材、复方丹参浸膏、复方丹参滴丸、阴性样品、空白溶剂比较图，色谱柱①Aqucity UPLCTM BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)，对应梯度洗脱程序见表3。

[0046] 图7不同成分对照品比较图。

[0047] 图8实施例一确定的复方丹参滴丸三七皂苷类成分的指纹图谱。

[0048] 图9三种不同厂家仪器复方丹参滴丸三七对照指纹图谱，色谱柱为Aqucity UPLCTM BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)。

[0049] 图10三种不同品牌色谱柱测得的复方丹参滴丸三七对照指纹图谱（批号为120509）。

[0050] 图11两个不同实验室三组实验人员测得的复方丹参滴丸三七对照指纹图谱（批号为120502）。

[0051] 图12实施例二确定的三七皂苷类成分指纹图谱。

[0052] 图13不同成分对照品比较图。具体实施方式：

[0053] 以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

[0054] 试验例一三七皂苷的含量测定与指纹图谱测定方法试验条件的优化

[0055] 1、仪器、试药

[0056] 仪器：Waters超高效液相色谱仪，UPLC-PDA Detector；Agilent1290超高效液相色谱仪，UHPLC-DAD Detector；SHIMADZU Nexera LC-30A超高效液相色谱仪，UHPLC-DAD Detector。

[0057] 对照品：三七皂苷R（1 批号110745-200415，供含量测定用）、人参皂苷Rb（1 批号110704-200318，供含量测定用）、人参皂苷Rg（1 批号110703-200424，供含量测定用）、人参皂苷Re（批号110754-200421，供含量测定用）均购自中国药品生物制品检定所，置五氧化二磷减压干燥器中干燥12小时以上使用。

[0058] 相似度评价软件：中国色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版、2004B版（中国药典委员会）。

[0059] 色谱柱：Aqucity UPLCTM BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)；Waters Aqucity UPLCTM HSS T3(2.1×100mm，1.8μm)；Aqucity UPLCTM BEH SHIELD RP C18(2.1×100mm,1.7μm);Thermo Hypersil GOLD Aq(2.1×100mm,1.9μm);Agilent ZORBAX SB-C18(2.1×100mm,
1.8μm)等不同型号色谱柱。

[0060] 乙腈：色谱纯（Merck公司）；

[0061] 甲醇：分析纯、色谱纯（天津市康科德科技有限公司）；

[0062] 氨水：分析纯（天津市风船化学试剂科技有限公司）；

[0063] 水：超纯水。

[0064] 2、供试品处理方法的选择

[0065] 按处方量比例折合称样量，优选供试品处理方法如下：复方丹参滴丸20丸（约0.5g）， 精密称定后置于15ml刻度管中，加入4%的氨水溶液5ml，超声至溶解。过1.0cm内径的ODS小柱（80-100目1.0g，甲醇20ml，水20ml活化），用50ml水洗后用100%甲醇洗脱至10ml容量瓶并定容，摇匀过0.22μm有机滤膜，即得。

[0066] 3、色谱条件的选择

[0067] 3.1、检测波长选择

[0068] 三七皂苷类成分的常用检测方法有紫外检测、蒸发光散射检测。紫外检测法简便、成熟稳定、线性范围广、仪器普及，因此优选紫外检测法。三七皂苷类成分在紫外末端200-210nm范围内均有紫外吸收，其最大吸收波长为203nm，因此本发明优选203nm为三七皂苷类成分的紫外检测波长。

[0069] 3.2、流动相溶液选择：

[0070] 高效液相色谱法常用流动相中有机相大多为色谱甲醇或色谱乙腈，而三七皂苷类成分检测波长为203nm，此波长条件下，甲醇、乙腈均存在末端吸收，试验表明，乙腈的吸光度（约0.15）远低于甲醇（约1.0）。为减小溶剂对样品分析的影响，本发明优选乙腈-水为流动相系统。

[0071] 3.3、色谱柱的考察：

[0072] 分别采用①Aqucity UPLCTM BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)；②Waters Aqucity UPLCTM HSS T3(2.1×100mm，1.8μm)；③Aqucity UPLCTM BEH SHIELD RP C18(2.1×100mm,1.7μm)不同色谱柱；检测波长：203nm；以乙腈为流动相A；以水溶液为流动相B，梯度洗脱比例参照企业内部资料初步设定，见表1，对三七皂苷类4个成分进行分离情况的考察。不同色谱柱考察色谱图见图1～3。

