骨靶向脂质体及其制备方法

摘要

骨靶向脂质体，由磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇脂质共轭物、具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物形成单层囊泡，在单层囊泡的内侧包覆有药物，其外侧连接有通过具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物的活性基团连接的骨靶向功能成分。本发明还公开了骨靶向脂质体的制备方法。

权利要求

1.一种骨靶向脂质体，其特征在于，包括药物、磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇脂质共轭物、具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物以及骨靶向功能成分；

所述磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇脂质共轭物和具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物形成单层囊泡，所述药物被包覆在所述单层囊泡的内侧，所述骨靶向功能成分连接在所述单层囊泡外侧并且所述骨靶向功能成分与所述具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物的活性基团连接；

所述磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇脂质共轭物、具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物和骨靶向功能成分的摩尔比为70～95：5～20：0.5～5：1～10：1～8；

所述骨靶向功能成分为(DSS)6；

所述药物为淫羊藿素；

所述 聚乙 二醇脂 质共 轭物 为C12 Ceremide-mPEG、C16 Ceremide-mPEG、C20 Ceremide-mPEG 12和DSPE-mPEG中的至少一种；

所述具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物为DSPE-PEG-Mal。

2.根据权利要求1所述的骨靶向脂质体，其特征在于，所述磷脂酰胆碱为大豆卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二油酰基卵磷脂和双饱和卵磷脂中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的骨靶向脂质体，其特征在于，所述骨靶向脂质体的直径范围为小于500nm。

4.根据权利要求3所述的骨靶向脂质体，其特征在于，所述骨靶向脂质体的直径为

50nm～200nm。

5.根据权利要求1所述的骨靶向脂质体，其特征在于，所述磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇脂质共轭物和具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物的总摩尔数与所述药物的摩尔数的比值为1：5～1：25。

6.一种骨靶向脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

制备包覆了药物的单层囊泡，所述单层囊泡由磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇脂质共轭物形成；其中，所述磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇脂质共轭物的摩尔比为70～95：5～

20：0.5～5；所述药物为淫羊藿素；所述聚乙二醇脂质共轭物为C12 Ceremide-mPEG、C16 Ceremide-mPEG、C20 Ceremide-mPEG 12和DSPE-mPEG中的至少一种；

制备具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物材质的胶束，并将所述胶束与骨靶向功能成分混合，使得所述骨靶向功能成分与所述具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物的活性基团连接，得到的复合胶束；其中，所述具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物和骨靶向功能成分的摩尔比为1～10：1～8，所述骨靶向功能成分为(DSS)6；所述具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物为DSPE-PEG-Mal；

将所述包覆了药物的单层囊泡与所述复合胶束混合，使得所述复合胶束嵌入到所述单层囊泡中，得到所述骨靶向脂质体；其中，所述磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇脂质共轭物、具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物和骨靶向功能成分的摩尔比为70～95：5～20：

0.5～5：1～10：1～8。

7.一种骨靶向脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

制备包覆了药物的单层囊泡，所述单层囊泡由磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇脂质共轭物和具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物形成；其中，所述磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇脂质共轭物和具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物的摩尔比为70～95：5～20：0.5～

5：1～10；所述药物为淫羊藿素；所述聚乙二醇脂质共轭物为C12 Ceremide-mPEG、C16 Ceremide-mPEG、C20 Ceremide-mPEG 12和DSPE-mPEG中的至少一种；所述具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物为DSPE-PEG-Mal；

将所述包覆了药物的单层囊泡与骨靶向功能成分混合，使得所述骨靶向功能成分与所述具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物的活性基团连接，得到所述骨靶向脂质体；其中，所述磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇脂质共轭物、具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物和骨靶向功能成分的摩尔比为70～95：5～20：0.5～5：1～10：1～8，所述骨靶向功能成分为(DSS)6。

