荜茇及胡椒中的五种生物碱的鉴定及含量同步测定方法

摘要

本发明公开了一种荜茇及胡椒中的5种生物碱的鉴定及含量同步测定方法。该方法采用HPLC-ESI-IT-MS/MS法对5种生物碱的结构进行了鉴定，并且首次建立了一种快速、准确的UFLC-ESI-MS/MS法同时测定5种生物碱含量的方法。5种生物碱的线性相关系数R2>0.955，最低检测限为0.02-0.03ng/mL，最低定量限为0.05-0.10ng/mL。5种生物碱含量测定方法日内精密度RSD值小于9.30％，日间精密度小于9.55％。该方法的稳定性、重复性、加样回收率均符合要求，方法学考察结果表明该方法具有良好的适用性。

权利要求

1.一种从荜茇和/或胡椒中分离生物碱的方法，包括如下步骤：将待测样品进行液相色谱-串联质谱检测，根据洗脱峰保留时间、Q1和Q3特征分离各个洗脱峰，即得到各个生物碱；

+

所述Q1为分子离子峰[M+H] 的质量，Q3为二级碎片子离子的质量；

所述待测样品为荜茇和/或胡椒；

同时测定五种生物碱为胡椒碱、荜茇明宁碱、二氢荜茇明宁碱、胡椒新碱和墙草碱；

所述液相色谱检测的条件如下：所用色谱柱为Phenomenex Gemini C18反相色谱柱；

所述液相色谱的检测条件中，所述色谱柱的长度为50毫米，内径为2.0毫米，C18的粒径为5μm；

进样量均为10μL；

柱温为室温；

洗脱液由流动相A和流动相B组成；其中，流动相A为质量百分浓度为0.1％的甲酸水溶液；流动相B为由甲酸和乙腈组成的混合液，甲酸的质量百分浓度为0.1％；

洗脱方式为梯度洗脱，洗脱速度为0.55mL/min；

所述梯度洗脱方式如下：

第0分钟起至第0.49分钟末，洗脱液中流动相A与流动相B的体积比为98：2；

第0.50分钟起至第3.00分钟末，洗脱液中流动相A与流动相B的体积比为98-2：

2-98；

第3.10分钟起至第3.99分钟末，洗脱液中流动相A与流动相B的体积比为2：98；

第4.00分钟起至第4.00分钟末，洗脱液中流动相A与流动相B的体积比为98-2：

2-98；

第4.01分钟起至5.49分钟末，洗脱液中流动相A与流动相B的体积比为98：2；

第5.50分钟起，停止洗脱；

所述根据洗脱峰保留时间、Q1和Q3特征分离各个洗脱峰的方法如下：保留时间为3.78分钟、Q1为285.9和Q3为201.1的洗脱峰即为胡椒碱；

保留时间为3.73分钟、Q1为273.9和Q3为201.1的洗脱峰即为荜茇明宁碱；

保留时间为3.71分钟、Q1为276.1和Q3为134.9的洗脱峰即为二氢荜茇明宁碱；

保留时间为3.76分钟、Q1为288.0和Q3为135.1的洗脱峰即为胡椒新碱；

保留时间为3.93分钟、Q1为224.0和Q3为80.9的洗脱峰即为墙草碱；

所述胡椒为黑胡椒或白胡椒；

所述质谱检测条件中，电喷雾电离源的电离电压均为+5000V，离子源温度均为

500℃-600℃；

雾化气的压力均为40-60psi；

辅助加热气的压力均为40-60psi；

气帘气CUR压力均为10-30psi；

每种生物碱对应的解簇电压、碰撞能、碰撞室出口电压如下：胡椒碱：解簇电压为71eV，碰撞能为27eV，碰撞室出口电压为10V；

荜茇明宁碱：解簇电压为56eV，碰撞能为25eV，碰撞室出口电压为10V；

二氢荜茇明宁碱：解簇电压为66eV，碰撞能为29eV，碰撞室出口电压为10V；

墙草碱：解簇电压为96eV，碰撞能为31eV，碰撞室出口电压为4V；

胡椒新碱：解簇电压为111eV，碰撞能为39eV，碰撞室出口电压为10V。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述质谱检测条件中，离子源温度均为

550℃；

雾化气的压力均为50psi；

辅助加热气的压力均为50psi；

气帘气CUR压力均为20psi。

3.根据权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：在所述液相色谱-串联质谱检测步骤之前，将待测样品和甲醇以100mg：100mL的比例混匀后，用微孔滤膜过滤后，取滤液，向其中加入10倍于所述滤液体积的混合液a，涡旋混匀后，再向其中加入19倍于涡旋所得溶液体积的由等体积的甲醇和水组成的混合液涡旋混匀；