[0073] 由图可以看出，色谱柱①图谱中人参皂苷Rg1、Re未达到完全分离，但有分开趋势；色谱柱②相同条件下保留的色谱峰个数较少；色谱柱③对样品的整体分离情况较好，但人参皂苷Rg1处似裹有小杂峰，故初步计划采用色谱柱③进行流动相梯度比例的考察。

[0074] 3.4流动相梯度比例的考察

[0075] 3.4.1采用色谱柱③Aqucity UPLCTM BEH SHIELD RP C18(2.1×100mm,1.7μm)，进行流动相梯度比例的考察。

[0076] 首先按梯度洗脱程序表1，使用UPLC-PDA Detector对四个定量成分色谱峰的峰纯度进行考察，结果2号峰峰纯度不能满足要求，则为保证四个定量成分色谱峰均达到基线分离，共考察了27种不同的流动相梯度比例，典型考察色谱图见图4，对应梯度洗脱程序见表2。如图4所示，谱图中前半段时间拉长，使得各个色谱峰峰形矮胖，不尖锐，且若后 半段完全展开，则整体分析时间将延长到50分钟左右。

[0077] 表1梯度洗脱程序1

[0078]

[0079] 表2梯度洗脱程序2

[0080]

[0081] 3.4.2鉴于以上问题，换用色谱柱①Aqucity UPLCTM BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)重新进行流动相梯度的考察，

[0082] 首先，同样采用表2中的梯度洗脱程序进行考察，结果峰形有所改善。在此基础上，进行了进一步的优化，共调整8种不同的流动相梯度比例条件，结果初步确定了表3中显示的梯度洗脱条件，此条件下，4个三七皂苷类成分均达到了基线分离，且各个色谱峰全被有效 分离，峰形均较为尖锐直立，亦能满足指纹图谱的要求，见图5。

[0083] 表3梯度洗脱程序3

[0084]

[0085] 试验例二三七皂苷的含量测定的方法学验证

[0086] 1、线性

[0087] 分别精密称取三七皂苷R1对照品、人参皂苷Rgz对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品适量，用甲醇溶解并稀释，制成含三七皂苷R1浓度为0.04836mg/ml、人参皂苷Rg1浓度为0.2404mg/ml、人参皂苷Re浓度为0.0328mg/ml、人参皂苷Rb1浓度为0.2361mg/ml的混合对照品溶液。取各对照品适量，精密称定后，加甲醇制成每1ml分别含三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1各0.2034、0.9192、0.12168、0.9072mg的溶液，作为储备液。将上述储备液依次稀释至1倍、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍，作为各浓度标准曲线溶液，精密吸取上述溶液各1μl，注入液相色谱仪，以进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1分别在6.35625～203.4、28.725～919.2、3.8025～121.68、28.35～907.2μg范围内线性关系良好。见表4-7。

[0088] 表4三七皂苷R1标准曲线

[0089]

[0090] 表5人参皂苷Rg1标准曲线

[0091]

[0092] 表6人参皂苷Re标准曲线

[0093]

[0094] 表7人参皂苷Rb1标准曲线

[0095]

[0096] 2、精密度试验

[0097] 取同一批号（批号：111206）样品，取1份，精密称取20丸，按实施例一所述方法进行分析，连续进样6次，测定样品中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1峰面积，测得峰面积平均值为三七皂苷R143003，峰面积的RSD为0.98%；人参皂苷Rg1221149，峰面积的RSD为0.57%；人参皂苷Re 24461，峰面积的RSD为1.37%；人参皂苷Rb1137625，峰面积的RSD为0.61%，符合要求，结果见表8。

[0098] 表8精密度试验

[0099]

[0100] 3、重复性试验

[0101] 取同一批号（批号：111206）样品，共6份，按实施例一所述方法进行分析，精密吸取供试品溶液1μl，注入液相色谱仪，测定每份样品各指标成分含量，结果见表9。

[0102] 表9重复性试验

[0103]

[0104] 4、稳定性试验

[0105] 取同一批号（批号：111206）样品，取1份，精密称取20丸，按照实施例一所述方法进行分析，分别在0、0.5、2、4、6.5、10、14、20及22小时，测定样品中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1各自峰面积，测得峰面积值的RSD分别为为1.83%、0.51%、0.88%、1.72%，结果表明供试品溶液在22小时内测定稳定，结果见表10。