说明书

骨靶向脂质体及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种骨靶向脂质体及其制备方法。

背景技术

[0002] 骨组织由于具有组织硬度大，渗透性差等特殊的生理结构，一般的药物很难有效的到达病变部位，使病变部位的药物浓度偏低，不能达到很好的治疗效果。通过提高给药剂量来提高浓度的方法，虽然在一定程度上能够提高药物在病变部位的浓度，但也会增加药物对其他组织的毒副作用。

[0003] 淫羊藿素是具有植物雌激素样作用的一种黄酮类化合物，是淫羊藿在体内的主要次级代谢产物，是一种有效的促进骨形成的化合物。最近的体外研究显示，淫羊藿素能够促进成骨细胞的增殖和分化，增强骨基质钙化功能，同时还能抑制破骨细胞的分化和骨吸收功能，降低破骨细胞的能动性。体内研究中，利用去卵巢诱导的骨质疏松的小鼠模型，发现淫羊藿素能够介导依赖性和非依赖性雌激素受体途径，对小鼠的骨骼和肌肉均具有保护作用。此外，淫羊藿素还能够降低了家免模型中甾体激素诱发的骨坏死的发病率，其机制为淫羊藿素抑制了血管内血栓的形成和血管外脂质的沉积。

[0004] 尽管淫羊藿素在体内具有很强的生物活性，然而由于淫羊藿素的难溶性的物理性质使得体内给药面临着严峻的挑战。通过口服和静脉给予淫羊藿素的家兔的药代动力学研究发现，逐渐加大口服的淫羊藿素剂量20,40and80mg/kg，相应的药代动力学参数Cmax和AUC0-∞也相应增大，然而其体内的生物利用率却明显下降，分别为17.29％，13.80％和分别为10.70％。静脉给予淫羊藿素20mg/kg，其AUC0-∞为2470ng·h/mL，而口服淫羊藿素剂量达80mg/kg的AUC0-∞仅为495.67ng·h/mL，静脉给药的AUC0-∞比口服给药大4倍，结果表明淫羊藿素口服不易吸收，静脉给药可能是可供选择的最优途径(Liu HP,Meng FH,Guo JF,Si DY,Zhu XW,Zhao YM(2010).Pharmacokinetics of icaritin in rats.Chinese Pharmaceutical Journal45(7),539-543.)。

[0005] 脂质体具有良好的生物相容性，已被广泛的用作药物载体，能够使包封的药物具有较好的稳定性，能够提高药物的稳定性，并在一定程度上可降低药物毒副作用。

[0006] 但是，一般的骨靶向脂质体在使用时不能提高骨表面的药物浓度。

发明内容

[0007] 基于此，提供一种在使用时能够提高骨表面的药物浓度的骨靶向脂质体及其制备方法。

[0008] 一种骨靶向脂质体，包括药物、磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇脂质共轭物、具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物以及骨靶向功能成分；

[0009] 所述磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇脂质共轭物和具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物形成单层囊泡，所述药物被包覆在所述单层囊泡的内侧，所述骨靶向功能成分连接在所述单层囊泡外侧并且所述骨靶向功能成分与所述具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物的活性基团连接；

[0010] 所述磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇脂质共轭物、具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物和骨靶向功能成分的摩尔比为70～95：5～20：0.5～5：1～10：1～8。

[0011] 在一个实施例中，所述骨靶向功能成分为阿伦膦酸盐、Asp8和(DSS)6中的至少一种。

[0012] 在一个实施例中，所述磷脂酰胆碱为大豆卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二油酰基卵磷脂和双饱和卵磷脂中的至少一种。

[0013] 在一个实 施例中，所述聚乙 二醇脂质 共轭物 为C12Ceremide-mPEG、C16Ceremide-mPEG、C20Ceremide-mPEG12和DSPE-mPEG中的至少一种。

[0014] 在一个实施例中，所述具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物为DSPE-PEG-Mal。

