从混合物中分离感兴趣的寡核苷酸的方法

摘要

一种使用双相性流动相/固定相液‑液色谱系统从混合物中分离寡核苷酸的方法。第一流动相含有寡核苷酸且固定相含有可去除地结合目标寡核苷酸的交换剂物质。使该流动相在液‑液色谱仪中与该固定相流动接触以使该寡核苷酸在液体固定相中结合该交换剂物质。然后通过可将寡核苷酸从固定相置换入第二流动相的置换剂物质将该寡核苷酸从液体固定相置换入第二液体流动相。

权利要求

1.用于从目标寡核苷酸和一种或多种杂质的混合物中分离目标寡核苷酸的方法，所述方法包括：提供包含第一液体流动相和液体固定相的双相性流动相-固定相液-液色谱系统，所述液体固定相含有可去除地结合目标寡核苷酸的至少一种交换剂物质，其中所述交换剂物质选自质子化形式的三(正辛基)甲基氯化铵和三(正癸基)甲基氯化铵的混合物、十六烷基三甲基溴化铵、甲基三辛基氯化铵、苯扎氯铵、苄基三甲基氯化铵、四丁基氯化铵和Amberlite LA2；

使所述第一液体流动相在液-液色谱仪柱中相对于所述液体固定相并与所述液体固定相接触的流动中携带包含10-30个碱基的目标寡核苷酸以使所述目标寡核苷酸在所述液体固定相中结合所述交换剂物质；

然后通过可将所述目标寡核苷酸从所述液体固定相置换入第二流动相的置换剂物质将所述目标寡核苷酸从所述液体固定相置换入第二液体流动相，所述第二液体流动相相对于所述液体固定相并与所述液体固定相接触流经所述柱，所述置换剂物质选自无机酸与碱金属的盐、糖精的去质子化形式、6-羟基-5-[(4-磺基苯基)偶氮]-2-萘磺酸二钠和(4E)-3-氧代-4-[(4-磺酸基-1-萘基)亚肼基]萘-2,7-二磺酸三钠；

其中所述第一液体流动相和第二液体流动相各自包含混合以下(a)-(e)中任一组时形成的两个平衡液相中的一个相：(a)C1-6链烷酸C1-6烷基酯、C1-8链烷醇和水；(b)C4-8链烷醇和水；(c)C1-8链烷醇、二(C1-8烷基)酮和水；(d)二(C1-8烷基)酮和水；(e)二C1-6烷基醚或C4-10环醚、C1-8链烷醇和水，在所述液体流动相中水为主要成分；且所述液体固定相包含如此形成的两个平衡液相中的另一相，其中水为次要成分；

其中所述液体流动相具有7-14的pH。

2.根据权利要求1的方法，包括以下步骤：

(1)提供在溶液中含有所述目标寡核苷酸和一种或多种杂质的第一液相，以及含有所述交换剂物质的第二液相，当彼此接触时所述第一液相和第二液相形成两个不同的相；

(2)将所述第二液相作为其中的所述液体固定相引入离心分配色谱仪中；

(3)将在溶液中含有所述目标寡核苷酸和一种或多种杂质的第一液相作为所述第一液体流动相引入所述离心分配色谱仪中，并使该第一液体流动相流经所述离心分配色谱仪以与所述液体固定相接触，使所述目标寡核苷酸在所述液体固定相中可去除地结合所述交换剂物质；

(4)将当与所述第二液相接触时形成不同相并在溶液中含有至少一种置换剂物质的第三液相作为所述第二液体流动相引入所述离心分配色谱仪中，并使该第二液体流动相流经所述离心分配色谱仪以与所述液体固定相接触，使所述目标寡核苷酸从所述液体固定相中置换并进入所述第二液体流动相中的溶液中；

(5)从所述第二液体流动相中分离所述置换的目标寡核苷酸。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述目标寡核苷酸是具有序列5’-UCAAGGAAGAUGGCAUUUCA-3’的20个碱基寡核苷酸。

4.根据权利要求1或2的方法，其中所述目标寡核苷酸与也为寡核苷酸的一种或多种杂质分离。

5.根据权利要求1的方法，其中在(a)中所述C1-6链烷酸C1-6烷基酯是乙酸乙酯且所述C1-8链烷醇是1-丁醇。

6.根据权利要求1的方法，其中在(b)中所述C1-8链烷醇是1-戊醇或1-丁醇。

7.根据权利要求1的方法，其中在(c)中所述C1-8链烷醇是1-丁醇且所述二(C1-8烷基)酮是甲基异丁基酮。

8.根据权利要求1的方法，其中在(d)中所述二(C1-8烷基)酮是甲基异丁基酮。

9.根据权利要求1的方法，其中在(e)中所述二C1-6烷基醚和C4-10环醚选自甲基-叔丁基醚和2-甲基四氢呋喃，且所述C1-8链烷醇选自1-戊醇和1-丁醇。

10.根据权利要求1或2的方法，其中所述目标寡核苷酸在所述柱中的浓度是200mg-

80g/L。

11.根据权利要求1或2的方法，其中所述交换剂物质选自：三(正辛基)甲基氯化铵和三(正癸基)甲基氯化铵的混合物以及苯扎氯铵。

12.根据权利要求1或2的方法，其中所述交换剂物质在所述液体固定相中的浓度为5-

500mM。

13.根据权利要求1或2的方法，其中所述第二液体流动相具有与所述第一液体流动相相同的液体组成。

14.根据权利要求13的方法，其中所述液体固定相包含C1-8链烷醇和C1-6链烷酸C1-6烷基酯的混合物作为主要成分，且所述第二液体流动相包含水和C1-8链烷醇的混合物。

15.根据权利要求13的方法，其中所述液体固定相包含C1-6环醚和C1-8链烷醇的混合物作为主要成分，且所述第二液体流动相包含水和C1-8链烷醇的混合物作为主要成分。