其中，所述微孔滤膜的孔径为0.45μm；

所述混合液a为特非那定的溶液；

所述混合液a中，溶剂为甲醇和乙腈；所述特非那定的浓度为50ng/mL；

所述混合液a由如下步骤获得：将特非那定以甲醇溶解，配制成浓度为1.00mg/mL的特非那定的甲醇溶液后，再加入等体积的甲醇和乙腈稀释至特非那定的浓度为50ng/mL，而得；

所述涡旋混匀步骤中，涡旋的时间均为10s。

4.一种测定荜茇和/或胡椒中生物碱含量的方法，包括如下步骤：

1)将已知浓度的所述生物碱的对照品的混合物按照权利要求1-3中任一所述方法进行分离，并记录每种生物碱对应的峰面积；以每种生物碱的浓度值为自变量，以其对应的峰面积为因变量，得到一元线性回归方程；

2)将待测样品按照权利要求1-3中任一所述方法进行分离，并记录每种生物碱对应的峰面积；

3)将每种生物碱对应的峰面积代入步骤(1)中一元线性回归方程，得到所述待测样品中各个生物碱的浓度；

所述待测样品为荜茇和/或胡椒；

同时测定五种生物碱为胡椒碱、荜茇明宁碱、二氢荜茇明宁碱、胡椒新碱和墙草碱。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述胡椒为黑胡椒或白胡椒；

各种所述生物碱对应的一元线性回归方程如下：胡椒碱：y＝0.00353x-0.00046，自变量浓度范围为10-10000ng/mL；

荜茇明宁碱：y＝0.00263x+0.00157，自变量浓度范围为10-10000ng/mL；

二氢荜茇明宁碱：y＝0.00362x+0.00670，自变量浓度范围为10-10000ng/mL；

胡椒新碱：y＝0.00327x-0.00184，自变量浓度范围为10-10000ng/mL；

墙草碱：y＝0.00067x+0.00326，自变量浓度范围为10-10000ng/mL。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：在所述液相色谱-串联质谱检测步骤之前，将待测样品和甲醇以100mg：100mL的比例混匀后，用微孔滤膜过滤后，取滤液，向其中加入10倍于所述滤液体积的混合液a，涡旋混匀后，再向其中加入19倍于涡旋所得溶液体积的由等体积的甲醇和水组成的混合液涡旋混匀；

其中，所述微孔滤膜的孔径为0.45μm；

所述混合液a为特非那定的溶液；

所述混合液a中，溶剂为甲醇和乙腈；所述特非那定的浓度为50ng/mL；

所述混合液a由如下步骤获得：将特非那定以甲醇溶解，配制成浓度为1.00mg/mL的特非那定的甲醇溶液后，再加入等体积的甲醇和乙腈稀释至特非那定的浓度为50ng/mL，而得；

所述涡旋混匀步骤中，涡旋的时间均为10s。

说明书

荜茇及胡椒中的五种生物碱的鉴定及含量同步测定方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种荜茇及胡椒中的五种生物碱的鉴定及含量同步测定方法。

背景技术

[0002] 荜茇为胡椒科植物荜茇(P.longum L.)的干燥近成熟或成熟果实，是东南亚地区的常用调味品。胡椒为胡椒科植物胡椒(P.nigrum L.)的果实，可分为黑胡椒与白胡椒，被广泛用作调味料。白胡椒来源于胡椒的干燥种子，黑胡椒来源于胡椒的未成熟果实。荜茇在我国作为一种常用中药，临床上应用于胃脘疼痛及呕吐等症，而胡椒在临床上常应用于胃寒呕吐，腹痛泄泻，食欲不振，癫痫痰多等症。现代研究显示，荜茇和胡椒中的主要活性成分均为生物碱类，但目前还尚未有关于同时快速分离和测定荜茇和胡椒中胡椒碱、荜茇明宁碱、二氢荜茇明宁碱、胡椒新碱和墙草碱的相关报道。因此，亟需建立一种快速准确的分离测定方法。

