一种荧光分子探针及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种荧光分子探针及其制备方法和应用。所述荧光分子探针包括亲水多肽以及连接于所述亲水多肽同一端的疏水烷基链和受限发光基团。本发明的荧光分子探针中，亲水多肽能够提高荧光分子探针在水溶液中的溶解性和稳定性，疏水烷基链能够嵌入细胞膜，受限发光基团只在受限条件下发射荧光。该荧光分子探针稳定性强、特异性好，因此是一种良好的可用于细胞膜标记的荧光分子探针，可应用于生物或医学研究中。本发明所述荧光分子探针的制备方法，简单易行，不涉及复杂的操作和苛刻条件，并且成本较低，光学稳定性好。

权利要求

1.一种荧光分子探针，包括亲水多肽以及连接于所述亲水多肽同一端的疏水烷基链和受限发光基团；

所述疏水烷基链和受限发光基团均通过酰胺键与所述亲水多肽共价连接；

所述亲水多肽的N-端氨基酸的侧链R基上具有氨基基团，所述氨基基团与所述疏水烷基链形成酰胺键共价连接；所述亲水多肽的N-端氨基酸的α氨基与所述受限发光基团形成酰胺键共价连接。

2.根据权利要求1所述的荧光分子探针，其特征在于，所述亲水多肽的N-端氨基酸为赖氨酸，所述赖氨酸的侧链氨基与所述疏水烷基链形成酰胺键共价连接；所述赖氨酸的α氨基与所述受限发光基团形成酰胺键共价连接。

3.根据权利要求1所述的荧光分子探针，其特征在于，所述疏水烷基链的碳链含有

8-20个碳原子。

4.根据权利要求1所述的荧光分子探针，其特征在于，所述疏水烷基链的碳链含有

12-20个碳原子。

5.根据权利要求1所述的荧光分子探针，其特征在于，所述疏水烷基链为棕榈酸、油酸或硬脂酸。

6.根据权利要求1所述的荧光分子探针，其特征在于，所述亲水多肽带有正电荷。

7.根据权利要求1所述的荧光分子探针，其特征在于，所述亲水多肽为以带正电荷的氨基酸为主组成的多肽。

8.根据权利要求1所述的荧光分子探针，其特征在于，所述亲水多肽为含有精氨酸的多肽。

9.根据权利要求1所述的荧光分子探针，其特征在于，所述受限发光基团为受限诱导发光分子。

10.根据权利要求1所述的荧光分子探针，其特征在于，所述受限发光基团为四苯基乙烯分子或硅杂环戊二烯。

11.一种制备权利要求1-10任一项所述的荧光分子探针的方法，包括：将疏水烷基链和受限发光基团与亲水多肽的同一端连接形成所述荧光分子探针。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法包括：在催化剂的存在下，分别使带有羧基的疏水烷基链和受限发光基团与亲水多肽的氨基接触，形成酰胺键共价连接，得到所述荧光分子探针。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述催化剂为2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和N,N-二异丙基乙胺。

14.如权利要求1-10任一项所述的荧光分子探针在细胞膜标记中的应用。

说明书

一种荧光分子探针及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及荧光分子探针领域，尤其涉及一种用于细胞膜标记的荧光分子探针及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 荧光分子探针是建立在光谱化学和光学波导与测量技术基础上，选择性的将分析对象的化学和结构信息连续转变为分析仪器易测量的荧光信号的分子测量装置。荧光分子探针受到周围环境的影响，在不同条件下表现不同荧光特性。当处于某一特定环境中时，荧光分子探针荧光特性发生变化，如荧光的从无到有，或是激发波长、发射波长的改变，从而使人们获知周围环境的特征或者环境中存在的某种特定信息。荧光分子探针具有灵敏度高、选择性好、使用方便、成本低、不需预处理、不受外界电磁场影响、远距离发光等诸多优点。荧光分子探针通常由识别基团和报告基团组成，前者决定了探针分子的选择性和特异性，后者则决定了识别的灵敏度。

[0003] 在生物医学研究中，人们常常需要标记细胞膜以观察细胞的形态和大小，或者观察特定蛋白、囊泡与细胞膜的位置关系。然而现有的细胞膜分子探针具有特异性差、易光漂白等缺点，限制了其应用，无法满足科学研究的需求。

发明内容

[0004] 针对现有技术的不足，本发明提供一种用于细胞膜标记的荧光分子探针，其对细胞膜具有特异性标记能力，与细胞膜结合后发光基团有荧光，显示细胞膜位置，因此是一种能够用于细胞膜标记的荧光分子探针。本发明还提供所述荧光分子探针的制备方法和应用，其制备方法简单易行，不涉及复杂的操作和 苛刻条件，并且成本较低，光学稳定性好。