16.根据权利要求1或2的方法，其中所述置换剂物质选自碘化钠或碘化钾。

17.根据权利要求1或2的方法，其中所述置换剂物质在所述第二液体流动相中的浓度为5-30mM。

18.根据权利要求1的方法，其中随后将所述目标寡核苷酸从所述第二液体流动相中分离。

说明书

从混合物中分离感兴趣的寡核苷酸的方法

[0001] 本发明涉及新方法，特别是使用无载体液-液色谱法分离寡核苷酸和化学杂质的方法。

[0002] 寡核苷酸包含相对短序列的核酸聚合物，其可为DNA或RNA，典型具有50个或更少的碱基，虽然现在可合成具有多至约200个碱基的寡核苷酸。寡核苷酸有用于治疗。被Prosensa公司以其名称PRO051和本申请名称GSK2402968确定的一种合成的RNA寡核苷酸具有序列5’-uca agg aag aug gca uuu ca-3’。此寡核苷酸是一种反义寡核苷酸，即与所选序列互补的DNA或RNA单链。认为其诱导外显子(exon)51的外显子遗漏，且在用于治疗具有杜氏肌肉营养不良(DMD)的非卧床男孩的III期临床研究中。

[0003] 此类寡核苷酸的一个问题是其从杂质的纯化。例如上述GSK2402968是20-mer，且在其合成中其可受到杂质污染，包括含有更短链或更长链，例如含有17、18、19和21个碱基的其它寡核苷酸。还可能存在其它杂质。

[0004] 希望提供有效并可应用于工业生产规模的用于分离此类寡核苷酸的方法。“Therapeutic oligonucleotides:The state of the art in purification technologies”，Sanghvi等人，Current Opinion in Drug Discovery(2004)Vol.7No.8综述了用于寡核苷酸纯化的方法。该文献公开了其它方法。已使用各种方法用于纯化DNA和RNA序列。WO-A-01/55160公开了通过与污染物形成亚胺键然后采用色谱法或其它技术除去亚胺连接的杂质以纯化寡核苷酸。“Size Fractionation of DNA Fragments Ranging from 20to 30000Base Pairs by Liquid/Liquid chromatography”，Muller等人，Eur.J.Biochem(1982)128-238公开了使用其上已沉积了PEG/右旋糖酐相的微晶纤维素实体柱用于分离核苷酸序列。“Separation and identification of oligonucleotides by hydrophilic interaction chromatography”，Easter等人，The Analyst(2010)，135(10)公开了使用改进的HPLC利用固体二氧化硅载体相分离寡核苷酸。“Fractionation of oligonucleotides of yeast soluble ribonucleic acids by countercurrent distribution”，Doctor等人，Biochemistry(1965)4(1)49-54公开了使用包装干DEAE-纤维素的干实体柱。“Oligonucleotide composition of a yeast lysine transfer ribonucleic acid”，Madison等人，Biochemistry，1974，13(3)公开了使用固相色谱法用于分离核苷酸序列。维基百科在以下网址公开了使用亲水作用色谱，使用固体二氧化硅基质用于分离生物分子：http://en.wikipedia.org/wiki/Hydrophilic_interaction_chromatography。

[0005] 液-液色谱法是已知的分离方法。液-液色谱法使用双相性液体系统，该系统包含维持在伸长柱中的固定液相(类似于常规色谱中配置在管柱中的固相)，以及使之与固定相接触流经该柱的流动液相。在此流动中，物质将以类似于常规固相色谱的方式在流动相和固定相之间分配。在液-液色谱技术中流动相将物质洗脱分离为类似于常规液-固相色谱的不同级分。在液-液色谱中该方法通常无载体操作，即无需固体载体基质承载该液相，其依靠旋转柱内的离心力在该过程中维持它们的彼此接触关系。“Countercurrent Chromatography-The Support-Free Liquid Stationary Phase”，Billardello，B.，Berthod，A；Wilson&Wilson’s Comprehensive Analytical Chemistry 38，Berthod，A.，编辑；Elsevier Science B.V.:Amsterdam(2002)pp 177-200提供了有用的液-液色谱法的一般说明。

[0006] 已知各种液-液色谱技术。

[0007] 一种技术是液-液逆流色谱法(在此称作“CCC”)。在CCC仪器中通常恒定内径的圆形例如螺旋形或螺旋管状柱两个都围着其圆形中心和从其中心移位的旋转轴旋转，即所谓的行星自传。此组合运动在柱中产生了振荡离心力场，导致沿着柱的混合和反混合区域。典型的CCC仪器公开在WO-A-03/086639(布鲁奈尔大学)中。

[0008] 另一已知的技术是离心分配色谱法(在此称作“CPC”)。US-A-6,537,452和WO-A-2010/059715提出了使用CPC用于分离生物分子的可能性。“High Performance Centrifugal Partition Chromatography”2005(在线:http://web.archive.org/web/
20050208201013/http://everseko.co.jp/p02.html)和“Applications of Liquid-Liquid Chromatography Instrumentation for Laboratory Preparative&Process Chemistry”，Brown等人，Chromatography Today (Nov-Dec 2009)16-19是关于CPC的一般性文章。“Anion-Exchange Displacement Centrifugal Partition Chromatography”，Maciuk等人，Anal.Chem.(2004)76，6179-6186公开了置换色谱法，其中羟基肉桂酸异构体分离通过在固定相中提供交换剂(或保留剂)物质以可去除地保留羟基肉桂酸在固定相上，然后使用置换剂物质将其从固定相置换。

[0009] 多种CPC仪器类型是市场上可购的，例如来自Kromaton(Rousselet Robatel Group的一部分)。典型地，CPC仪器包含含有许多(有时多至1000)个小腔的柱，该小腔有时称作“分配单元(partition cell)”，其以一种或多种循环圆周排列以围着旋转轴旋转，这些分配单元通过流动通道相互连接以使液体可经过它们顺序流动。在一种已知排列中多个分配单元围着一圆盘蚀刻或加工，例如自金属例如不锈钢制备，以及多个圆盘沿着它们的中心旋转轴堆放以形成可围绕其旋转轴旋转的旋转体。具有相对少堆放圆盘以及相对更大体积分配单元的一些CPC仪器形式有时称作离心分配提取器(“CPE”)装置。典型的CPC仪器例如公开在US-A-6,537,452(Kromaton)、WO-A-2004/079363(Partus)中以及其它科学或商业文献中。

[0010] 在CPC方法中液相被引入一系列分配单元和通道中，同时分配单元环围着旋转轴旋转。此旋转导致保持此相(固定相)在适当位置的离心力。然后可使第二液相(流动相)流经该分配单元，且因此可导致溶于该流动相中的物质在流动相和固定相之间分配，该方式类似于柱色谱中物质在流动洗脱液和固定固相之间分配的方式。