[0015] 在一个实施例中，所述骨靶向脂质体的直径范围为小于500nm。

[0016] 在一个实施例中，所述骨靶向脂质体的直径为50nm～200nm。

[0017] 在一个实施例中，所述磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇脂质共轭物和具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物的总摩尔数与所述药物的摩尔数的比值为1：5～1：25。

[0018] 一种骨靶向脂质体的制备方法，包括如下步骤：

[0019] 制备包覆了药物的单层囊泡，所述单层囊泡由磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇脂质共轭物形成；其中，所述磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇脂质共轭物的摩尔比为70～95：5～20：0.5～5；

[0020] 制备具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物材质的胶束，并将所述胶束与骨靶向功能成分混合，使得所述骨靶向功能成分与所述具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物的活性基团连接，得到的复合胶束；其中，所述具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物和骨靶向功能成分的摩尔比为1～10：1～8；

[0021] 将所述包覆了药物的单层囊泡与所述复合胶束混合，使得所述复合胶束嵌入到所述单层囊泡中，得到所述骨靶向脂质体；其中，所述磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇脂质共轭物、具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物和骨靶向功能成分的摩尔比为70～95：5～20：0.5～5：1～10：1～8。

[0022] 一种骨靶向脂质体的制备方法，包括如下步骤：

[0023] 制备包覆了药物的单层囊泡，所述单层囊泡由磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇脂质共轭物和具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物形成；其中，所述磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇脂质共轭物和具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物的摩尔比为70～95：5～20：0.5～5：1～10；

[0024] 将所述包覆了药物的单层囊泡与骨靶向功能成分混合，使得所述骨靶向功能成分与所述具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物的活性基团连接，得到所述骨靶向脂质体；其中，所述磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇脂质共轭物、具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物和骨靶向功能成分的摩尔比为70～95：5～20：0.5～5：1～10：1～8。

[0025] 这种骨靶向脂质体运输药物时，通过骨靶向功能成份的导向作用，能够将药物靶向转运至骨表面，起到提高骨表面的药物浓度的作用。

附图说明

[0026] 图1为骨靶向脂质体的结构示意图；

[0027] 图2为实施例1制备的骨靶向脂质体的整体形貌图；

[0028] 图3为实施例1制备的骨靶向脂质体的扫描电镜对比图；

[0029] 图4为实施例1制备的骨靶向脂质体的体外释放曲线对比图；

[0030] 图5为实施例1制备的骨靶向脂质体进行小鼠尾静脉注射后器官的荧光强度图。

具体实施方式

[0031] 以下通过附图和具体实施例对骨靶向脂质体及其制备方法做进一步说明。

[0032] 如图1所示的一实施方式的骨靶向脂质体，包括药物、磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇脂质共轭物、具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物以及骨靶向功能成分。

[0033] 磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇脂质共轭物和具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物形成单层囊泡，药物被包覆在单层囊泡的内侧，骨靶向功能成分连接在所述单层囊泡外侧，并且骨靶向功能成分与具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物的活性基团连接。

[0034] 一般而言，这种骨靶向脂质体的直径应当小于500nm。

[0035] 在本实施方式中，这种骨靶向脂质体的直径可以为50nm～200nm，从而有利于该骨靶向脂质体从血管渗漏到骨组织。

[0036] 磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇脂质共轭物、具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物和骨靶向功能成分的摩尔比为70～95：5～20：0.5～5：1～10：1～8。

[0037] 这种骨靶向脂质体运输药物时，通过骨靶向功能成份的导向作用，能够将药物靶向转运至骨表面，起到提高骨表面的药物浓度的作用。

[0038] 这种骨靶向脂质体在作为淫羊藿素的运输载体时，能够延长淫羊藿素在血液中的滞留时间，并且保持以恒定的速度释放淫羊藿素。通过骨靶向功能成份的导向作用，能够将淫羊藿素靶向转运至骨表面，起到提高骨表面的淫羊藿素浓度的作用。

