一株石油烃降解菌DL5-3及其应用

摘要

一株石油烃降解菌DL5-3及其应用，涉及环境石油污染生物处理。所述石油烃降解菌(Winogradskyella sp.)DL5-3，登记入册编号为CGMCC No.9012。所述石油烃降解菌(Winogradskyella sp.)DL5-3，在有石油类污染物存在的情况下，能够高效地降解石油烃污染物中的烷烃组分。以柴油、液态烷烃等烃类化合物为碳源和能源进行生长，用于含油废水、受石油类污染的水体和土壤的生物强化处理与修复。经实验证明，该菌能够利用石油∶柴油＝1∶1作为能源和碳源生长繁殖，该菌6天能将无机盐培养基中的5g/L的石油∶柴油(体积比)＝1∶1降解52.24％。

权利要求

1. 一株石油经降解菌Winogradskyella sp. DL5-3,已于2014年04月03日在中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，登记入册编号为CGMCC No. 9012。

2. 如权利要求1所述一株石油经降解菌Winogradskyella sp. DL5-3在降解石油经污 染物中的烷烃组分的应用。

3. 如权利要求1所述一株石油经降解菌Winogradskyella sp. DL5-3在含油废水、受石 油类污染的水体和土壤的生物强化处理与修复中的应用。

说明书

一株石油烃降解菌DL5-3及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及环境石油污染生物处理，尤其是涉及一株石油烃降解菌DL5-3及其应 用。

背景技术

[0002] 当前，海洋的污染正在日趋加剧，其中海洋的石油污染尤为严重（Head IM，JonesDM,F.Rff.Marinemicroorganismsmakeamealofoil.NatRev Microbiol. 2006, 4:173-182.)。目前，世界所需石油的2/3经海路运输，经常运行在航道上 的油轮大约有7000艘之多（李德生，罗群.石油一人类文明社会的血液[M]:清华大学出 版社，2002.)。大型油轮失事以后，其中的原油部分或全部流入海洋中，从而造成严重的海 洋石油污染。石油污染给海洋环境和海洋生态系统带来了严重的危害，直接或间接的影响 着人类的生存和可持续发展（龙绍桥.海上溢油行为与归宿数值模拟及其对环境的影响研 究[D]:中国海洋大学；2006.)。其主要表现在以下几个方面：1)影响海气系统间物质和能 量的交换。2)破坏海洋生态系统。3)制约人类社会和环境的可持续发展。

[0003] 目前，常用的海洋石油污染的治理方法主要有物理修复、化学修复和生物修复。 与化学、物理方法相比，生物修复对人和环境造成的影响小，且修复费用仅为传统物理、 化学修复的 30 % ~50 %(BraggJR,PrinceRC，HarnerEJetal.Effectivenessof BioremediationfortheExxon-ValdezOil-Spill.Nature. 1994, 368(6470):413-418.)〇 生物修复以其投入小，无二次污染的优势被视为最有前途的环境治理手段（Head IM,SwannellRP.Bioremediationofpetroleumhydrocarboncontaminantsin marinehabitats.CurrOpinBiotechnol. 1999, 10 (3):234-239；JuhaszAL,Naidu R.Bioremediationofhighmolecularweightpolycyclicaromatichydrocarbons:a reviewofthemicrobialdegradationofbenzo[a]pyrene.InternationalBiodeterio ration&Biodegradation. 2000, 45(1):57-88.) 〇

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一株石油经降解菌（Winogradskyellasp. )DL5_3。

[0005] 本发明的另一个目的是提供石油经降解菌（Winogradskyellasp. )DL5_3在处理 石油类污染物中的应用。

[0006] 所述石油经降解菌（Winogradskyellasp.)DL5-3已于2014年04月03日在中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，登记入册编号为：CGMCCNo. 9012。 所述石油经降解菌（Winogradskyellasp. )DL5_3来源于大连新港溢油事件发生地的表 层海水，经人工富集培养、分离纯化得到。该菌是革兰氏染色阴性的维诺格拉斯基氏菌属 (Winogradskyellasp.)的菌株DL5-3,生物学特性为非发酵型，专性需氧，菌体形态为无芽 孢杆菌，菌落呈圆形，橙黄色不透明，表面光滑湿润，边缘规则，无晕环，中央凸起，直径 1_。该菌的最适生长条件为：pH= 7. 0~8. 5,温度25~28°C。