[0011] 液-液色谱仪器可以以所谓的“下行(descending)”或“上行(ascending)”模式运行。当柱旋转时，若流动相和固定相具有不同的密度，通过旋转产生的离心力导致较高密度相相比于较低密度相更为放射状外离柱的旋转轴。若在此仪器中流动相是较高密度的更为放射状向外相，这称作运行的“下行模式”。如果相反，流动相是较低密度的更为放射状向内相，则称作“上行模式”。

[0012] CPC已被用于分离各种类型的物质。例如分离芥子油苷(源自葡萄糖和氨基酸的有机物)描述在Toribio A，Nuzillard J-M，Renault J-H；Journal of Chromatography A.1170(2007)44-51中。例如使用CPC纯化肽公开在WO-A-2011/157803中。

[0013] 本发明的一个目的是提供使用液-液色谱法将寡核苷酸与杂质分离的方法，其兼备分离有效以及适于以工业生产规模使用。

[0014] 根据本发明，用于从目标寡核苷酸和一种或多种杂质的混合物中分离目标寡核苷酸的方法，包括：

[0015] 提供包含第一液体流动相和液体固定相的双相性流动相-固定相液-液色谱系统，所述液体固定相含有可去除地结合目标寡核苷酸的至少一种交换剂物质；

[0016] 使第一液体流动相在液-液色谱仪柱中相对于并与液体固定相接触的流动中携带目标寡核苷酸以使所述目标寡核苷酸在液体固定相中结合交换剂物质；

[0017] 然后通过可将目标寡核苷酸从液体固定相置换入第二流动相的置换剂物质将目标寡核苷酸从液体固定相置换入第二液体流动相，所述第二液体流动相相对于并与所述固定相接触流经所述柱。

[0018] 因此所述目标寡核苷酸可从第二流动相中分离。

[0019] 在此方法的一个实施方案中，使第一液体流动相在流动中携带目标寡核苷酸可通过提供含有目标寡核苷酸，例如含有溶解其中的目标寡核苷酸的第一液体流动相来实现。

[0020] 在适于CPC的此方法一个实施方案中，该方法包括以下步骤：

[0021] (1)提供在溶液中含有所述目标寡核苷酸和一种或多种杂质的第一液相，以及含有可去除地结合所述目标寡核苷酸的交换剂物质的第二液相，当彼此接触时第一液相和第二液相形成两个不同的相；

[0022] (2)将所述第二液相作为其中的固定液相引入离心分配色谱仪中；

[0023] (3)将在溶液中含有所述目标寡核苷酸和一种或多种杂质的第一液相作为第一流动相引入所述离心分配色谱仪中，并使该第一液相流经所述离心分配色谱仪以与第二液体固定相接触，使所述目标寡核苷酸在第二液体固定相中可去除地结合交换剂物质；

[0024] (4)将当与第二液相接触时形成不同相并在溶液中含有可将所述目标寡核苷酸从第二液相置换的至少一种置换剂物质的液相作为第二流动相引入离心分配色谱仪中，并使该第二流动相流经所述离心分配色谱仪以与固定液相接触，使所述目标寡核苷酸从固定相中置换并进入第二流动相中的溶液中；

[0025] (5)从第二流动相中分离所述置换的目标寡核苷酸。

[0026] 寡核苷酸典型地含有50个或更少的碱基，且如上所述可容易合成多至200个碱基的寡核苷酸。本发明方法可认为适用于所有此类寡核苷酸，且适用于天然生成和合成寡核苷酸，例如寡核苷酸具有碱基修饰或修饰碱基。如本文使用的术语“寡核苷酸”包括DNA和RNA、LNA(锁核酸，即其中采用连接2'氧和4'碳的外桥(extra bridge)修饰LNA核苷酸的核糖部分)序列、具有2’修饰的寡核苷酸、磷酸二酯和硫代磷酸，并包括受保护和未保护序列。

[0027] 本发明促进了目标寡核苷酸与杂质分离，该杂质例如由寡核苷酸的合成或提取得到。分离例如可由于杂质未在固定相中结合交换剂物质，以至于杂质仍然溶于流动相中流经并离开CPC仪器。另一方面此杂质在固定相中结合交换剂物质，但结合程度不同于目标寡核苷酸，和/或可从固定相置换，但置换程度不同于感兴趣的寡核苷酸，以使当第二流动相流经CPC时感兴趣的寡核苷酸和杂质分离入第二流动相液流中不同的级分中，类似于常规色谱。这两种分离过程都可能发生。

[0028] 本发明方法可认为适于治疗中使用的典型长度的寡核苷酸，例如5-50个碱基，例如10-30个碱基，例如15-25个碱基。目前可用数据表明本发明方法可应用于任何碱基序列的寡核苷酸。所述目标寡核苷酸例如可为具有序列5’-uca agg aag aug gca uuu ca-3’的称为GSK2402968的20碱基RNA寡核苷酸。10碱基DNA寡核苷酸的一个实例是5’GGC CAA ACC T 3’。20碱基DNA寡核苷酸的另一实例是5’GGC CAA TCG GCT TAC CT 3’。30碱基DNA寡核苷酸的一个实例是5’GGC CAA TCG GCT TCA CTC GGC CAA ACC 3’。LNA寡核苷酸的一个实例是5’TTT ACG ACG ACG TTT 3’。siRNA寡核苷酸的一个实例是5’-gca cga uuc uca aga ugc cg-3’。

[0029] 本发明方法使用的寡核苷酸还可包括肽核酸或其衍生物。

[0030] 本文定义的术语“碱基修饰”或“修饰的碱基”是指已有碱基(即嘧啶或嘌呤碱基)的修饰或从头合成碱基。与已有碱基相比，该从头合成的碱基可以看作“修饰的”。

[0031] 本发明包含的寡核苷酸的其它化学性质(chemisties)和修饰如下所述。这些其它的化学性质和修饰可以与寡核苷酸已经确定的化学性质共同存在，例如存在5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶和/或2,6-二氨基嘌呤，和包括2’-O-甲基硫代磷酸RNA的的寡核苷酸。