发明内容

[0003] 本发明的目的是提供一种荜茇及胡椒中的五种生物碱的鉴定及含量同步测定方法。

[0004] 本发明提供了一种从荜茇和/或胡椒中分离生物碱的方法，包括如下步骤：

[0005] 将待测样品进行液相色谱-串联质谱检测，根据洗脱峰保留时间、Q1和Q3特征分离各个洗脱峰，即得到各个生物碱；

[0006] 所述Q1为分子离子峰[M+H]+的质量(m/z)，Q3为二级碎片子离子的质量(m/z)；

[0007] 所述待测样品为荜茇和/或胡椒；

[0008] 所述生物碱选自胡椒碱、荜茇明宁碱、二氢荜茇明宁碱、胡椒新碱和墙草碱中的至少一种；

[0009] 所述液相色谱检测的条件如下：所用色谱柱为Phenomenex Gemini C18反相色谱柱；

[0010] 洗脱液由流动相A和流动相B组成；其中，流动相A为质量百分浓度为0.1％的甲酸水溶液；流动相B为由甲酸和乙腈组成的混合液，甲酸的质量百分浓度为0.1％；

[0011] 洗脱方式为梯度洗脱，洗脱速度为0.55mL/min；

[0012] 所述梯度洗脱方式如下：

[0013] 第0分钟起至第0.49分钟末，洗脱液中流动相A与流动相B的体积比为98：2；

[0014] 第0.50分钟起至第3.00分钟末，洗脱液中流动相A与流动相B的体积比为98-2：2-98；

[0015] 第3.10分钟起至第3.99分钟末，洗脱液中流动相A与流动相B的体积比为2：98；

[0016] 第4.00分钟起至第4.00分钟末，洗脱液中流动相A与流动相B的体积比为98-2：2-98；

[0017] 第4.01分钟起至5.49分钟末，洗脱液中流动相A与流动相B的体积比为98：2；

[0018] 第5.50分钟起，停止洗脱；

[0019] 所述根据洗脱峰保留时间、Q1和Q3特征分离各个洗脱峰的方法如下：

[0020] 保留时间为3.78分钟、Q1为258.9和Q3为201.1的洗脱峰即为胡椒碱；

[0021] 保留时间为3.73分钟、Q1为273.9和Q3为201.1的洗脱峰即为荜茇明宁碱；

[0022] 保留时间为3.71分钟、Q1为276.1和Q3为134.9的洗脱峰即为二氢荜茇明宁碱；

[0023] 保留时间为3.76分钟、Q1为288.0和Q3为135.1的洗脱峰即为胡椒新碱；

[0024] 保留时间为3.93分钟、Q1为224.0和Q3为80.9的洗脱峰即为墙草碱。

[0025] 上述方法中，所述胡椒具体可为黑胡椒或白胡椒；

[0026] 所述液相色谱的检测条件中，色谱柱的长度具体可为50毫米，内径具体可为2.0毫米，C18的粒径具体可为5μm；

[0027] 进样量均为10μL；柱温为室温。

[0028] 所述质谱检测条件中，

[0029] 电喷雾电离源(ESI)的电离电压(Ion Spray)均为+5000V，离子源温度均为500℃-600℃，具体为550℃；

[0030] 雾化气(GS1)的压力均为40-60psi，具体为50psi；

[0031] 辅助加热气(GS2)的压力均为40-60psi，具体为50psi；

[0032] 气帘气CUR压力均为10-30psi，具体为20psi；

[0033] 每种生物碱对应的解簇电压、碰撞能、碰撞室出口电压(CXP)如下：

[0034] 胡椒碱：解簇电压为71eV，碰撞能为27eV，碰撞室出口电压(CXP)为10V；

[0035] 荜茇明宁碱：解簇电压为56eV，碰撞能为25eV，碰撞室出口电压(CXP)为10V；

[0036] 二氢荜茇明宁碱：解簇电压为66eV，碰撞能为29eV，碰撞室出口电压(CXP)为10V；

[0037] 墙草碱：解簇电压为96eV，碰撞能为31eV，碰撞室出口电压(CXP)为4V；

[0038] 胡椒新碱：解簇电压为111eV，碰撞能为39eV，碰撞室出口电压(CXP)为10V。

[0039] 另外，上述方法还包括如下步骤：

[0040] 在所述液相色谱-串联质谱检测步骤之前，将待测样品和甲醇以100mg：100mL的比例混匀后，用微孔滤膜过滤后，取滤液，向其中加入10倍于所述滤液体积的混合液a，涡旋混匀后，再向其中加入19倍于涡旋所得溶液体积的由等体积的甲醇和水组成的混合液涡旋混匀；

[0041] 其中，所述微孔滤膜的孔径具体为0.45μm；

[0042] 所述混合液a为特非那定的溶液；所述混合液a中，溶剂具体为甲醇和乙腈；所述特非那定的浓度具体为50ng/mL；

[0043] 所述混合液a具体由如下步骤获得：将特非那定以甲醇溶解，配制成浓度为1.00mg/mL的特非那定的甲醇溶液后，再加入等体积的甲醇和乙腈稀释至特非那定的浓度为50ng/mL，而得；