[0007] 所述石油经降解菌（Winogradskyellasp. )DL5_3,在有石油类污染物存在的情况 下，能够高效地降解石油烃污染物中的烷烃组分。

[0008] 所述石油经降解菌（Winogradskyellasp. )DL5_3,以柴油、液态烷烃等经类化合 物为碳源和能源进行生长，用于含油废水、受石油类污染的水体和土壤的生物强化处理与 修复。

[0009] 经实验证明，该菌能够利用石油：柴油=1 : 1作为能源和碳源生长繁殖，该菌6 天能将无机盐培养基中的5g/L的石油：柴油（体积比）=1 : 1降解52. 24%。

附图说明

[0010] 图1为DL5-3在原油：柴油=1 : 1、柴油和液态烷烃中的的降解图。在图1中， 标记a为原油：柴油，b为柴油，c为液态烷烃。

具体实施方式

[0011] 实例一：Winogradskyellasp.DL5-3 的分离与鉴定

[0012] 现场采集大连新港溢油地区表层海水，采用海水培养基加入1 %石油：柴油= 1 : 1在28°C180r/min条件下进行富集培养。一周后，在固体培养基（M2)中稀释涂布平板， 得到多株纯菌，纯菌经过接种至液体培养基中验证其降解石油烃的能力，最后得到一株石 油烃的高效降解菌DL5-3,该菌经16SrDNA鉴定为维诺格拉斯基氏菌属（Winogradskyella sp.);选取其中相似序列，用MEGA5.0计算出序列的系统进化距离，构建系统进化树。进化 树显示，与其相似度最高的菌株都为Winogradskyellasp.菌株。结合菌株的16SrDNA 的测定结果，将其归属于维诺格拉斯基氏菌属（Winogradskyellasp.)。固体培养基（M2) 的成分：乙酸钠5g/L，柠檬酸钠0. 05g/L，普通肉汤培养基0. 5g/L，蛋白胨0.lg/L，酵母粉 0.lg/L，苹果酸0. 05g/L，葡萄糖lg/L，鹿糖0. 5g/L，硝酸铵lg/L，氯化铵0. 2g/L，酒石酸钠 0.05g/L，可溶性淀粉0. 5g/L，琼脂粉15g/L，加海水至1L，调pH7. 5，115°C高压蒸汽灭菌 30min后补加1 %体积已灭菌的KH2P04溶液（10g/L，pH6. 7)及0. 1 %体积0. 22ym滤膜除 菌的FeS04(0. 4g/L)。

[0013] 实例二：Winogradskyellasp.DL5-3 降解石油经的性能

[0014] 将维诺格拉斯基氏菌属（Winogradskyellasp.)的菌株DL5-3接种至含1 %石 油：柴油=1 : 1的人工海水培养基（MMC)中，在180r/min、28°C摇床中避光培养，每隔一 天分别取样利用重量法测定培养液中石油烃的降解率，实验结果见图1。由图1可以看出 Winogradskyellasp.DL5-3在第3~5天之间对于石油：柴油=1 : 1的降解较快。该菌 在第7天时对石油：柴油=1 : 1的降解率为52. 24%。人工海水培养基（MMC) :NaC124g/ L，MgS04 •7H207g/L，NH4N03lg/L，KC10. 7g/L，KH2P042g/L，Na2HP043g/L，pH7. 4。灭菌后补加适 量微量元素混合液，微量元素经〇. 22yM滤膜过滤除菌。MMC微量元素混合液：CaCl2, 2mg/ L;FeCl3 • 6H20, 50mg/L;CuS04, 0• 5mg/L;MnCl2 • 4H20, 0• 5mg/L;ZnS04 • 7H20, 10mg/L。

[0015] 实例三：Winogradskyellasp.DL5-3 的底物降解

[0016] 将维诺格拉斯基氏菌属（Winogradskyellasp.)的菌株DL5-3接种至不同碳源 (液态烷烃、固态烷烃、PAH以及柴油）的海水培养基中，同时设置底空白对照（只加底物不 加菌），在180r/min、28°C摇床中避光培养，每隔一天分别取样利用重量法测定培养液中底 物（PAH每隔两天取一次样）的降解率，其中Winogradskyellasp.DL5-3在PAH以及固态 烷烃中不降解PAH和固态烷烃，Winogradskyellasp.DL5-3对于柴油以及液态烷烃的降解 实验结果见图1。结果表明该菌株在柴油和液态烷烃中均能生长，其中在柴油中生长良好， 但是其在固态烷烃和PAH中不生长。