[0106] 表10稳定性试验

[0107]

[0108] 5、准确度试验

[0109] 取同一批号（批号：111206）样品，共6份，每份10丸，精密称定，精密加入每1ml含三七皂苷R10.05408mg、人参皂苷Rg10.1645mg、人参皂苷Re0.02524mg、人参皂苷Rb10.2102mg的溶液5ml，按照实施例一所述方法进行分析，测定，计算回收率。结果三七皂苷R1平均回收率为98.55%，RSD为1.45%、人参皂苷Rg1平均回收率为95.95%，RSD为0.71%、人参皂苷Re平均回收率为102.6%，RSD为1.83%、人参皂苷Rb1平均回收率为96.81%，RSD为1.10%。结果见表11-14。

[0110] 表11三七皂苷R1回收率试验

[0111]

[0112]

[0113] 表12三七皂苷Rg1回收率试验

[0114]

[0115] 表13三七皂苷Re回收率试验

[0116]

[0117] 表14三七皂苷Rb1回收率试验

[0118]

[0119]

[0120] 6、耐用性试验

[0121] 6.1不同人员试验考察

[0122] 取批号为111208批样品，由实验室3个不同试验人员分别按实施例一所述方法进行分析，测定样品中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1各自峰面积，计算，结果见表15。

[0123] 表15不同人员测定三七皂苷类结果（mg/丸）

[0124]

[0125] 6.2、不同仪器试验考察

[0126] 使用Aqucity UPLCTM BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)，Lot No.0202320241色谱柱，分别采用Waters UPLC、Agilent1290UHPLC、SHIMADZU LC-30A UHPLC三家不同仪器对方法进行了比对，分别对批号为120104、120105、120109三批样品进行分析，结果见表16，三七皂苷类成分含量不同仪器间基本无差异。

[0127] 表16三七总皂苷含量不同仪器比较（mg/丸）

[0128]

[0129] 6.3不同色谱柱试验考察

[0130] 分别使用Aqucity UPLCTM BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)；Thermo Hypersil GOLD Aq(2.1×100mm,1.9μm)；Agilent ZORBAX SB-C18(2.1×100mm,1.8μm)三个不同品牌色谱柱对120509、120510批样品进行分析。结果见表17，三七皂苷类成分含量不同色谱柱间因分离情况差异存在的一定的差异，两批样品三个不同品牌色谱柱的RSD分别为6.39%、5.79%。

[0131] 表17三七总皂苷含量不同色谱柱比较（mg/丸）

[0132]

[0133] 实施例一

[0134] 1、仪器、试药

[0135] 仪器：Waters超高效液相色谱仪,UPLC-PDA Detector；Agilent1290超高效液相色谱仪,UHPLC-DAD Detector；SHIMADZU Nexera LC-30A超高效液相色谱仪，UHPLC-DAD Detector。共三台色谱仪。

[0136] 对照品：三七皂苷R（1 批号110745-200415，供含量测定用）、人参皂苷Rb（1 批号110704-200318，供含量测定用）、人参皂苷Rg（1 批号110703-200424，供含量测定用）、人参皂苷Re（批号110754-200421，供含量测定用）均购自中国药品生物制品检定所，置五氧化二磷减压干燥器中干燥12小时以上使用。

[0137] 相似度评价软件：中国色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版、2004B版（中国药典委员会）

[0138] 色谱柱：Aqucity UPLCTM BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)。

[0139] 乙腈：色谱纯（Merck公司）

[0140] 甲醇：分析纯、色谱纯（天津市康科德科技有限公司）

[0141] 氨水：分析纯（天津市风船化学试剂科技有限公司）

[0142] 水：超纯水

[0143] 2、色谱条件

[0144] 检测波长：203nm；以乙腈为流动相A；以水溶液为流动相B，梯度洗脱，洗脱梯度如下：

[0145]

[0146]

[0147] 3、供试品溶液的制备：复方丹参滴丸20丸（约0.5g），精密称定后置于15ml刻度管中，加入4%的氨水溶液5ml，超声至溶解。过1.0cm内径的ODS小柱（80-100目1.0g，甲醇20ml，水20ml活化），用50ml水洗后用100%甲醇洗脱至10ml容量瓶并定容，摇匀过0.22μm有机滤膜，即得。