[0044] 所述涡旋混匀步骤中，涡旋的时间具体均为10s。

[0045] 本发明还提供了一种测定荜茇和/或胡椒中生物碱含量的方法，该方法包括如下步骤：

[0046] 1)将已知浓度的所述生物碱的对照品的混合物按照前述方法进行分离，并记录每种生物碱对应的峰面积；以每种生物碱的浓度值为自变量，以其对应的峰面积为因变量，得到一元线性回归方程；

[0047] 2)将待测样品按照前述方法进行分离，并记录每种生物碱对应的峰面积；

[0048] 3)将每种生物碱对应的峰面积代入步骤1)中一元线性回归方程，得到所述待测样品中各个生物碱的浓度；

[0049] 所述待测样品为荜茇和/或胡椒；

[0050] 所述生物碱选自胡椒碱、荜茇明宁碱、二氢荜茇明宁碱、胡椒新碱和墙草碱中的至少一种。

[0051] 上述方法中，所述胡椒具体可为黑胡椒或白胡椒；

[0052] 各种所述生物碱对应的一元线性回归方程如下：

[0053] 胡椒碱：y＝0.00353x-0.00046，自变量浓度范围为10-10000ng/mL；

[0054] 荜茇明宁碱：y＝0.00263x+0.00157，自变量浓度范围为10-10000ng/mL；

[0055] 二氢荜茇明宁碱：y＝0.00362x+0.00670，自变量浓度范围为10-10000ng/mL；

[0056] 胡椒新碱：y＝0.00327x-0.00184，自变量浓度范围为10-10000ng/mL；

[0057] 墙草碱：y＝0.00067x+0.00326，自变量浓度范围为10-10000ng/mL。

[0058] 另外，上述方法还包括如下步骤：

[0059] 在所述液相色谱-串联质谱检测步骤之前，将待测样品和甲醇以100mg：100mL的比例混匀后，用微孔滤膜过滤后，取滤液，向其中加入10倍于所述滤液体积的混合液a，涡旋混匀后，再向其中加入19倍于涡旋所得溶液体积的由等体积的甲醇和水组成的混合液涡旋混匀；

[0060] 其中，所述微孔滤膜的孔径具体为0.45μm；

[0061] 所述混合液a为特非那定的溶液；所述混合液a中，溶剂具体为甲醇和乙腈；所述特非那定的浓度具体为50ng/mL；

[0062] 所述混合液a具体由如下步骤获得：将特非那定以甲醇溶解，配制成浓度为1.00mg/mL的特非那定的甲醇溶液后，再加入等体积的甲醇和乙腈稀释至特非那定的浓度为50ng/mL，而得；

[0063] 所述涡旋混匀步骤中，涡旋的时间具体均为10s。

[0064] 本发明应用高效液相串联离子阱色谱(HPLC-ESI-IT-MSn)法对5种生物碱的结构进行了鉴定，并且首次建立了一种快速、准确的UFLC-ESI-MS/MS法同时测定荜茇与胡椒中胡椒碱、荜茇明宁碱、二氢荜茇明宁碱、胡椒新碱、墙草碱5种生物碱类成分的含2
量。5种生物碱的线性相关系数R>0.955，最低检测限为0.02-0.03ng/mL，最低定量限为
0.05-0.10ng/mL。5种生物碱日内精密度RSD值小于9.30％，日间精密度小于9.55％。5种生物碱的稳定性(RSD<2.53％)、重复性(RSD<2.58％)、加样回收率(90.0-103.5％)均符合要求。方法学结果表明该方法具有良好的适用性。含量测定结果表明，荜茇与胡椒中均含有这5种生物碱类成分，荜茇总生物碱中这5种生物碱成分的含量明显地高于荜茇和胡椒。荜茇药材中胡椒碱含量低于胡椒，但荜茇明宁碱、二氢荜茇明宁碱、胡椒新碱的含量均高于胡椒。

附图说明

[0065] 图1为UFLC-MS/MS测定5种生物碱与内标特非那定的二级全扫描质谱图，其中，A：胡椒碱(Piperine)；B：荜茇明宁碱(Piperlonguminine)；C：二氢荜茇明宁碱(Dihydropiperlonguminine)；D：墙草碱(Pellitorine)；E：胡椒新碱(Piperanine)；F：特非那定(内标)；