[0005] 为实现本发明的目的，本发明提供以下技术方案：

[0006] 在第一方面，本发明提供一种荧光分子探针，包括亲水多肽以及连接于所述亲水多肽同一端的疏水烷基链和受限发光基团。

[0007] 本发明的荧光分子探针中，所述疏水烷基链能够嵌入细胞膜并导致发光基团受限，在激光照射下发射荧光，实现对细胞膜的特异性标记。本发明的荧光分子探针中，亲水多肽能够提高探针在水溶液中的稳定性和靶向性，疏水烷基链能够嵌入细胞膜，发光基团只在受限条件下发射荧光，因此是一种良好的可用于细胞膜标记的荧光分子探针。

[0008] 本发明中，所述疏水烷基链和受限发光基团与亲水多肽之间的共价连接可以是任意稳定的共价键，只要能够实现三者的连接即可，比如酰胺键、酯键或醚键等。当然，也包括未来开发出的共价键连接类型。

[0009] 作为本发明的优选技术方案，所述疏水烷基链和受限发光基团均通过酰胺键与所述亲水多肽共价连接。

[0010] 已经证明，采用酰胺键连接能够实现疏水烷基链和受限发光基团与亲水多肽的高效、稳定连接，两个酰胺键连接都是非常专一和稳定的，且对三部分功能不会产生干扰。

[0011] 作为本发明的优选技术方案，所述亲水多肽的N-端氨基酸的侧链R基上具有氨基基团，所述氨基基团与所述疏水烷基链形成酰胺键共价连接；所述亲水多肽的N-端氨基酸的α氨基与所述受限发光基团形成酰胺键共价连接。所述亲水多肽的N-端氨基酸比如赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺等。

[0012] 作为本发明的优选技术方案，所述亲水多肽的N-端氨基酸为赖氨酸，所述赖氨酸的侧链氨基与所述疏水烷基链形成酰胺键共价连接；所述赖氨酸的α氨 基与所述受限发光基团形成酰胺键共价连接。

[0013] 作为本发明的优选技术方案，所述疏水烷基链的碳链含有8-20个碳原子，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子，优选为12-20个碳原子，更优选为棕榈酸、油酸或硬脂酸。在上述范围内，疏水烷基链嵌入细胞膜的能力较强，且得到的分子探针稳定性良好。

[0014] 作为本发明的优选技术方案，所述亲水多肽带有正电荷，优选为以带正电荷的氨基酸为主组成的多肽，更优选为含有精氨酸的多肽。除精氨酸以外还可以含有赖氨酸或组氨酸等。上述氨基酸组成的带正电荷的亲水多肽能够在提高荧光分子探针稳定性的同时促进其与细胞相互接触，从而提高特异性。

[0015] 作为本发明的优选技术方案，所述受限发光基团为受限诱导发光分子，优选为四苯基乙烯分子或硅杂环戊二烯。上述受限诱导发光分子具有分子转动受限发光特性，且具有荧光稳定不易淬灭、发光效率高等优势。

[0016] 在第二方面，本发明提供一种制备第一方面所述的荧光分子探针的方法，包括：将疏水烷基链和受限发光基团与亲水多肽的同一端连接形成所述荧光分子探针。

[0017] 作为本发明的优选技术方案，所述方法包括：在催化剂的存在下，分别使带有羧基的疏水烷基链和受限发光基团与亲水多肽的氨基接触，形成酰胺键共价连接，得到所述荧光分子探针。

[0018] 优选地，所述催化剂为2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和N,N-二异丙基乙胺。

[0019] 在本发明的方法中，亲水多肽、疏水烷基链和受限发光基团的特性和选择如第一方面所述，在此不再赘述。

[0020] 在第三方面，本发明提供如第一方面所述的荧光分子探针在细胞膜标记中 的应用。

[0021] 相比现有技术，本发明的有益效果为：本发明的荧光分子探针中，亲水多肽能够提高荧光分子探针在水溶液中的溶解性和稳定性，疏水烷基链能够嵌入细胞膜，受限发光基团只在受限条件下发射荧光。该荧光分子探针稳定性强、特异性好，因此是一种良好的可用于细胞膜标记的荧光分子探针，可应用于生物或医学研究中。本发明所述荧光分子探针的制备方法，简单易行，不涉及复杂的操作和苛刻条件，并且成本较低，光学稳定性好。