[0148] 4、对照品溶液的制备：分别精密称取三七皂苷R1对照品、人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品适量，用甲醇溶解并稀释，制成含三七皂苷R1浓度为0.04836mg/ml、人参皂苷Rg1浓度为0.2404mg/ml、人参皂苷Re浓度为0.0328mg/ml、人参皂苷Rb1浓度为0.2361mg/ml的混合对照品溶液。

[0149] 5、三七皂苷类成分的含量测定：精密吸取上述两种溶液各1μl，采用超高效液相色谱进行分析，测定三七皂苷类成分的含量。

[0150] 取3批样品进行测定，每批样品中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量见表18。

[0151] 表18样品含量测定结果

[0152]

[0153] 6、三七皂苷的指纹图谱测定：

[0154] 6.1、指纹图谱共有峰的初步确定

[0155] 为初步确定共有峰的个数，随机抽取复方丹参浸膏及三七药材各一批，进行试验考察。

[0156] 6.1.1按制剂处方量折算复方丹参浸膏称样量为0.1g，按实施例一所述供试品溶液的制备方法进行操作，即得浸膏供试品溶液。

[0157] 6.1.2取药材粉末2.5g于回流瓶中，加入蒸馏水50ml，回流1.5h，过滤，滤渣中加入50ml蒸馏水，回流1h，合并滤液，用水定容至100ml容量瓶中，摇匀即得提取物母液。精密量取2ml至5ml容量瓶中，加甲醇定容至刻线，摇匀，过0.45μm有机滤膜，即得三七药材供试品溶液。

[0158] 6.1.3阴性样品溶液的制备

[0159] 按照处方配比，取除三七外其他两味药材，按照工艺制得阴性样品，再按照实施例一所述供试品溶液的制备方法进行操作，制得阴性样品溶液。精密吸取1μl，注入液相色谱仪。

[0160] 将上述三种供试品溶液按实施例一所述色谱条件分析，记录供试品色谱图，并与复方丹参滴丸及空白溶剂色谱图比较（图6）。由比较图可以看出，保留时间在20min之前的色谱峰药材-浸膏-滴丸三者之间对应均较好，而保留时间在20min之后的色谱峰可以分为三组，第Ⅰ组药材中2个色谱峰在浸膏及滴丸中均含量较低；第Ⅱ组药材及浸膏中对应的2个色谱峰在滴丸中含量极低；第Ⅲ组为溶剂峰。根据以上分析，则指纹图谱中分析时间截止在保留时间在20min之前，依据考察条件时测定的图谱，初步确定8个共有峰，如图7中所示。

[0161] 6.2、对照品溶液的制备

[0162] 以共有峰中峰面积最大的2号峰人参皂苷Rg1为参照峰。则精密称取人参皂苷Rg1对照品适量，用甲醇溶解并稀释，制成含人参皂苷Rg1浓度为0.2404mg/ml的对照品溶液。

[0163] 6.3、指纹图谱的确定

[0164] 取所述供试品溶液，采用超高效液相色谱进行分析，采用中国色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版对34批样品的指纹图谱进行拟合，则得到对照指纹图谱，见图8。

[0165] 7、指纹图谱测定方法学验证

[0166] 7.1、精密度试验

[0167] 取同一批号（批号：111206）样品，取1份，精密称取20丸，按实施例一所述方法进行分析，连续进样6次。6份样品中，共有峰的相对保留时间及相对峰面积比值的RSD结果见表19、20，以2号峰为参比峰，其余7个共有峰的相对保留时间RSD均＜0.1%，相对峰面积RSD除8号峰外均＜3.0%，8号峰峰面积因分离情况影响，RSD较大为8.74%。

[0168] 表19共有峰相对保留时间比值精密度试验

[0169]

[0170]

[0171] 表20共有峰相对峰面积比值精密度试验

[0172]

[0173] 7.2、重复性试验

[0174] 取同一批号（批号：111206）样品，共6份，按“实施例一所述方法进行分析，精密吸取供试品溶液1μl，注入液相色谱仪，测定。6份样品中，共有峰的相对保留时间及相对峰面积比值的RSD结果见表21、22，以2号峰为参比峰，其余7个共有峰的相对保留时间RSD均＜0.3%，相对峰面积RSD除7、8号峰外均＜3.0%，7、8号峰峰面积因分离情况影响，RSD较大分别为8.08、10.12%。