[0066] 图2为LC-ESI-MS/MS法测定5种生物碱的代表性色谱图，其中，A：空白溶剂；B：标准溶液(各化合物浓度均为10ng/mL)；C：荜茇总生物碱(PLA200811)；D:荜茇药材(PL201105AG)；E:胡椒(WP201204AG)。

具体实施方式

[0067] 下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。

[0068] 作为对照品的胡椒碱、荜茇明宁碱、二氢荜茇明宁碱、胡椒新碱、墙草碱的制备方法如下：

[0069] 将荜茇总生物碱43g，用等体积的CHCl3和CH3OH的混合液进行溶解，用100-200目硅胶在50℃水浴条件下拌样，将拌样后的样品干法上样，经硅胶柱色谱分离。以二氯甲烷-甲醇(v:v＝10:0～4:6)为流动相进行梯度洗脱。根据薄层色谱检识情况，将洗脱液合并为Fr.1～13部分，回收溶剂。将Fr.2～7部分分别溶于适量的甲醇，超声溶解，过0.42μm的微孔滤膜后，采用反相硅胶柱层析的方法进行分离。RP-C18硅胶色谱柱经甲醇-水(v:v＝50:50)500mL平衡，湿法加样，以甲醇-水(v:v＝50:50～55:45～60:40～65:35)为流动相梯度洗脱，按每份250mL接收洗脱流份，收集各浓度梯度洗脱液，得到流份Fr.1a～40a。根据薄层色谱检识情况，对Fr.10a、Fr.16a～17a、Fr.18a～19a、Fr.20a～
21a、Fr.22a～25a和Fr.31a～32a部位进行减压回收溶剂后，采用半制备高效液相色谱法、制备薄层色谱法、重结晶等手段进一步分离纯化。Fr.18a～19a部位采用半制备HPLC的-1
方法进行分离纯化，以水-甲醇：35：65为流动相，流速：2mL·min ，检测波长：275nm，柱温：
25℃，进样量：200μL。多次进样，收集洗脱液，减压回收溶剂后，得到荜茇明宁碱(130mg)。
Fr.22a～25a部位通过结晶与重结晶手段得到胡椒碱(7000mg)。分别将正相硅胶柱层析Fr.1部分、反相硅胶柱层析Fr.10a、Fr.16～17a、Fr.20a～21a和Fr.31a～32a部分采用制备薄层色谱法分离纯化。将样品用少量甲醇溶解后，在制备型硅胶G薄层板上条状点样，Fr.1部位用环乙烷:乙酸乙酯(v:v＝3:1)溶剂系统上行展开，Fr.10a部位用环乙烷:乙酸乙酯:甲酸(v:v＝3:2:0.05)溶剂系统上行展开、Fr.16a～17a和Fr.20a～21a用环乙烷:乙酸乙酯(v:v＝3:2)溶剂系统上行展开，Fr.31a～32a部位用环乙烷:乙酸乙酯(v:v＝2.5:1)溶剂系统上行展开，在波长254nm、365nm的紫外灯下观察，刮下相同Rf值的荧光带，收集刮下的硅胶粉，装柱，用甲醇冲洗完全，收集洗脱液，减压浓缩后，分别得到纯化的二氢荜茇明宁碱(76mg)、胡椒新碱(200mg)和墙草碱(120mg)。

[0070] 对照品结构鉴定采用Thermo LTQ XL Orbitrap液质联用仪，利用高效液相串联离子阱质谱，对5种生物碱的1级和2级碎片进行了分析，具体条件如下：

[0071] 采用DIONEX UItiMATE3000液相色谱仪(美国戴安公司)进行梯度洗脱，色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18反相色谱柱(150mm*2.1mm，5μm)；

[0072] 洗脱液由流动相A和流动相B组成；其中，流动相A为质量百分浓度为0.25％的甲酸水溶液；流动相B为乙腈；

[0073] 梯度洗脱的条件如下：

[0074] 第0分钟起至第4分钟末，洗脱液中流动相A与流动相B的体积比为85：15；

[0075] 第5分钟起至第19分钟末，洗脱液中流动相A与流动相B的体积比为85-60：15-40；

[0076] 第20分钟起至第29分钟末，洗脱液中流动相A与流动相B的体积比为60-35：40-45；

[0077] 第30分钟起至第39分钟末，洗脱液中流动相A与流动相B的体积比为55-40：45-60；

[0078] 第40分钟起至第49分钟末，洗脱液中流动相A与流动相B的体积比为30-10：60-90；

[0079] 第50分钟起至第64分钟末，洗脱液中流动相A与流动相B的体积比为10：90；

[0080] 洗脱速度为0.3mL/min；柱温为40℃；进样体积为20μL。

[0081] 质谱检测采用Thermo LTQ XL Orbitrap液质联用仪(美国赛默飞世尔科技公司)，ESI电离源，正离子扫描模式。电喷雾电压为4500V；加热毛细管温度为375℃；毛细管电压40V；鞘气、辅助气、吹扫气均为氮气，压力分别为17arb、3arb、0arb。

