慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证动物模型的构建方法转让专利
申请号 : CN201410271759.3
文献号 : CN104000834B
文献日 : 2016-05-25
发明人 : 周杰 , 葛明 , 王营
申请人 : 周杰
摘要 :
本发明公开了一种病症结合的慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证动物模型的构建方法，包括以下步骤：取清洁级成年雄性SD大鼠，将大鼠置于净化笼中，温度为19-23℃，相对湿度40％-50％，自然采光，以大鼠标准饲料进行饲喂，自由饮水；适应性饲喂1周后，以每日所给饲料重量的0.2％的阿霉素进行灌胃，并以3.5mg/kg进行腹腔注射丙基硫氧嘧啶，每周1次，连续6周即得。本发明的有益效果是：能够很好地模拟慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证，即符合西医慢性心力衰竭的病理特性(如LVEF、LVFS显著降低，BNP增高)，又能够表现出中医心气虚兼血瘀水肿证候表现，复制方法稳定性、重复性好，简单客观。
权利要求 :
1.慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证动物模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：（1）取清洁级成年雄性SD大鼠，将大鼠置于净化笼中，温度为19-23℃，相对湿度40%-
50%，自然采光，以大鼠标准饲料进行饲喂，自由饮水；
（2）适应性饲喂1周后，以每日所给饲料重量的0.1%-0.3%的阿霉素进行灌胃；并以2-
5mg/kg进行腹腔注射丙基硫氧嘧啶，每周1次；连续6周即得。
2.根据权利要求1所述的慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证动物模型的构建方法，其特征在于，所述阿霉素以每日所给饲料重量的0.2%进行灌胃；丙基硫氧嘧啶以3.5mg/kg进行腹腔注射，每周1次。
3.根据权利要求1或2所述的慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证动物模型的构建方法，其特征在于，所述动物模型建模完成后，采用以下评价指标对动物模型进行评价：左室射血分数、左室内径缩短率、心率；心肌病理切片、心重指数；呼吸频率、肺重指数、肺脏病理切片；尿量；肝重指数、肝脏病理切片；力竭性游泳试验；耳温、血清BNP、T3、T4、TSH；上述评价指标均采用盲法检测；
所述评价的具体方法如下：
（1）在建模前、后分别测量大鼠左室射血分数、左室内径缩短率、心率、呼吸频率、尿量、耳温和力竭性游泳试验；
（2）建模结束后，腹主动脉取血后，分离血清，并在-80℃的条件下保持，剖取心脏、肺脏、肝脏，洗去残血，滤纸吸干，称量后计算出心重指数、肺重指数、肝重指数；
（3）取少量左室肌、肺脏、肝脏标本，福尔马林固定，HE染色后，采用盲法在显微镜下观察并镊片，通过ELISA法检测血清BNP、T3、T4、TSH；
若与建模前相比，建模后大鼠左室射血分数减少率大于等于50%，左室内径缩短率减少率大于等于50%，心率增加量大于等于50次/分，呼吸频率增加量大于等于20次/分，尿量减少量大于等于4ml/24h，耳温降低量大于等于0.5℃，力竭性游泳试验的时间减少量大于等于55min；
若建模后，大鼠血清BNP含量大于等于70hg/L，T3含量小于等于43.5ng/ml，T4含量小于等于60ng/ml，TSH含量大于等于25ng/ml；
若建模后，心重指数至少为5.5g/kg、肺重指数至少为5.5g/kg、肝重指数至少为30g/kg；
同时满足上述条件，则慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证的动物模型建模成功。
4.根据权利要求3所述的慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证动物模型的构建方法，其特征在于，所述左室射血分数、左室内径缩短率均采用Teichholz法测量；心率采用无创套尾法监测。