[0032] 除了上述修饰外，本发明的方法所用的寡核苷酸可以包括其它修饰，例如如下所述的不同类型的核酸单体或核苷酸。例如，与基于RNA的寡核苷酸相比，寡核苷酸可以具有至少一个骨架，和/或糖修饰和/或至少一个碱基修饰。

[0033] 术语碱基修饰还包括天然嘌呤和嘧啶碱基(例如腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)的修饰形式，例如次黄嘌呤、乳清酸、2-胍丁胺基胞苷(agmatidine)、赖西汀、2-硫嘧啶(例如2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶)、G-clamp及其衍生物、5-取代的嘧啶(例如5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-卤代尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-氨基甲基尿嘧啶、5-羟基甲基尿嘧啶、5-氨基甲基胞嘧啶、5-羟基甲基胞嘧啶、Super T)、2,6-二氨基嘌呤、7-去氮鸟嘌呤、7-去氮腺嘌呤、7-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、8-氮杂-7-去氮鸟嘌呤、8-氮杂-7-去氮腺嘌呤、8-氮杂-7-去氮-2,6-二氨基嘌呤、Super G、Super A和N4-乙基胞嘧啶，或其衍生物；N2-环戊基鸟嘌呤(cPent-G)、N2-环戊基-2-氨基嘌呤(cPent-AP)和N2-丙基-2-氨基嘌呤(Pe-AP)，或其衍生物；和简并碱基或通用碱基，例如2,6-二氟甲苯，或缺失碱基如无碱基位点(例如1-去氧核糖、1,2-二去氧核糖、1-去氧-2-O-甲基核糖；或其中环氧已经被氮替换的吡咯烷衍生物(氮杂核糖))。Super A、Super G和Super T的衍生物的实例可以在US-A-6,683,183中找到，将其整体引入作为参考。当将cPent-G、cPent-AP和Pr-AP掺入siRNA中时，它们显示免疫刺激作用降低(Peacock H等人，J.Am.Chem.Soc.(2011),133,
9200)。

[0034] 本发明所用的寡核苷酸可包括无碱基位点或无碱基单体。无碱基位点或无碱基单体是与包括核碱基的相应单体相比缺乏核碱基的单体或构件。因此无碱基单体是寡核苷酸的构件部分但缺乏核碱基。该无碱基单体可以存在或连接或结合或共轭至寡核苷酸的游离末端。无碱基单体可以为任何已知形式，并且为本领域技术人员理解，其非限制性实例描述如下：

[0035]

[0036] 其中，R1和R2独立地为H、寡核苷酸或其它无碱基位点，前提是R1和R2不同时为H和R1和R2不同时为寡核苷酸。无碱基单体可以与之前说明的寡核苷酸的任一末端或两个末端结合。需要注意的是与一个或两个无碱基位点或无碱基单体结合的寡核苷酸可以包括少于10个核苷酸。

[0037] 本发明的方法所用的寡核苷酸可以包括糖修饰，即核糖基部分的修饰形式，例如2’-O-修饰的RNA，例如2’-O-烷基或2’-O-(取代的)烷基，例如2’-O-甲基、2’-O-(2-氰基乙基)、2’-O-(2-甲氧基)乙基(2’-MOE)、2’-O-(2-甲硫基)乙基、2’-O-丁酰基、2’-O-炔丙基、
2’-O-烯丙基、2’-O-(3-氨基)丙基、2’-O-(3-(二甲基氨基)丙基)、2’-O-(2-氨基)乙基、2’-O-(二甲基氨基)乙基；2’-去氧(DNA)；2’-O-(卤代烷氧基)甲基(Arai K等人，Bioorg.Med.Chem.2011,21,6285)，例如2’-O-(2-氯乙氧基)甲基(MCEM)、2’-O-(2,2-二氯乙氧基)甲基(DCEM)；2’-O-烷氧基羰基，例如2’-O-[2-(甲氧基羰基)乙基](MOCE),2’-O-[2-(N-甲基氨基甲酰基)乙基](MCE)、2’-O-[20(N,N-二甲基氨基甲酰基)乙基](DCME)；2’-卤代，例如2’-F、FANA(2’-F-阿糖基核酸)；碳环糖和氮杂糖修饰；3’-O-烷基，例如3’-O-甲基、3’-O-丁酰基、3’-O-炔丙基；和它们的衍生物。

[0038] 其它糖修饰包括“桥连”或“双环”核酸(BNA)，例如锁核酸(LNA)、xylo-LNA、α-L-LNA、β-D-LNA、cEt(2’-O,4’-C限制的乙基)LNA、cMOEt(2’-O,4’-C限制的甲氧基乙基)LNA、亚乙基桥连核酸(ENA)、三环DNA；解锁核酸(UNA)；环己烯基核酸(CeNA)、阿卓糖醇核酸(altriol nucleic acid)(ANA)、己糖醇核酸(HNA)、氟化的HNA(F-HNA)、吡喃糖基-RNA(p-RNA)、3’-去氧吡喃糖基-DNA(p-DNA)；吗啉代(例如在PMO、PPMO、PMOPlus、PMO-X中)；和它们的衍生物。

[0039] 本发明的方法所用的寡核苷酸可以包括骨架修饰，例如RNA中存在的磷酸二酯的修饰形式，例如硫代磷酸酯(PS)、手性纯的硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯(PS2)、膦酰乙酸酯(PACE)、膦酰乙酰胺(PACA)、硫代膦酰乙酸酯、硫代膦酰乙酰胺、硫代磷酸酯前药、H-膦酸酯、膦酸甲酯、硫代膦酸甲酯、磷酸甲酯、硫代磷酸甲酯、磷酸乙酯、硫代磷酸乙酯、硼烷磷酸酯、硼烷硫代磷酸酯、硼烷磷酸甲酯、硼烷硫代磷酸甲酯、硼烷膦酸甲酯、硼烷硫代膦酸甲酯，和它们的衍生物。另一修饰包括亚磷酰胺、氨基磷酸酯、N3’→P5’氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、二氨基硫代磷酸酯、氨基磺酸酯、二亚甲基亚砜、磺酸酯、三唑、乙二酰基、氨基甲酸酯、亚甲基亚胺基(MMI)，和硫代乙酰胺基核酸(TANA)；和它们的衍生物。