[0082] 所得结果见图1和表1；

[0083] 表1HPLC-ESI-IT-MS/MS检测5种生物碱对照品结构鉴定结果及其一级、二级质谱数据

[0084]

[0085] 由上可知，所确定的生物碱的结构无误。

[0086] 另外，制备上述作为对照品的胡椒碱、荜茇明宁碱、二氢荜茇明宁碱、胡椒新碱、墙草碱时，所用作为原料的荜茇总生物碱按照如下方法制得：

[0087] 称取干燥粉碎的荜茇果穗3kg，加入质量百分浓度为85％的乙醇水溶液15L加热回流提取，提取液过滤后合并滤液，回收乙醇得到荜茇提取物。荜茇提取物溶于水后经大孔树脂采用0％、20％、40％、60％和85％的乙醇水溶液梯度洗脱，将60％乙醇洗脱流份合并后回收乙醇，减压干燥得到荜茇总生物碱有效部位(PLA)，紫外分光光度法测定其总生物碱质量分数为64.43％。

[0088] 不同批次的荜茇、黑胡椒、白胡椒购自于安国药材市场、同仁堂、四方饮品厂、广西省药材市场，具体批号及来源见表2。

[0089] 表2不同批次样品的来源列表

[0090]

[0091] 其中，荜茇总生物碱-1由荜茇-1制得，荜茇总生物碱-2由荜茇-2制得，荜茇总生物碱-3由荜茇-3制得；

[0092] 特非那定购自中国药品生物制品检定所，批号：100292-200201；

[0093] 甲醇购自美国Fisher公司；

[0094] 乙腈购自美国Fisher公司；甲醇、乙腈为色谱纯。

[0095] 涡旋所用设备为XH-C旋涡混合器，购自金坛市诺艺实验仪器厂；

[0096] 超声清洗所用设备为舒美KQ-500VDE数控双频超声清洗器，购自昆山市超声仪器有限公司。

[0097] 实施例1、荜茇及胡椒中生物碱的分离

[0098] 一、对照品溶液的制备

[0099] a、精密称取作为对照品的胡椒碱、荜茇明宁碱、二氢荜茇明宁碱、胡椒新碱、墙草碱，经DMSO溶解后，分别配制为1mg/mL的对照品储备液。分别精密量取上述对照品储备液各10μL置于同一个1.5mL EP管中，再加甲醇稀释至每种生物碱的浓度均为10.0μg/mL的混合对照品储备液。

[0100] b、取上述混合对照品储备液，以甲醇进行系列稀释，配制成同时含有5种生物碱浓 度 为 10.0μg/mL、5.0μg/mL、2.0μg/mL、1.00μg/mL、0.5μg/mL、0.2μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.02μg/mL、0.01μg/mL的标准系列溶液。

[0101] c、精密称取特非那定对照品适量，以甲醇溶解并稀释，配制成浓度为1.00mg/mL的贮备液。临用时加等体积的甲醇和乙腈稀释成浓度为50ng/mL的工作溶液。

[0102] 二、供试品溶液的制备

[0103] 分别精密称取表2中所用荜茇-1100mg置于100mL容量瓶中，加甲醇定容，超声10min，甲醇补足至刻度，0.45μm微孔滤膜过滤，即得原始供试品溶液。测定前稀释10倍至适宜浓度，待测。

[0104] 测定前取20μL上述供试品溶液，准确加入200μL特非那定甲醇的浓度为50ng/mL的由等体积的特非那定甲醇和乙腈组成的混合液，涡旋混合10s；再取10μL涡旋所得溶液，向其中加入190μL由等体积的甲醇和水组成的混合液，涡旋混合10s，即得。

[0105] 三、生物碱的分离

[0106] 将供试品溶液采用岛津LC-20A液相色谱系统(购自日本岛津公司，包含LC-20AD二元泵、CTO-20A柱温箱、SIL-20AC进样器)和API4000Q trap液相质谱联用系统(购自美国应用生物系统公司)进行液相色谱-串联质谱检测。