[0175] 表21共有峰相对保留时间比值的重复性试验

[0176]

[0177] 表22共有峰相对峰面积比值重复性试验

[0178]

[0179] 7.3稳定性试验

[0180] 取同一批号（批号：111206）样品，取1份，精密称取20丸，按照实施例一所述方法进行分析，分别在0、0.5、2、4、6.5、10、14、20及22小时，测定。不同时间点共有峰的相对保留时间及相对峰面积比值的RSD%结果见表22、23，以2号峰为参比峰，其余7个共有峰的相对保留时间RSD均＜0.3%，相对峰面积RSD除8号峰外均＜4.0%，8号峰峰面积因分离情况影响，RSD较大分别为8.31%。

[0181] 表23共有峰相对保留时间比值的稳定性试验

[0182]

[0183] 表24共有峰相对峰面积比值稳定性试验

[0184]

[0185]

[0186] 7.4共有峰成分的确定

[0187] 为确定三七对照指纹图谱中8个共有峰的成分，采用对照品比对法对样品中的色谱峰进行定性，见图7，结果确定6号峰为人参皂苷Rd。

[0188] 实施例二

[0189] 1、仪器、试药

[0190] 仪器：Waters超高效液相色谱仪,UPLC-PDA Detector；Agilent1290超高效液相色谱仪,UHPLC-DAD Detector；SHIMADZU Nexera LC-30A超高效液相色谱仪，UHPLC-DAD Detector。共三台色谱仪。

[0191] 对照品：三七皂苷R（1 批号110745-200415，供含量测定用）、人参皂苷Rb（1 批号110704-200318，供含量测定用）、人参皂苷Rg（1 批号110703-200424，供含量测定用）、人参皂苷Re（批号110754-200421，供含量测定用）均购自中国药品生物制品检定所，置五氧化二磷减压干燥器中干燥12小时以上使用。

[0192] 相似度评价软件：中国色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版、2004B版（中国药典委员会）

[0193] 色谱柱：Aqucity UPLCTM BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)；Waters Aqucity UPLCTM HSS T3(2.1×100mm，1.8μm)；Aqucity UPLCTM BEH SHIELD RP C18(2.1×100mm,1.7μm);Thermo Hypersil GOLD Aq(2.1×100mm,1.9μm);Agilent ZORBAX SB-C18(2.1×100mm,
1.8μm)共5支不同型号色谱柱。

[0194] 乙腈：色谱纯（Merck公司）

[0195] 甲醇：分析纯、色谱纯（天津市康科德科技有限公司）

[0196] 氨水：分析纯（天津市风船化学试剂科技有限公司）

[0197] 水：超纯水

[0198] 2、色谱条件

[0199] 检测波长：203nm；以乙腈为流动相A；以水溶液为流动相B，梯度洗脱，洗脱梯度如下：

[0200]

[0201] 3、供试品溶液的制备：复方丹参滴丸20丸（约0.5g），精密称定后置于15ml刻度管中，加入4%的氨水溶液5ml，超声至溶解。过1.0cm内径的ODS小柱（80-100目1.0g，甲醇20ml，水20ml活化），用50ml水洗后用100%甲醇洗脱至10ml容量瓶并定容，摇匀过0.22μm有机滤膜，即得。

[0202] 4、对照品溶液的制备：分别精密称取三七皂苷R1对照品、人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品适量，用甲醇溶解并稀释，制成含三七皂苷R1浓度为0.04836mg/ml、人参皂苷Rg1浓度为0.2404mg/ml、人参皂苷Re浓度为0.0328mg/ml、人参皂苷Rb1浓度为0.2361mg/ml的混合对照品溶液。

[0203] 5、三七皂苷的含量测定：精密吸取上述两种溶液各1μl，采用超高效液相色谱进行分析，测定三七皂苷类成分的含量。

[0204] 6、三七皂苷的指纹图谱测定：取所述供试品溶液，采用超高效液相色谱进行分析，采用中国色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版对36批样品的指纹图谱进行拟合，图谱处理过程中发现批号为20080710、090509的2批样品中8号峰太小，不能满足按2号峰人参皂苷Rg1峰面积5%为最小峰面积的积分条件。