[0040] 本发明的方法所用的寡核苷酸可以包括其它修饰，例如肽核酸(PNA)、硼簇修饰的PNA、基于吡咯烷的氧基-肽核酸(POPNA)、基于乙二醇或甘油的核酸(GNA)、基于苏糖的核酸(TNA)、基于非环苏氨醇的核酸(aTNA)、基于吗啉代的寡核苷酸(PMO、PPMO、PMO-X)、基于阳离子吗啉代的寡聚物(PMOplus)、具有整合碱基和骨架的寡核苷酸(ONIBs)、吡咯烷-酰胺寡核苷酸(POMs)；和它们的衍生物。本领域技术人员还将理解存在寡核苷酸的许多合成衍生物。骨架修饰包括RNA中存在的磷酸二酯的修饰形式，例如硫代磷酸酯(PS)、手性纯的硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯(PS2)、膦酰乙酸酯(PACE)、膦酰乙酰胺(PACA)、硫代膦酰乙酸酯、硫代膦酰乙酰胺、硫代磷酸酯前药、H-膦酸酯、膦酸甲酯、硫代膦酸甲酯、磷酸甲酯、硫代磷酸甲酯、磷酸乙酯、硫代磷酸乙酯、硼烷磷酸酯、硼烷硫代磷酸酯、硼烷磷酸甲酯、硼烷硫代磷酸甲酯、硼烷膦酸甲酯、硼烷硫代膦酸甲酯，和它们的衍生物。另一修饰包括亚磷酰胺、氨基磷酸酯、N3’→P5’氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、二氨基硫代磷酸酯、氨基磺酸酯、二亚甲基亚砜、磺酸酯和硫代乙酰胺基核酸(TANA)；和它们的衍生物。

[0041] 各个糖、碱基，和/或骨架不需要以同样方式进行修饰。几种不同的修饰糖、碱基和/或骨架可以组合至本发明的方法所用的寡核苷酸的一个单个寡核苷酸中。本发明的方法所用的寡核苷酸可以在所述寡核苷酸中包括超过一个不同的碱基修饰和/或超过一个不同的糖修饰和/或一个或多个不同的骨架修饰。

[0042] 本发明的方法可认为适合分离寡核苷酸和非寡核苷酸杂质。

[0043] 该方法可认为还适于将目标寡核苷酸与一种或多种也是寡核苷酸的杂质分离。例如本发明方法可认为能够分离与目标寡核苷酸仅有一或两个碱基区别的寡核苷酸杂质。例如本发明方法可认为适于将具有20个碱基的目标寡核苷酸与具有17、18、19或21个碱基的更短或更长寡核苷酸杂质分离。认为此寡核苷酸杂质在固定相中结合交换剂物质，但结合程度不同于感兴趣的目标寡核苷酸，和/或可从固定相置换，但置换程度不同于感兴趣的目标寡核苷酸，以使当第二流动相流经CPC时感兴趣的目标寡核苷酸和杂质寡核苷酸分离入第二流动相液流中不同的级分中。

[0044] 在本发明方法中，目标寡核苷酸可作为游离寡核苷酸或可为目标寡核苷酸衍生物的形式，例如被保护基保护的形式。已知用于寡核苷酸的多种保护基。一种适合的保护基是二甲氧基三苯甲基，且认为其它已知的保护基也是适合的。

[0045] 第一流动相和固定相可包含当彼此接触时形成两个不同相的任何液体，且其包含溶解目标寡核苷酸的流动相以及溶解交换剂物质和当结合该交换剂物质时的该目标寡核苷酸的固定相。此类液体其它令人满意的性质包括形成具有不同密度的两相，其易于形成两个不同的相且显示出很小的乳化倾向。

[0046] 例如这两相可包含溶剂的组合或水和一种或多种溶剂的组合，当混合时产生其中交换剂物质仅仅或实质上可溶于仅仅一相(流动相或固定相)，且置换剂物质仅仅或实质上可溶于仅仅另一相(固定相或流动相)的双相性系统。

[0047] 例如该固定相可包含与水不混溶或部分混溶的一种或多种有机液体的混合物，该有机液体例如C1-6链烷酸C1-6烷基酯、二C1-6烷基醚、C4-10环醚、液体卤代C1-6烷烃或液体C5-10烷烃；以及至少部分与水混溶的一种或多种有机液体，例如C1-8链烷醇或二(C1-8烷基)酮。

[0048] “部分混溶”包括在至少部分链烷醇-水组合物范围内可形成的两相系统。此两相的每相均含有链烷醇和水，但在一相中链烷醇将起主要作用且在另一相中水将起主要作用。低级链烷醇例如C1-3链烷醇通常在全部水-链烷醇组合物范围内完全与水混溶，但高级链烷醇例如C4-8链烷醇通常与水不混溶或仅部分混溶。例如该第一和第二流动相可包含与水混溶的一种或多种有机液体，例如C1-8链烷醇或二(C1-8烷基)酮和水的混合物。此类有机液体的实例包括乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、烷基取代的四氢呋喃例如2-甲基四氢呋喃、氯仿、己烷、1-丁醇、乙醇、甲醇和强极性非质子溶剂例如二甲基亚砜和二甲基甲酰胺。

[0049] 当然将理解在其中这两相彼此接触的任何这类平衡系统中可能有一些液体成分较小比例的相互混合，以致于固定相液体可含有较小比例的来自流动相液体的溶解于其中的水，且流动相液体可含有较小比例的来自固定相液体的溶解于其中的基本上不与水混溶的液体。

[0050] 适当地，各相形成可通过混合两种或更多种此类液体并使系统沉降成上部较低密度相和下部较高密度相的两个平衡相，各相可用作固定相或流动相。该固定相和流动相因此可包含含有此类液体的液体系统的相应两个平衡相。将会理解每个此类相可含有所有包含该液体的系统，但每个此类相将主要含有一种或多种液体作为主要成分，且一种多种液体作为次要成分。

[0051] 此类相的实例包括下列两相系统(a)至(e)。此类液体可经混合以提供此类相的相对比例将取决于该液体，但可通过实验容易确定。以下建议了典型的比例。

[0052] (a)C1-6链烷酸C1-6烷基酯-C1-8链烷醇-水。较低密度相包含主要成分酯+链烷醇.较高密度相包含主要成分水+链烷醇.例如乙酸乙酯-1-丁醇-水(3:2:5)。