附图说明

[0022] 图1为本发明实施例1制备的荧光分子探针在50μM浓度下孵育细胞30min后对细胞膜的标记效果(单光子激光共聚焦显微镜拍摄)。

[0023] 图2为本发明实施例1制备的荧光分子探针在50μM浓度下孵育细胞30min后对细胞膜的标记效果(双光子激光共聚焦显微镜拍摄)。

具体实施方式

[0024] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。

[0025] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。

[0026] 实施例中所用材料的来源：Fmoc保护的氨基酸(Fmoc-amino acids)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(O-(7-Azabenzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronilum hexafluorophosphate，HATU)和N,N-二异 丙基乙 胺(diisopropylethylamine，DIEA)均购自北京博迈杰科技有限公司；棕榈酸(≥99％，palmitic acid)、油酸(≥99％，oleic acid)、 硬脂酸(≥99％，stearic acid)均购自Sigma-Aldrich(St Louis，美国)公司；羧基化的四苯基乙烯(TPE-COOH)(参考文献Chunqiu Zhang等 人,Imaging Intracellular Anti-Cancer Drug Delivery by Self-Assembly Micelles with Aggregation-Induced Emission(AIE Micelles).ACS Applied Materials&Interfaces.2014.9；6(7):5212-5220.)和硅杂环戊二烯(silole)(参考文献Silole-Containing Polyacetylenes.Synthesis,Thermal Stability,Light Emission,Nanodimensional Aggregation,and Restricted Intramolecular Rotation.Macromolecules,2003,36(4),pp1108–1117)为自己合成；所有化学试剂用之前均未经过其他处理，整个实验使用的超纯水采用密理博公司的Milli-Q三蒸水(18.2MΩ·cm，Millipore System Inc.)。

[0027] 实施例1

[0028] 本实施例以4个精氨酸组成的多肽(RRRR，R4，SEQ ID NO：1)作为亲水多肽、羧基化四苯基乙烯(TPE-COOH)作为受限发光基团、棕榈酸作为疏水烷基链为例，说明荧光分子探针的制备。将该荧光分子探针命名为TR4，下文中TR4均指该探针。其中精氨酸带正电，故R4多肽呈现正电性，对细胞具有亲和性。精氨酸后续连接一个赖氨酸N端和侧链端的两个氨基供连接TPE-COOH和棕榈酸使用。棕榈酸的羧基易于反应，而疏水烷基链可以嵌入细胞膜中，并固定整个荧光分子探针。TPE分子在自由状态下不发光，一旦探针结合于细胞膜，苯环转动受限，TPE发射荧光。其最优激发波长为330nm，发射波长为466nm。下式为合成的TR4的分子结构。

[0029]

[0030] 合成TR4的具体实验步骤如下：

[0031] 采用CLEAR Amide多肽合成树脂，利用Fmoc化学的固相肽合成方法，依次连接精氨酸，精氨酸，精氨酸，精氨酸，赖氨酸(Fmoc-Lys(MTT)-OH)。在3％的三氟乙酸条件下脱去赖氨酸(Fmoc-Lys(MTT)-OH)的侧链保护基MTT，采用缩合试剂HATU和DIEA将棕榈酸连接到赖氨酸的侧链。在20％的哌啶条件下脱出Fmoc基团，采用缩合试剂HATU和DIEA将TPE-COOH连接到赖氨酸的N末端。用三氟乙酸切割多肽，冷乙醚沉淀，收集TR4粗品之后高效液相色谱法纯化，冻干，得到最终产物探针。

[0032] 最后，对细胞膜进行标记成像，具体实验步骤如下：

[0033] 以本实施例制得的TR4在50μM浓度下孵育乳腺癌细胞MCF-730min，在单光子或双光子激光共聚焦显微镜下成像，通过观察TPE荧光确定细胞膜位置和形态，结果如图1和图2所示，图1和图2均显示沿着细胞膜的荧光信号。

[0034] 结果显示：TR4标记的细胞膜连续、完整，胞浆中没有出现TPE荧光，说明TR4只标记了细胞膜，具有良好的标记特异性。细胞形态良好，TR4本身和标记过程不会对细胞产生毒性，适用于活细胞标记。

[0035] 实施例2(改变氨基酸组成)

[0036] 本实施例与实施例1的差别在于将实施例1中的4个精氨酸改为2个精氨酸和2个赖氨酸(RKRK，SEQ ID NO：2)，制备得到以RKRK为亲水多肽的 荧光分子探针。

[0037] 以本实施例制得的荧光分子探针进行的细胞膜标记结果与实施例1的相似。

[0038] 实施例3(改变多肽长度)

[0039] 本实施例与实施例1的差别在于将实施例1中的4个精氨酸改为8个精氨酸，制备得到以RRRRRRRR，SEQ ID NO：3)为亲水多肽的荧光分子探针。

[0040] 以本实施例制得的荧光分子探针进行的细胞膜标记结果与实施例1的相似。

[0041] 实施例4(改变疏水烷基链长度)

[0042] 本实施例与实施例1的差别在于将实施例1中的棕榈酸改为油酸，制备得到以油酸为疏水烷基链的荧光分子探针。

[0043] 以本实施例制得的荧光分子探针进行的细胞膜标记结果与实施例1的相似。

[0044] 实施例5(改变疏水烷基链长度)

[0045] 本实施例与实施例1的差别在于将实施例1中的棕榈酸改为硬脂酸，制备得到以硬脂酸为疏水烷基链的荧光分子探针。

[0046] 以本实施例制得的荧光分子探针进行的细胞膜标记结果与实施例1的相似。

[0047] 实施例6(改变受限发光基团)

[0048] 本实施例与实施例1的差别在于将实施例1中的四苯基乙烯改为硅杂环戊二烯，制备得到以硅杂环戊二烯为受限发光基团的荧光分子探针。

[0049] 以本实施例制得的荧光分子探针进行的细胞膜标记结果与实施例1的相似。

[0050] 申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。