5.根据权利要求3所述的慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证动物模型的构建方法，其特征在于，所述呼吸频率的测量方法为上午8-10点熟睡时，记录20s呼吸次数，最终结果乘以3。
6.根据权利要求3所述的慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证动物模型的构建方法，其特征在于，所述尿量的检测方法为：统一灌胃5ml水后，收集24小时代谢笼尿液。
7.根据权利要求3所述的慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证动物模型的构建方法，其特征在于，所述力竭性游泳的方法为：大鼠连续反复下沉，沉入水下三次，每次超过5s时间，至力竭为止，统计游泳的总时间。
8.一种慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证动物模型的评价方法，其特征在于，采用以下评价指标对动物模型进行评价：左室射血分数（LVEF）、左室内径缩短率（LVFS）、心率；心肌病理切片、心重指数；呼吸频率、肺重指数、肺脏病理切片；尿量；肝重指数、肝脏病理切片；力竭性游泳试验；耳温、血清BNP、T3、T4、TSH；上述评价指标均采用盲法检测；
所述评价的具体方法如下：
（1）在建模前、后分别测量大鼠左室射血分数、左室内径缩短率、心率、呼吸频率、尿量、耳温和力竭性游泳试验；
（2）建模结束后，腹主动脉取血后，分离血清，并在-80℃的条件下保持，剖取心脏、肺脏、肝脏，洗去残血，滤纸吸干，称量后计算出心重指数、肺重指数、肝重指数；
（3）取少量左室肌、肺脏、肝脏标本，福尔马林固定，HE染色后，采用盲法在显微镜下观察并镊片，通过ELISA法检测血清BNP、T3、T4、TSH；
若与建模前相比，建模后大鼠左室射血分数减少率大于等于50%，左室内径缩短率减少率大于等于50%，心率增加量大于等于50次/分，呼吸频率增加量大于等于20次/分，尿量减少量大于等于4ml/24h，耳温降低量大于等于0.5℃，力竭性游泳试验的时间减少量大于等于55min；
若建模后，大鼠血清BNP含量大于等于70hg/L，T3含量小于等于43.5ng/ml，T4含量小于等于60ng/ml，TSH含量大于等于25ng/ml；
若建模后，心重指数至少为5.5g/kg、肺重指数至少为5.5g/kg、肝重指数至少为30g/kg；
同时满足上述条件，则慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证的动物模型建模成功。
9.根据权利要求8所述的慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证动物模型的评价方法，其特征在于，所述左室射血分数、左室内径缩短率均采用Teichholz法测量；心率采用无创套尾法监测；呼吸频率的测量方法为上午8-10点熟睡时，记录20s呼吸次数，最终结果乘以3；
尿量的检测方法为：统一灌胃5ml水后，收集24小时代谢笼尿液；力竭性游泳的方法为：大鼠连续反复下沉，沉入水下三次，每次超过5s时间，至力竭为止，统计游泳的总时间。
说明书 :
慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证动物模型的构建方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种动物模型的构建方法，尤其涉及一种病证结合的慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证动物模型的构建方法。
背景技术
[0002] 慢性心力衰竭是一种临床表现错综复杂的综合征，可以稳定、失代偿或恶化。中医理论认为：心衰病位主要在心，但与其他四脏相关联，其病机始动因素在于年老体虚、膏粱厚味、忧愁思虑、劳倦内伤等所致的脾失健运或脾气亏虚。然脾土生于心火，子病可及母，故脾失健运可诱发和加重心力衰竭的发生。
[0003] 慢性心力衰竭中医证候规律演变初期，首先表现为心气虚证或心气亏虚，症见心悸气短，胸闷自汗，动则加重，倦怠懒言，舌淡或有齿痕，苔薄白，脉弱或结代；其次演变发展为心气虚兼阴虚证，症见心悸气短，五心烦热，盗汗少寐，伴或不伴眩晕耳鸣，口干欲饮，舌红少苔或有裂痕，脉沉细。慢性心力衰竭后期，中医证候规律演变为心气亏虚兼血瘀证，症见唇口紫绀，胁下积聚，颈脉怒张，或见胸部刺痛，伴有或不伴有胸闷气短，乏力自汗，倦怠懒言。舌质紫暗，或有瘀斑，舌下络脉青紫，脉沉涩或结代；进而恶化形成心气亏虚兼血瘀水肿证，症见心悸气短，全身浮肿，尿少肢肿，颈脉显露，胁下积聚，甚则喘息不得卧，甚或汗出湿冷，四肢厥逆，舌质暗淡或绛紫，苔白滑，脉沉细，甚则脉微欲绝。