[0053] (b)C4-8链烷醇-水。较低密度相包含主要成分链烷醇。较高密度相包含主要成分水。例如1-戊醇或1-丁醇-水。

[0054] (c)C1-8链烷醇-二(C1-8烷基)酮-水。较低密度相包含主要成分链烷醇+酮。较高密度相包含主要成分水+链烷醇。例如1-丁醇-甲基异丁基酮-水(1:3:4)。

[0055] (d)二(C1-8烷基)酮-水.较低密度相包含主要成分酮。较高密度相包含主要成分水。例如甲基异丁基酮-水。

[0056] (e)二C1-6烷基醚或C4-10环醚-C1-8链烷醇-水。较低密度相包含主要成分醚和链烷醇。较高密度相包含主要成分水。例如甲基叔丁基醚-1-戊醇-水(3:1:4)或2-甲基四氢呋喃-1-丁醇-水(3:1:4)。

[0057] 将会理解除了其自身的主要成分，每个成对的此类相将含有作为成对的另一相的主要成分的次要成分。在本发明方法中，固定相可为此类成对相的较低密度相。

[0058] 优选的第一流动相包含水和1-丁醇的混合物作为主要成分，而固定相包含乙酸乙酯和1-丁醇的混合物作为主要成分。另一优选的第一流动相包含水和1-丁醇的混合物作为主要成分，而固定相包含2-甲基四氢呋喃和1-丁醇的混合物作为主要成分。此类混合物当彼此接触时形成两个不同的相。

[0059] 适当地，可将第一流动相调节至适当的pH以促进目标寡核苷酸的的溶解和稳定，例如通过加入碱，例如无机碱例如碱金属氢氧化物例如氢氧化钠，或氨。适当的pH尤其取决于寡核苷酸并可取决于其是否受保护。第一流动相的适当pH范围可认为是pH7-14，虽然认为酸性pH<7对于一些应用可为可行的。二甲氧基三苯甲基保护形式或未保护的上述20-mer寡核苷酸的适当pH范围为约pH 7-12。二甲氧基三苯甲基保护形式的此寡核苷酸的适当pH范围例如为pH 10-12，适当地约pH 11。目前可用数据表明此pH范围可适用于其它寡核苷酸。在第一流动相中实现此pH的此类碱的适当浓度可通过实验确定。在本文所述实验中发现适当的浓度为10+/-5mM，例如10mM氢氧化钠。

[0060] 目标寡核苷酸(例如以上提及的20-mer)的适当浓度可通过实验确定。柱中200mg-100g/L，例如200mg-80g/L、例如20-60g/L的浓度可认为是适当的。

[0061] 交换剂物质(有时在现有技术中还称作“保留剂”)在固定相中可去除地结合目标寡核苷酸。适当地，该交换剂物质是阴离子交换剂物质。

[0062] 结合目标寡核苷酸的适当的交换剂物质是有机胺与抗衡阴离子的盐，适当为仲、叔或季铵盐。此类铵盐的实例具有通式：

[0063] R1R2R3R4N+X-

[0064] 其中整个序列中仲、叔和季分别为R1，R2，R3和R4中的二、三或四个基团，其独立为C1-20烷基或取代烷基例如氟或三氟甲基取代烷基、或苄基且剩余为氢，X-是卤素阴离子，适当为氯。适当的交换剂物质是三(正辛基)甲基氯化铵和三(正癸基)甲基氯化铵的混合物，TM适当地其中正辛基化合物起主要作用。此种混合物以名称Aliquat 336 市场上可购。认为其它适当的交换剂物质包括质子化形式的溴化十六烷基三甲铵、甲基三辛基氯化铵、苯扎氯铵(还称作烷基二甲基苄基氯化铵和ADBAC，为各种烷基链长的烷基苄基二甲基氯化铵的混合物)、苄基三甲基氯化铵、四丁基氯化铵和Amberlite LA2(一种以游离碱形式提供的液体的高分子量，油溶性仲胺)。

[0065] 交换剂物质在固定相中的浓度将尤其取决于所使用的物质、目标寡核苷酸自身以及流动相的流速。基于目标寡核苷酸和交换剂物质的摩尔比可进行计算。对于10至30mer寡核苷酸，认为适当的交换剂物质摩尔比范围为0.5-15，优选约5，当量/离子位点，导致交换剂物质：目标寡核苷酸摩尔比范围为1:5-500，优选1:10-300，更优选1:20-150。5-500，例如5-100，典型地8-50mM的交换剂物质浓度可认为是适当的，至少对于Aliquat 336TM，并可能对于其它交换剂物质。

[0066] 认为可使用使用液-液固定相和流动相系统的任何市场上可购的液-液色谱仪实行本发明的方法。

[0067] 适当的CPC仪器的一个实例是来自Kromaton的FCPC200TMCPC仪器。适当的CPC仪器还可购买自Armen Instrument。此类仪器的正常规定操作条件可认为适于实行本发明的方法。按照该仪器的正常操作步骤将固定相适当地引入柱中。

[0068] 在典型操作中用固定相填充柱可通过将固定相液体，例如第二液相，以高流速泵入柱中，然后以该仪器的适当操作速度开始旋转该柱。

[0069] 可使第一流动相在其各种方式的流动中携带目标寡核苷酸(连同杂质)。

[0070] 以一种方式，例如可接着将含有溶解的目标寡核苷酸的第一流动相引入柱中并使之相对于并与固定相接触流经该柱。

[0071] 以另一种方式，例如可将目标寡核苷酸溶于与流动相混溶的液体中，例如其为第一流动相液体的液体成分，或含有该流动相的一种或多种液体成分，并将其以此形式引入第一流动相的液流中。若第一流动相液体含有水，则目标寡核苷酸可例如以此方式以水溶液引入。适当地对于含水第一流动相，典型地为其与污染杂质组合的粗态的目标寡核苷酸与含水第一流动相可混合在水溶液形式中，例如在氨水中。一些寡核苷酸合成法产生了水、溶解氨和溶剂例如乙腈和乙醇的混合物溶液中的寡核苷酸，且在一些应用中该目标寡核苷酸可以此种溶液的形式引入柱中。在此目标寡核苷酸引入方式中与流动相混溶的液体可在流动相流动中与其混合，或可保持为实质上不同的相并被流动相环绕柱推动。