[0039] 磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇脂质共轭物和具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物的总摩尔数与药物的摩尔数的比值可以为1：5～1：25。

[0040] 这种骨靶向脂质体的单层囊泡不仅可以包覆淫羊藿素，还可以根据需要包覆其他类型的骨靶向药物，从而起到提高药物在骨表面浓度的功能。

[0041] 骨靶向功能成分可以为阿伦膦酸盐、Asp8(8个天门冬氨酸重复序列)或(DSS)6(6个（天门冬氨酸-丝氨酸-丝氨酸）的重复序列)。

[0042] 磷脂酰胆碱可以为大豆卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二油酰基卵磷脂或者双饱和卵磷脂。

[0043] 聚乙二醇脂质共轭物可以为聚乙二醇修饰神经酰胺，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺衍生物，如：C12Ceremide-mPEG、C16Ceremide-mPEG、C20Ceremide-mPEG12或DSPE-mPEG。

[0044] 具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物可以为带有马来酰胺基团的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺衍生物（DSPE-PEG-Mal）。

[0045] 在一个优选的实施例中，这种骨靶向脂质体中还添加有冷冻保护剂，以便于长期冷冻储存。添加了冷冻保护剂的骨靶向脂质体在实用前只需要重新溶解，就可以形成颗粒均匀、包封良好的骨靶向脂质体溶液。

[0046] 冷冻保护剂可以为蔗糖、甘露醇、葡萄糖或海藻糖。磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇脂质共轭物和具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物的总摩尔数与冷冻保护剂的摩尔数的比值为2：1～10：1。

[0047] 在具体的使用过程中，这种骨靶向脂质体可以采用皮内注射、皮下注射或肌肉注射的方式送入体内。

[0048] 上述骨靶向脂质体可以通过多种方法制备，常见的如薄膜蒸发法、超声法、挤压法、高压匀浆法和浸渍法等。

[0049] 提供一实施方式的上述骨靶向脂质体的制备方法，包括如下步骤：

[0050] S110、制备包覆了药物的单层囊泡。

[0051] 单层囊泡由磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇脂质共轭物形成。其中，磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇脂质共轭物的摩尔比为70～95：5～20：0.5～5。

[0052] 磷脂酰胆碱可以为大豆卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二油酰基卵磷脂或者双饱和卵磷脂。

[0053] 聚 乙 二 醇 脂 质 共 轭 物 可 以 为 C12Ceremide-mPEG、C16Ceremide-mPEG、C20Ceremide-mPEG12或DSPE-mPEG。

[0054] 包覆了药物的单层囊泡的具体制备过程如下：

[0055] 将药物、磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇脂质共轭物溶解在体积比为1：1的甲醇和氯仿的混合液中，利用旋转真空干燥机，使得有机溶剂蒸发，得到脂质薄膜。

[0056] 使得到的脂质薄膜完全干燥后，将该脂质薄膜浸于PBS溶液中水化，接着水浴孵育，得到脂质悬浮液。

[0057] 以氮气加压，用挤压器（Lipex TMExtruder）对该脂质悬浮液进行挤压，使得脂质悬浮液依次通过孔径为200nm和100nm的滤膜，连续挤压多次后，得到包覆了药物的单层囊泡。通过将脂质悬浮液依次通过孔径为200nm和100nm的滤膜，使得得到的单层囊泡的直径为50nm～200nm。

[0058] S120、制备具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物材质的胶束，并将胶束与骨靶向功能成分混合，使得骨靶向功能成分与具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物的活性基团连接，得到的复合胶束。

[0059] 其中，具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物和骨靶向功能成分的摩尔比为1～10：1～8。

[0060] 具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物可以为DSPE-PEG-Mal。

[0061] 骨靶向功能成分可以为阿伦膦酸盐、Asp8或(DSS)6。

[0062] 复合胶束的具体制备过程如下：

[0063] 将具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物溶解在氯仿中，挥发除去溶剂，得到脂质膜。