[0004] 动物实验是连接医学基础与临床的桥梁与纽带，而证候是中医的核心和灵魂，所以研发病证结合的动物模型是中医基础实验研究的必要手段。目前还未见有慢性心力衰竭
心气虚兼血瘀水肿证动物模型的研究。虽然有采用阿霉素给大鼠隔日腹腔注射制作慢性心
衰模型，但是不能完全模拟慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证，如胸痛、胸闷憋气、胁下痞块、浮肿尿少、形寒肢冷等。为了进一步深入探讨慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证本质及探寻其有效治疗中药，很有必要进行慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证动物模型的，建立
和评价研究，为研究中医药在防治慢性心力衰竭中的疗效及作用机制提供必要的实验基
础。
心气虚兼血瘀水肿证动物模型的研究。虽然有采用阿霉素给大鼠隔日腹腔注射制作慢性心
衰模型，但是不能完全模拟慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证，如胸痛、胸闷憋气、胁下痞块、浮肿尿少、形寒肢冷等。为了进一步深入探讨慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证本质及探寻其有效治疗中药，很有必要进行慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证动物模型的，建立
和评价研究，为研究中医药在防治慢性心力衰竭中的疗效及作用机制提供必要的实验基
础。
发明内容
[0005] 针对现有技术的不足，本发明提供了一种病证结合的慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证动物模型的构建方法，能够很好地模拟慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证的SD大鼠
模型，即符合西医慢性心力衰竭的病理特征(LVEF、LVFS显著降低，BNP增高)，又能够表现出心悸气短、胸闷憋气、胁下痞块、浮肿尿少、形寒肢冷的中医心气虚兼血瘀水肿证候表现。复制方法稳定性、重复性好，简单客观。为研究中医药在防治慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证中的疗效及作用机制提供必要的实验基础。
模型，即符合西医慢性心力衰竭的病理特征(LVEF、LVFS显著降低，BNP增高)，又能够表现出心悸气短、胸闷憋气、胁下痞块、浮肿尿少、形寒肢冷的中医心气虚兼血瘀水肿证候表现。复制方法稳定性、重复性好，简单客观。为研究中医药在防治慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证中的疗效及作用机制提供必要的实验基础。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供了一种慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证动物模型的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
[0007] （1）取清洁级成年雄性SD大鼠，将大鼠置于净化笼中，温度为19-23℃，相对湿度40%-50%，自然采光，以大鼠标准饲料进行饲喂，自由饮水；
[0008] （2）适应性饲喂1周后，以每日所给饲料重量的0.1%-0.3%的阿霉素进行灌胃；并以2-5mg/kg进行腹腔注射丙基硫氧嘧啶，每周1次；连续6周即得。
[0009] 所述阿霉素优选地以每日所给饲料重量的0.2%进行灌胃；丙基硫氧嘧啶优选地以3.5mg/kg进行腹腔注射，每周1次。
[0010] 所述动物模型建模完成后，采用以下评价指标对动物模型进行评价：左室射血分数、左室内径缩短率、心率；心肌病理切片、心重指数；呼吸频率、肺重指数、肺脏病理切片；
尿量；肝重指数、肝脏病理切片；力竭性游泳试验；耳温、血清BNP、T3、T4、TSH；上述评价指标均采用盲法检测；