[0072] 在任选的步骤中，在将含有溶解的目标寡核苷酸的第一流动相引入柱中前，可使不含目标寡核苷酸的第一流动相流经充满固定相的柱。此种流动相的初始流动可洗脱一些固定相，其持续直至达到水动力平衡且离开柱出口端的流动相不含或含有最低量的固定相。此种状态可通过取样来自柱出口端的液流测定。

[0073] 任选地含有溶解的目标寡核苷酸的第一流动相可作为与固定相液体的混合物引入柱中。引入作为与固定相液体的此种混合物的流动相可帮助确保流动相与固定相继续处于饱和状态，并可预防被流动相因其流经该柱从该柱中洗脱固定相。若这样进行则所需的固定相量可通过实验确定，并可需要很少量。

[0074] 固定相和流动相的适当流速可通过液-液色谱仪，例如Armen或Kromaton，例如Kromaton FCPC200TM的正常操作方法测定。第一流动相的引入在短暂时间内可具有置换一些固定相的效果，且可被检测。因为固定相的体积和柱体积是已知的，所以可计算Sf，固定相保留因子(留在柱中的固定相比例的量度)。

[0075] 含有目标寡核苷酸的流动相流经包含含有交换剂物质的固定相的柱导致溶于第一流动相中的目标寡核苷酸在固定相中结合交换剂物质。目标寡核苷酸保留在固定相中的能力尤其取决于使平衡的时间以及固定相中交换剂物质的浓度。适当的流速，例如含有溶解的目标寡核苷酸的第一流动相进入柱中以实现所有或适当比例的目标寡核苷酸保留在固定相中的平衡的适当流速可基于仪器的操作条件通过实验确定。适当的流速，至少对于Kromaton FCPC200TM并可能通常而言，可认为是2-6ml/分钟，但预期此类仪器可更快运行。对于其它仪器，特别是更大规格仪器而言，不同的流速可为适当的。适当的条件可通过实验确定，例如通过监控目标寡核苷酸和/或其它物质在离开CPC仪器的第一流动相液流中的浓度。适当的监控技术对于本领域普通技术人员而言将是显而易见的，例如使用光谱或HPLC等。

[0076] 第二液体流动相可具有与例如如上所述的第一流动相相同的液体成分，例如一种或多种溶剂或一种或多种溶剂和水的混合物。例如如上所述与包含主要的C1-8链烷醇例如1-丁醇和C1-6链烷酸C1-6烷基酯例如乙酸乙酯的混合物的固定相组合，该第二流动相可包含水和C1-8链烷醇例如1-丁醇的混合物，其若以上述方式提供还可含有较小比例的一些C1-6链烷酸C1-6烷基酯。另一方面例如如上所述与包含主要的C1-6环醚例如甲基四氢呋喃和C1-8链烷醇的混合物的固定相组合，该第二流动相可包含主要的水和C1-8链烷醇的混合物。

[0077] 适当地，还可将第二流动相调至适当的pH以促进目标寡核苷酸的的溶解和稳定。适当的pH尤其取决于该寡核苷酸并可取决于其是否受保护。二甲氧基三苯甲基保护形式或未保护的上述20-mer寡核苷酸的适当pH范围为约pH 7-12。二甲氧基三苯甲基保护形式的此寡核苷酸的适当pH范围例如为pH 10-12，适当地约pH 11。此pH范围，例如pH 7-14，可适用于其它寡核苷酸，且认为对于一些应用酸性pH<7可为可行的。pH的调节例如可通过加入碱例如氢氧化钠。第二流动相中实现此pH的此碱的适当浓度为10+/-5mM，例如10mM氢氧化钠。

[0078] 适当的置换剂物质是相比于目标寡核苷酸与交换剂物质具有更高的结合常数，例如形成静电键的能力的物质。适当的置换剂物质包含阴离子部分，其可带单或多电荷。适当的置换剂物质包括盐，尤其是无机酸与金属特别是碱金属的盐例如卤化物、硫酸盐等或草酸盐。适当的置换剂物质是碘化钠或碘化钾。其它适当的置换剂物质包括糖精的去质子化形式，例如糖精的碱金属盐例如糖精钠盐、日落黄(6-羟基-5-[(4-磺基苯基)偶氮]-2-萘磺酸二钠)和苋菜红((4E)-3-氧代-4-[(4-磺酸基-1-萘基)亚肼基]萘-2,7-二磺酸三钠)。将会理解后两者包含二元和三元阴离子部分。

[0079] 可根据交换剂物质:置换剂物质的摩尔比进行计算，该摩尔比范围优选为1:1至5:1。在此基础上置换剂物质的最大浓度可认为为约500mM。第二流动相中该置换剂物质的适当浓度可认为为2-500mM，例如5-30mM。

[0080] 含有置换剂物质以实现以一定速度从固定相置换目标寡核苷酸以使目标寡核苷酸作为离开CPC仪器的第二流动相的液流中的便利离散级分的第二流动相的适当流速可通过实验确定。在本文所述实验中发现适当的流速，至少对于Kromaton FCPC200TM而言为2-6ml/分钟，其可认为可实现目标寡核苷酸的完全置换，但认为可使此仪器更快运行，例如在
200ml柱中直至20ml/分钟。用于实现此置换的适当条件可通过实验确定，例如通过监控目标寡核苷酸在离开CPC仪器的第二流动相液流中的浓度。适当的监控技术对于本领域普通技术人员而言将是显而易见的，例如使用光谱或HPLC等。

[0081] 然后可通过常规方法从第二流动相分离该目标寡核苷酸，该方法任选包括除去任何保护基、少量交换剂和/或置换剂物质等，如果需要的话。典型的分离技术包括脱保护基(若该寡核苷酸受保护)、脱盐(超滤)和冷冻干燥。经分离的目标寡核苷酸可接着接受任何可认为必须的进一步的纯化步骤，例如离子交换色谱法。