[0107] 其中，液相色谱检测的具体条件如下：

[0108] 色谱柱为Phenomenex Gemini C18反相色谱柱(50mm*2.00mm，C18的粒径为5μm)；

[0109] 洗脱液由流动相A和流动相B组成；其中，流动相A为质量百分浓度为0.1％的甲酸水溶液；流动相B为由甲酸和乙腈组成的混合液，甲酸的质量百分浓度为0.1％；

[0110] 洗脱方式为梯度洗脱，洗脱速度为0.55mL/min；

[0111] 所述梯度洗脱方式如下：

[0112] 第0分钟起至第0.49分钟末，洗脱液中流动相A与流动相B的体积比为98：2；

[0113] 第0.50分钟起至第3.00分钟末，洗脱液中流动相A与流动相B的体积比为98-2：2-98；

[0114] 第3.10分钟起至第3.99分钟末，洗脱液中流动相A与流动相B的体积比为2：98；

[0115] 第4.00分钟起至第4.00分钟末，洗脱液中流动相A与流动相B的体积比为98-2：2-98；

[0116] 第4.01分钟起至5.49分钟末，洗脱液中流动相A与流动相B的体积比为98：2；

[0117] 第5.50分钟起，停止洗脱；

[0118] 洗脱液的流速为0.55mL/min；柱温为室温；进样体积均为10μL。

[0119] 质谱检测的具体条件如表2所示，实验采用ESI电离源，正离子扫描，MRM检测模式。

[0120] 每种生物碱对应的解簇电压、碰撞能、碰撞室出口电压(CXP)亦如表3所示；

[0121] 表3HPLC-ESI-MS/MS法检测5种生物碱所用质谱参数

[0122]

[0123] 故保留时间为3.78分钟、Q1为258.9和Q3为201.1的洗脱峰即为胡椒碱；

[0124] 保留时间为3.73分钟、Q1为273.9和Q3为201.1的洗脱峰即为荜茇明宁碱；

[0125] 保留时间为3.71分钟、Q1为276.1和Q3为134.9的洗脱峰即为二氢荜茇明宁碱；

[0126] 保留时间为3.76分钟、Q1为288.0和Q3为135.1的洗脱峰即为胡椒新碱；

[0127] 保留时间为3.93分钟、Q1为224.0和Q3为80.9的洗脱峰即为墙草碱。

[0128] 实施例2、方法学考察及生物碱含量的测定

[0129] 一、对照品溶液和供试品溶液的制备

[0130] 按照实施例1的步骤制备对照品溶液；

[0131] 按照实施例1的步骤制备供试品溶液，仅将实施例1二中荜茇-1替换为表1中所列其他批号的样品，并针对不同批号样品中总生物碱含量的不同，将样品稀释至生物碱含量的线性范围10-10000ng/mL内，作为供试品溶液，待测。

[0132] 二、方法学考察

[0133] 方法学部分包含了对方法的选择性、线性与范围、最低检测限和最低定量限、精密度、稳定性、重复性，加样回收率的考察。

[0134] 1选择性

[0135] 依次取空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液，按照实施例1中的液相色谱和质谱检测条件分别进样测定，记录所得色谱图，对比各色谱图，分析各成分间是否存在干扰。

[0136] 方法的选择性经API4000Q trap液相质谱联用系统测定，结果显示基质中的共存成分均不干扰5种生物碱的测定，并且5种生物碱彼此之间互不干扰，证明方法的选择性良好。所得色谱图见图2。

[0137] 2线性考察

[0138] 分别以每种生物碱与内标峰面积的比值对其浓度作线性回归，权重因子为1/X2，得到相应的一元线性回归方程，所得一元线性回归方程如表4所示：

[0139] 经测定，5种生物碱成分回归方程的线性系数R2大于0.995，自变量浓度的线性范围均为10-10000ng/mL。

[0140] 3最低检测限和最低定量限

[0141] 将所得对照品溶液按照实施例1中的液相色谱和质谱检测条件分别进样测定各对照品的最低检测限和最低定量限。

[0142] 以峰响应值约为基线噪音的10倍(信噪比的10倍)时的进样浓度为定量限，以峰响应值约为基线噪音的3倍(信噪比的3倍)时的进样浓度为检测限。

[0143] 所得结果为：胡椒碱、荜茇明宁碱、二氢荜茇明宁碱、墙草碱和胡椒新碱的最低检测限和最低定量限分别为0.02-0.06ng/mL、0.03-0.10ng/mL、0.02-0.05ng/mL、0.03-0.10ng/mL和0.02-0.06ng/mL。