尿量；肝重指数、肝脏病理切片；力竭性游泳试验；耳温、血清BNP、T3、T4、TSH；上述评价指标均采用盲法检测；
[0011] 所述评价的具体方法如下：
[0012] （1）在建模前、后分别测量大鼠左室射血分数、左室内径缩短率、心率、呼吸频率、尿量、耳温和力竭性游泳实验；
[0013] （2）建模结束后，腹主动脉取血后，分离血清，并在-80℃的条件下保持，剖取心脏、肺脏、肝脏，洗去残血，滤纸吸干，称量后计算出心重指数、肺重指数、肝重指数；
[0014] （3）取少量左室肌、肺脏、肝脏标本，福尔马林固定，HE染色后，采用盲法在显微镜下观察并镊片，通过ELISA法检测血清BNP、T3、T4、TSH；
[0015] 若与建模前相比，建模后大鼠左室射血分数减少率大于等于50%，左室内径缩短率减少率大于等于50%，心率增加量大于等于50次/分，呼吸频率增加量大于等于20次/分，尿量减少量大于等于4ml/24h，耳温降低量大于等于0.5℃，力竭性游泳试验的时间减少量大
于等于55min；
于等于55min；
[0016] 若建模后，大鼠血清BNP含量大于等于70hg/L，T3含量小于等于43.5ng/ml，T4含量小于等于60ng/ml，TSH含量大于等于25ng/ml；
[0017] 若建模后，心重指数至少为5.5g/kg、肺重指数至少为5.5g/kg、肝重指数至少为30g/kg；
[0018] 同时满足上述条件，则慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证的动物模型建模成功。
[0019] 所述左室射血分数（LVEF）、左室内径缩短率（LVFS）均采用Teichholz法测量；心率采用无创套尾法监测；呼吸频率的测量方法为上午8-10点熟睡时，记录20s呼吸次数，最终结果乘以3；尿量的检测方法为：统一灌胃5ml水后，收集24小时代谢笼尿液；力竭性游泳的方法为：大鼠连续反复下沉，沉入水下三次，每次超过5s时间，至力竭为止，统计游泳的总时间。
[0020] 本发明还提供了一种慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证动物模型的评价方法，所述评价方法采用以下评价指标对动物模型进行评价：LVEF、LVFS、心率；心肌病理切片、心重指数；呼吸频率、肺重指数、肺脏病理切片；尿量；肝重指数、肝脏病理切片；力竭性游泳试验；耳温、血清BNP、T3、T4、TSH；上述评价指标均采用盲法检测；
[0021] 所述评价的具体方法如下：
[0022] （1）在建模前、后分别测量大鼠LVEF、LVFS、心率、呼吸频率、尿量、耳温和力竭性游泳实验；
[0023] （2）建模结束后，腹主动脉取血后，分离血清，并在-80℃的条件下保持，剖取心脏、肺脏、肝脏，洗去残血，滤纸吸干，称量后计算出心重指数、肺重指数、肝重指数；
[0024] （3）取少量左室肌、肺脏、肝脏标本，福尔马林固定，HE染色后，采用盲法在显微镜下观察并镊片，通过ELISA法检测血清BNP、T3、T4、TSH；
[0025] 若与建模前相比，建模后大鼠左室射血分数减少率大于等于50%，左室内径缩短率减少率大于等于50%，心率增加量大于等于50次/分，呼吸频率增加量大于等于20次/分，尿量减少量大于等于4ml/24h，耳温降低量大于等于0.5℃，力竭性游泳试验的时间减少量大
于等于55min；
于等于55min；
[0026] 若建模后，大鼠血清BNP含量大于等于70hg/L，T3含量小于等于43.5ng/ml，T4含量小于等于60ng/ml，TSH含量大于等于25ng/ml；
[0027] 若建模后，心重指数至少为5.5g/kg、肺重指数至少为5.5g/kg、肝重指数至少为30g/kg；
[0028] 同时满足上述条件，则慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证的动物模型建模成功。
[0029] 所述LVEF、LVFS均采用Teichholz法测量；心率采用无创套尾法监测；呼吸频率的测量方法为上午8-10点熟睡时，记录20s呼吸次数，最终结果乘以3；尿量的检测方法为：统一灌胃5ml水后，收集24小时代谢笼尿液；力竭性游泳的方法为：大鼠连续反复下沉，沉入水下三次，每次超过5s时间，至力竭为止，统计游泳的总时间。