[0064] 向得到的脂质膜中加入PBS后水化，形成具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物材质的胶束。

[0065] 将骨靶向功能成分的PBS溶液加入到具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物材质的胶束中，反应后骨靶向功能成分与具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物的活性基团连接，得到的复合胶束。

[0066] S120中还包括添加L-半胱氨酸，中和未反应的活性基团的操作。

[0067] S130、将S110得到的包覆了药物的单层囊泡与S120得到的复合胶束混合，使得复合胶束嵌入到单层囊泡中，得到骨靶向脂质体。

[0068] 其中，磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇脂质共轭物、具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物和骨靶向功能成分的摩尔比为70～95：5～20：0.5～5：1～10：1～8。

[0069] 将S110得到的包覆了药物的单层囊泡与S120得到的复合胶束混合，水浴并孵育。复合胶束在与单层囊泡混合之前，亲水部分（PEG与靶头）向外水相，亲脂部分（DSPE）向内。
当与单层囊泡混合后，复合胶束的脂质端与单层囊泡中磷脂双分子层具有相似性，所以复合胶束的DSPE部分插入脂质双分子层，而亲水PEG以及靶头部分向水相分布，分布在单层囊泡的表面。最终使得复合胶束嵌入到单层囊泡中，得到骨靶向脂质体。

[0070] 提供另一实施方式的上述骨靶向脂质体的制备方法，包括如下步骤：

[0071] S210、制备包覆了药物的单层囊泡。

[0072] 单层囊泡由磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇脂质共轭物和具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物形成。其中，磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇脂质共轭物和具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物的摩尔比为70～95：5～20：0.5～5：1～10。

[0073] 磷脂酰胆碱可以为大豆卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二油酰基卵磷脂或者双饱和卵磷脂。

[0074] 聚 乙 二 醇 脂 质 共 轭 物 可 以 为 C12Ceremide-mPEG、C16Ceremide-mPEG、C20Ceremide-mPEG12或DSPE-mPEG。

[0075] 具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物可以为DSPE-PEG-Mal。

[0076] S210中，包覆了药物的单层囊泡的具体制备过程如下：

[0077] 将药物、磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇脂质共轭物和具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物溶解在体积比为1：1的甲醇和氯仿的混合液中，利用旋转真空干燥机，使得有机溶剂蒸发，得到脂质薄膜。

[0078] 使得到的脂质薄膜完全干燥后，将该脂质薄膜浸于PBS溶液中水化，接着水浴孵育，得到脂质悬浮液。

[0079] 以氮气加压，用挤压器（Lipex TMExtruder）对该脂质悬浮液进行挤压，使得脂质悬浮液依次通过孔径为200nm和100nm的滤膜，连续挤压多次后，得到包覆了药物的单层囊泡。通过将脂质悬浮液依次通过孔径为200nm和100nm的滤膜，使得得到的单层囊泡的直径为50nm～200nm。

[0080] S220、将包覆了药物的单层囊泡与骨靶向功能成分混合，使得骨靶向功能成分与具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物的活性基团连接，得到骨靶向脂质体。

[0081] 其中，磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇脂质共轭物、具有活性基团的聚乙二醇脂质共轭物和骨靶向功能成分的摩尔比为70～95：5～20：0.5～5：1～10：1～8。