[0144] 4日内、日间精密度

[0145] 按照实施例1的步骤制备对照品溶液及供试品溶液，仅将一b中混合对照品溶液替换为低、中、高三个浓度水平，也即20、500、8000ng/mL，作为对照品溶液，再按照实施例1中的液相色谱和质谱检测条件，分别在同一天和连续三天进样测定，记录为日内、日间精密度。

[0146] 所得结果为：胡椒碱、荜茇明宁碱、二氢荜茇明宁碱、墙草碱和胡椒新碱的日内精密度均低于9.30％，日间精密度均低于9.55％。

[0147] 5稳定性

[0148] 将实施例1二中荜茇-1替换为表1中所列三个批号的荜茇总生物碱样品，并精密称取适量，稀释10倍至适宜浓度，作为供试品溶液，制得后即避光放置在室温条件下，分别于第0、2、5、12、24小时取样测定，记录色谱图。

[0149] 在避光条件下的不同时间，测得样品中5种化合物含量的RSD值均小于2.53％，表明胡椒碱、荜茇明宁碱、二氢荜茇明宁碱、墙草碱和胡椒新碱在室温条件下避光放置24小时内稳定。

[0150] 6重复性

[0151] 精密称取同一批次6份荜茇总生物碱样品，分别按实施例1的方法制备供试品溶液并测定其中5种生物碱的含量，作为重复性考察结果。

[0152] 所得结果为，5种成分含量的RSD值低于2.58％。

[0153] 7加样回收率

[0154] 分别精密称取含量已知的荜茇总生物碱-1共9份，精密称定，按实施例1的方法制备供试品溶液后，精密量取供试品溶液0.1mL，分别置于100mL容量瓶中，分别加入低、中、高三种浓度水平(20,500,8000ng/mL)的5种生物碱的混合对照品溶液适量，再以甲醇稀释至体积。每个浓度水平3份，然后进样检测，计算5种生物碱的加样回收率。

[0155] 所得结果为，5种生物碱的回收率均在90.0-103.5％之间。

[0156] 上述方法学考察详细结果见表4。

[0157] 表4HPLC-ESI-MS/MS法检测5种生物碱含量的方法学考察结果

[0158]

[0159] 由表4可知，该方法具有良好的重复性及精密度。

[0160] 三、采用液相串联三重四级杆质谱进行生物碱含量的测定(均以特非那定作为内标物)

[0161] 1)按照实施例1的步骤，仅将荜茇-1替换为表1所列其他批号的样品，从而将每个批次样品中所含5种生物碱进行了分离，其中：

[0162] 保留时间为3.78分钟、Q1为258.9和Q3为201.1的洗脱峰即为胡椒碱；

[0163] 保留时间为3.73分钟、Q1为273.9和Q3为201.1的洗脱峰即为荜茇明宁碱；

[0164] 保留时间为3.71分钟、Q1为276.1和Q3为134.9的洗脱峰即为二氢荜茇明宁碱；

[0165] 保留时间为3.76分钟、Q1为288.0和Q3为135.1的洗脱峰即为胡椒新碱；

[0166] 保留时间为3.93分钟、Q1为224.0和Q3为80.9的洗脱峰即为墙草碱；

[0167] 同时记录每个批次的样品中每种生物碱对应的峰面积，再分别将每种生物碱对应的峰面积代入表4中的一元线性回归方程，从而得到每个批次样品中各个生物碱的浓度，也即每个批次样品中生物碱的含量，如表5所示。

[0168] 表5不同批次样品中5种生物碱含量的测定结果

[0169]

[0170] 由表5可知，5种生物碱在所列各种不同批次的荜茇及胡椒中均可以被检测到。

[0171] 荜茇药材中胡椒碱含量低于胡椒(P<0.05)，但荜茇明宁碱、二氢荜茇明宁碱、胡椒新碱的含量均高于胡椒(P<0.05)。

[0172] 另外，由于荜茇总生物碱样品为富集生物碱类成分的荜茇提取物，因此所含5种生物碱的含量均远高于荜茇及胡椒药材样品。

[0173] 由上可知，本发明建立了一种快速、准确的UFLC-ESI-MS/MS法同时测定荜茇与胡椒中胡椒碱、荜茇明宁碱、二氢荜茇明宁碱、胡椒新碱、墙草碱5种生物碱类成分的含量。方法学考察结果表明利用该方法所测得的数据准确、可靠。样品测定结果表明，荜茇药材中胡椒碱含量低于胡椒，但荜茇明宁碱、二氢荜茇明宁碱、胡椒新碱的含量均高于胡椒。此方法可用于荜茇及胡椒的全面质量控制。