[0082] 现将通过仅参照下列附图的实施例的方式描述本发明。

[0083] 图1表示来自实验8的离开柱的第二流动相的UV色谱图。

[0084] 图2表示来自实验8的级分分析后的色谱图重建。

[0085] 图3表示来自实验21的级分分析后的色谱图重建。

[0086] 图4表示来自实验4的离开柱的第二流动相的UV色谱图。

[0087] 图5表示来自实验18的级分分析后的色谱图重建。

[0088] 如下表中所列进行了很多实验。在表中列为实验8和21的两个实验在下面详细描述。

[0089] 实验8

[0090] 根据以下方法制备液相。以体积比3:2:5混合乙酸乙酯、1-丁醇和水。将该双相系统沉降直至获得两个明显相，然后分离这些相。

[0091] 往顶相层(乙酸乙酯/丁醇，含有较小比例的水)加入Aliquat 336TM(交换剂物质)以获得40mM的浓度并将容器标为“固定相”，即第二液相。

[0092] 将底相(水/丁醇，含有较小比例的乙酸乙酯)分为两等份。往第一部分加入氢氧化钠以获得10mM的浓度，并将容器标为“第一流动相”，即第一液相。

[0093] 往底相的第二部分加入氢氧化钠以获得10mM的浓度以及碘化钾(置换剂物质)直至达到13.3mM的浓度，并将容器标为“第二流动相”，即第三液相。

[0094] 所使用的离心分配色谱(CPC)仪器是市场上可购的200ml Armen CPC仪。典型地此仪器包含由约20个圆形分配圆盘制成的旋转体。典型地可调节此仪器从200-2000rpm，在1000rpm下产生约120g的离心力且在2000rpm下产生480g的离心力)。将Kromaton FCPC200仪器设为下行模式。柱以1200rpm旋转。按照该仪器的规定操作条件采用来自“固定相”容器(第二液相加上Aliquat 336TM)的溶液以10mL/min的流速填充柱。典型地可使用市场上可购的Dionex P580HPG 4通道二元高压梯度泵(Sunnyvale，CA，USA)将固定相和流动相引入仪器中，典型地通过低压进样阀(例如Upchurch，CIL，Cluxeau，Saint-Foy-La-Grande，FR)，典型地配有21ml样品环。

[0095] 将受保护目标寡核苷酸的样品(20-mer RNA寡核苷酸5’-uca agg aag aug gca uuu ca-3’，但已知受到杂质污染，该杂质可能包含17-、18-、19-和/或21-mer杂质)(400mg)溶于第一流动相(10mL)中。一旦溶解，将10mL固定相液体(但不含交换剂物质)加至流动相中的此寡核苷酸溶液中以形成两相混合物。

[0096] 将目标寡核苷酸溶于第一流动相和固定相液体中的溶液混合物注入柱中，并以5mL/min的流速将此混合物泵送通过该柱20分钟。在此时已实现平衡，即不再有固定相通过流动的流动相洗脱出柱，且无目标寡核苷酸出柱，如通过使用HPLC分析流出该柱的洗脱液所检测的。

[0097] 然后以相同的流速泵送第二流动相(第三液相)100分钟。每分钟收集第二流动相的流出级分并离线分析。

[0098] 参照图1，接着将第一流动相和第二流动相引入柱中，起始时间＝0。在最初约17分钟中少量固定相从柱中置换。在约20分钟达到平衡且极少固定相被流动的第一流动相置换。20分钟后引入含有置换剂物质的第二流动液相。之后的峰代表洗脱被第二流动相从固定相中置换的物质。来自此峰的级分分析表明存在于所引入寡核苷酸中的杂质在此峰的初始和末端紧密堆积。图2表示来自实验8的级分分析后的色谱图重建。

[0099] 实验21

[0100] 溶剂体系由体积比分别为3:1:4的Me-THF/n-BuOH/水组成。将这三种液体混合并沉降为两相，将其分离。

[0101] 往上部有机相中加入Aliquat 336(交换剂物质)以获得40mM的浓度并将此有机相指定用作固定相。

[0102] 将下部水相分为两部分。往一部分中加入氢氧化钠以产生10mM的浓度，并将此部分称为第一流动相。往较低相第二部分中加入氢氧化钠以产生10mM的浓度以及苋菜红(置换剂物质)以产生4.4mM的浓度。将此部分称为第二流动相。

[0103] 将粗寡核苷酸样品(400mg，含有约88％的目标寡核苷酸，在35mL氨水中)和5mL称为固定相的溶剂体系上相部分(不含交换剂物质)混合。

[0104] 在1200rpm下旋转柱并以下行模式用固定相填充柱。然后当以5mL/min的速度泵送流动相1时将如上制备的样品装载柱上。泵送第一流动相10分钟，然后也以5mL/min的速度泵送第二流动相120分钟。每分钟收集级分。

[0105] 图3表示来自实验21的洗脱液的HPLC峰，“N DMT-off”表示不具有其DMT保护基的目标核苷酸，“N+1”和“N-1”表示也不具有DMT保护基的目标核苷酸+/-一个碱基，且imp 1-10表示分别对应于10种杂质的少量。看到杂质imp 1-10和N-1的洗脱几乎同时发生且在经纯化的目标寡核苷酸被第二流动相洗脱前已基本完成，且在引入第二流动相后约81至95分钟中>95％纯度的目标寡核苷酸被洗脱。N+1杂质的洗脱主要在目标峰的末端。

[0106] 进一步的实验

[0107] 实验1-31的详细情况表示在以下表格形式中。实验1是未使用交换剂或保留剂物质的对照。在实验12中认为无固定相被保留，因为二组分系统2-丁醇-水未形成密度具有差异的两相，以至于它们容易以很小的乳化倾向形成两个不同相。

[0108] 列中“寡核苷酸类型”P＝O是指寡核苷酸的磷酸二酯形式，且P＝S是指寡核苷酸的硫代磷酸形式。Al336表示Aliquat 336且BACl表示苯扎氯铵。在表示得自这些实验的数据中，设定目标纯度，计算具有该纯度的回收的目标产物的量。等速序列(Isotachic train)是指目标寡核苷酸以设定纯度被第二流动相洗脱的时间(分钟)。“MIBK”是甲基异丁基酮的缩写。“MtBE”是甲基叔丁基醚的缩写。“MeTHF”是2-甲基四氢呋喃的缩写。

[0109] 图4表示来自实验3的离开柱的第二流动相的UV色谱图，且图5表示来自实验18的级分分析后的色谱图重建。这些图中每个代表目标寡核苷酸的包络线(envelope)表示第二流动相的相当长的流动时间，大量经纯化目标寡核苷酸被洗脱并可使用常规技术从第二流动相分离。

[0110]

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[0112]