[0082] 骨靶向功能成分可以为阿伦膦酸盐、Asp8或(DSS)6。

[0083] S220中还包括得到骨靶向脂质体后，将该骨靶向脂质体通过琼脂糖凝胶CL-4B柱色谱，除去未与活性基团连接的骨靶向功能成分的操作。

[0084] 下面为具体实施例。

[0085] 实施例1

[0086] 用 圆 底 烧 瓶，将21umol 淫 羊 藿 素 和 325umol脂 质（由SPC、胆 固 醇、C16Ceremide-mPEG200按照摩尔比85：11：4组成）溶解于6ml的甲醇-氮仿混合液（1：1，V/V）中。调节温度为55℃，利用旋转真空干燥机，使圆底烧瓶中的有机溶剂挥发，得到脂质薄膜。随后将脂质薄膜置于真空干燥箱内过夜，使其干燥完全。接着把干燥完全的脂质薄膜浸于10mlPBS(10mM,pH7.4)中，55℃水浴孵育，得到脂质体悬浮液。以氮气加压，将得到的脂TM质体悬浮液用挤压器(Lipex Extruder,Northern Lipids Inc.,Vancouver,BC,Canada)挤压，使得脂质体悬浮液依次通过孔径为200nm和100nm的聚碳酸酯滤膜(Nuclepore Track-Etch Membrane)，连续挤压六次，得到包覆了淫羊藿素的单层囊泡。

[0087] 将50ul相对于总脂质2mol%的DSPE-PEG2000-Mal的氯仿溶液加入到1.5ml的试管中，挥发除去有机溶剂得到脂质膜。向得到的脂质膜中加入PBS后水化，形成DSPE-PEG2000-Mal材质的胶束。按照DSPE-PEG2000-Mal和(DSS)6的摩尔比为2：1，将含巯基的(DSS)6的PBS溶液加入DSPE-PEG2000-Mal材质的胶束，振荡4h使(DSS)6与DSPE-PEG2000-Mal反应形成DSPE-PEG2000-(DSS)6复合胶束。反应结束后加入L-半胱氨酸，使终浓度为1mM，于室温中孵育至少10min，用于中和未共轭结合的基团。

[0088] 将DSPE-PEG2000-(DSS)6复合胶束与包覆了淫羊藿素的单层囊泡混合，37℃水浴下孵育2h，使DSPE-PEG2000-(DSS)6以胶束形式嵌入单层囊泡内，得到骨靶向脂质体。

[0089] 将骨靶向脂质体的悬浮物与含有甘露醇的蒸馏水混合，甘露醇与脂质的摩尔比为5，在冷冻干燥机中干燥48h，得到冻干的骨靶向脂质体。冻干的骨靶向脂质体在使用之前水化，然后用0.22μm的无菌滤膜除菌即可。

[0090] 如图2所示实施例1制备的骨靶向脂质体的整体形貌图。图2A为冷冻干燥前的骨靶向脂质体的整体形貌图，图2B为冷冻干燥后长期放置的骨靶向脂质体整体形貌图，图2C为长期放置的骨靶向脂质体再水化后得到的骨靶向脂质体的整体形貌图。

[0091] 从图2B可以看出，长期放置后的冷冻干燥的骨靶向脂质体呈饼状。由图2A和图2C可以看出长期放置的骨靶向脂质体再水化后得到的骨靶向脂质体与冷冻干燥前相比无明显变化。

[0092] 由图2可以看出，冷冻干燥不会影响骨靶向脂质体的整体外观。

[0093] 图3为实施例1制备的骨靶向脂质体的扫描电镜对比图。图3A为图2A中的骨靶向脂质体的扫描电镜图，图3B为图2C中的骨靶向脂质体的扫描电镜图。

[0094] 图3A中的骨靶向脂质体为单层囊泡形状，图3B中水化后的骨靶向脂质体也为单层囊泡形状。

[0095] 对比图3A和图3B可以看出，冷冻干燥前后的骨靶向脂质体在电镜下的结构无明显变化。

[0096] 由图3可以看出，冷冻干燥不会影响骨靶向脂质体的结构。

[0097] 通过微调的透析孔膜法评价释放曲线，具体操作如下：在玻璃瓶中，将1mL实施例1制备的脂质体（大约含800ug淫羊藿素）溶入到50mL释放介质（含有10%乙醇的PBS(pH7.4)）中。12等分的释放介质分别置于预先处理好的透析袋里（12,000～14,000大分子量筛截），同时分别将透析袋浸于相同的玻璃瓶中。玻璃瓶置于恒温摇床上，37℃下以100±10rpm振荡。样品于预定的时间间隔（超过72h）回收，并加以相同体积的新鲜介质。通过超高效液相色谱系统检测淫羊藿素的浓度，得到淫羊藿素的体外释放曲线如图4所示。