[0205] 6.1不同仪器试验考察

[0206] 使用Aqucity UPLCTM BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)，Lot No.0202320241色谱柱，分别 采用Waters UPLC、Agilent 1290 UHPLC、SHIMADZU LC-30A UHPLC三家不同仪器对方法进行了比对，分别对批号为120104、120105、120109三批样品进行分析。表25显示，指纹图谱的相似度基本无差异，但4号色谱峰峰形及分离情况上存在明显差异（见图9）。

[0207] 表25三七指纹图谱相似度不同仪器比较

[0208]

[0209] 6.2不同色谱柱试验考察

[0210] 分别使用Aqucity UPLCTM BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)；Thermo Hypersil GOLD Aq(2.1×100mm,1.9μm)；Agilent ZORBAX SB-C18(2.1×100mm,1.8μm)三个不同品牌色谱柱对120509、120510批样品进行分析。表26显示，指纹图谱的相似度基本无差异，但Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱分析得到色谱图中4号峰的位置较其它两个色谱柱存在一定偏差，见图10。

[0211] 表26三七指纹图谱相似度不同色谱柱比较

[0212]

[0213] 6.3、不同实验室考察

[0214] 分别在2个不同实验室三组实验人员对120413、120501、120502三批样品进行分析，结果见表27。表27显示三批样品中三七皂苷类成分指纹图谱的相似度RSD均在3%以内，但4号峰的位置有一定偏离。两个不同实验室三组实验人员指纹分析图谱见图11。

[0215] 表27三七指纹图谱相似度不同色谱柱比较

[0216]

[0217] 6.4、三七对照指纹图谱的确定

[0218] 综合以上不同仪器、不同色谱柱等考察结果，发现初步拟定的8个共有峰中4、7、8号 峰均不是单一成分，且4号峰因条件不同相对出峰位置变化较大，7、8号峰峰面积较小，且36批样品中已发现2批存在丢峰现象，故最终舍弃4、7、8号峰确定共有峰个数为5个峰，液相记录时间为20min，采用中国色谱指纹图谱相似度评价系统2004 A版对36批样品的指纹图谱进行拟合，得到对照指纹图谱，见图12。

[0219] 7、指纹图谱测定方法学验证

[0220] 7.1、精密度试验

[0221] 取同一批号（批号：111206）样品，取1份，精密称取20丸，按实施例一所述方法进行分析，连续进样6次。6份样品中，共有峰的相对保留时间及相对峰面积比值的RSD结果见表28、29，以峰面积最大的人参皂苷Rg1为参比峰（图12中S峰），其余4个共有峰的相对保留时间RSD均＜0.1%，相对峰面积RSD4均＜3.0%。

[0222] 表28共有峰相对保留时间比值精密度试验

[0223]

[0224] 表29共有峰相对峰面积比值精密度试验

[0225]

[0226] 7.2、重复性试验

[0227] 取同一批号（批号：111206）样品，共6份，按“实施例一所述方法进行分析，精密吸 取供试品溶液1μl，注入液相色谱仪，测定。6份样品中，共有峰的相对保留时间及相对峰面积比值的RSD结果见表30、31，以峰面积最大的人参皂苷Rg1为参比峰（图12中S峰），其余4个共有峰的相对保留时间RSD均＜0.3%，相对峰面积RSD均＜3.0%。

[0228] 表30共有峰相对保留时间比值的重复性试验

[0229]

[0230] 表31共有峰相对峰面积比值重复性试验

[0231]

[0232] 7.3稳定性试验

[0233] 取同一批号（批号：111206）样品，取1份，精密称取20丸，按照实施例一所述方法进行分析，分别在0、0.5、2、4、6.5、10、14、20及22小时，测定。不同时间点共有峰的相对保留时间及相对峰面积比值的RSD%结果见表32、33，以峰面积最大的人参皂苷Rg1为参比峰（图12中S峰），其余4个共有峰的相对保留时间RSD均＜0.3%，相对峰面积RSD均＜4.0%。

[0234] 表32共有峰相对保留时间比值的稳定性试验

[0235]

[0236]

[0237] 表33共有峰相对峰面积比值稳定性试验

[0238]

[0239] 7.4共有峰成分的确定

[0240] 为确定三七对照指纹图谱中5个共有峰的成分，采用对照品比对法对样品中的色谱峰进行定性，见图13，结果确定4号峰为人参皂苷Rd。