[0098] 由图4可以看出，实施例1制备的骨靶向脂质体能够控制淫羊藿素的释放，其控制时间高达72h。同时，骨靶向分子的加入并没有影响淫羊藿素在脂质体中的释放。

[0099] 实施例2

[0100] 用圆底烧瓶，将21umol淫羊藿素和360umol脂质（由DOPC、Cholesterol、DSPE-mPEG2000和DSPE-PEG2000-Mal按照摩尔比75：18：3：4组成）溶解于6ml的甲醇-氮仿混合液（1：1，V/V）中。调节温度为55℃，利用旋转真空干燥机，使圆底烧瓶中的有机溶剂挥发，得脂质薄膜。随后将脂质薄膜置于真空干燥箱内干燥过夜。接着把干燥完全的脂质薄膜浸于10mlPBS(10mM,pH7.4)中水化，得到脂质体悬浮液。以氮气加压，将得到的脂质TM体悬浮液用Lipex Extruder挤压，使脂质体悬浮液依次通过孔径为200nm和100nm的聚碳酸酯滤膜，连续挤压六次，得到包覆了淫羊藿素的单层囊泡。

[0101] 然后将大约7umol具有巯基的(DSS)6加入单层囊泡中，室温振荡4h，得到骨靶向脂质体的悬液。得到的骨靶向脂质体的悬液通过琼脂糖凝胶CL-4B柱色谱法除去未共轭结合(DSS)6而纯化。

[0102] 实施例3

[0103] 用圆底烧瓶，将21umol淫羊藿素和325umol脂质（由SPC、胆固醇、C16Ceremide‐mPEG200按照摩尔比85：11：4组成）溶解于6ml的甲醇‐氮仿混合液（1：1，V/V）中。调节温度为55℃，利用旋转真空干燥机，使圆底烧瓶中的有机溶剂挥发，得到脂质薄膜。随后将脂质薄膜置于真空干燥箱内过夜，使其干燥完全。接着把干燥完全的脂质薄膜浸于10mlPBS(10mM,pH7.4)中，55℃水浴孵育，得到脂质体悬浮液。以氮气加压，将得到的脂质体TM
悬浮液用挤压器(Lipex Extruder,Northern Lipids Inc.,Vancouver,BC,Canada)挤压，使得脂质体悬浮液通过孔径为100nm～200nm的聚碳酸酯滤膜(Nuclepore Track‐Etch Membrane)，连续挤压六次，得到淫羊藿素脂质体。

[0104] 将由荧光标记的淫羊藿素脂质体和实施例1制备的骨靶向脂质体分别经尾静脉注射入8只6个月鼠龄的雌性小鼠体内(n=4，即每组四只小鼠)，剂量为1mg/kg。

[0105] 经过4h和24h后，分别将4只小鼠处死，取心，肝，脾，肺，肾，双侧股骨等主要器官。运用Xenogen IVIS显像系统检测各器官中的荧光强度，得到图5。

[0106] 图5中，蓝色表示荧光强度高，红色荧光强度低。荧光强度高表明该脂质体在该组织的分布较多，反之亦然。

[0107] 由图5可以看出，在尾静脉注射后4h，相对于小鼠其它器官，股骨中的荧光信号最强。在尾静脉注射后24h，依然可以在实施例1制备的骨靶向脂质体注射的小鼠的股骨处检测到荧光信号，但由芯片标记的淫羊藿素脂质体注射的小鼠的股骨处并未检测到荧光信号。

[0108] 由此可以说明，实施例1制备的骨靶向脂质体更易于靶向骨组织，同时延长了淫羊藿素在骨中的滞留时间。

[0109] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。