[0030] 本发明的有益效果是：与传统慢性心力衰竭的动物模型相比，本发明采用双重因子攻击法构建的动物模型，能够很好地模拟慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证，即符合西
医慢性心力衰竭的病理特征(LVEF、LVFS显著降低，BNP增高)，又能够表现出心悸气短、胸闷憋气、胁下痞块、浮肿尿少、形寒肢冷的中医心气虚兼血瘀水肿证候表现。复制方法稳定性、重复性好，简单客观。为研究中医药在防治慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证中的疗效及
作用机制提供必要的实验基础。
医慢性心力衰竭的病理特征(LVEF、LVFS显著降低，BNP增高)，又能够表现出心悸气短、胸闷憋气、胁下痞块、浮肿尿少、形寒肢冷的中医心气虚兼血瘀水肿证候表现。复制方法稳定性、重复性好，简单客观。为研究中医药在防治慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证中的疗效及
作用机制提供必要的实验基础。
附图说明
[0031] 图1为本发明实施例4中，建模后Control组大鼠的二维超声心动图（a）、M超声心动图（b）；
[0032] 图2为本发明实施例4中，建模后PTU组大鼠的二维超声心动图（a）、M超声心动图（b）；
[0033] 图3为本发明实施例4中，建模后ADR组大鼠的二维超声心动图（a）、M超声心动图（b）；
[0034] 图4为本发明实施例4中，建模后ADR+PTU组大鼠的二维超声心动图（a）、M超声心动图（b）；
[0035] 图5为本发明实施例4中，Control组大鼠心肌、肺脏、肝脏病理切片结果，（a）左心室肌×400倍；（b）肺脏×400倍；（c）肝脏×400倍；
[0036] 图6为本发明实施例4中，PTU组大鼠心肌、肺脏、肝脏病理切片结果（，a）左心室肌×400倍；（b）肺脏×400倍；（c）肝脏×400倍；
[0037] 图7为本发明实施例4中，ADR组大鼠心肌、肺脏、肝脏病理切片结果（，a）左心室肌×400倍；（b）肺脏×400倍；（c）肝脏×400倍；
[0038] 图8为本发明实施例4中，ADR+PTU组大鼠心肌、肺脏、肝脏病理切片结果，（a）左心室肌×400倍；（b）肺脏×400倍；（c）肝脏×400倍。
具体实施方式
[0039] 在病证结合动物模型研发的过程中，由于动物和人体之间的差异性，如语言表述症状、舌象、脉象、肤色和情志症状等，决定了中医证候在动物身上模拟与判断的难度较大。
因此，本发明采纳西医病理造模因素与中医证候造模因素相叠加的思路，充分发掘动物身
上具有的具有诊断意义的信息特征，结合精确、量化的现代生理病理生化指标，再与中医证候诊断标准进行整合对比、等效关联，或许是实现人体与动物证候信息相互转换的重要途
径。
因此，本发明采纳西医病理造模因素与中医证候造模因素相叠加的思路，充分发掘动物身
上具有的具有诊断意义的信息特征，结合精确、量化的现代生理病理生化指标，再与中医证候诊断标准进行整合对比、等效关联，或许是实现人体与动物证候信息相互转换的重要途
径。
[0040] 本发明采纳疾病造模因素与证候造模因素相叠加的思路，利用阿霉素与丙基硫氧嘧啶双重药物攻击的方法，在造成大鼠慢性心力衰竭疾病的同时形成心气虚兼血瘀水肿证
的表现。其中阿霉素可造成剂量依赖性不可逆的慢性心肌损害，已经广泛应用于慢性心力
衰竭大鼠的造模，在中医研究中，证实其与心气（阳）虚以及气虚血瘀证都有一定的关联性。
丙基硫氧嘧啶通过甲状腺功能过度抑制，不仅从血流动力学方面使心率减慢，心肌收缩力
下降，心排量减低，还能造成甲减性心脏损伤，研究显示，甲减可导致心肌细胞间黏蛋白和黏多糖的沉淀，造成心肌间质水肿，心肌松弛，心肌动脉血管壁增厚，严重时导致心肌细胞坏死和凋亡；另一方面，丙基硫氧嘧啶可以提高动物对胆固醇的吸收能力，使大鼠发生动脉粥样硬化的几率增加，严重者影响心肌供血，进一步加重心衰。
的表现。其中阿霉素可造成剂量依赖性不可逆的慢性心肌损害，已经广泛应用于慢性心力
衰竭大鼠的造模，在中医研究中，证实其与心气（阳）虚以及气虚血瘀证都有一定的关联性。
丙基硫氧嘧啶通过甲状腺功能过度抑制，不仅从血流动力学方面使心率减慢，心肌收缩力
下降，心排量减低，还能造成甲减性心脏损伤，研究显示，甲减可导致心肌细胞间黏蛋白和黏多糖的沉淀，造成心肌间质水肿，心肌松弛，心肌动脉血管壁增厚，严重时导致心肌细胞坏死和凋亡；另一方面，丙基硫氧嘧啶可以提高动物对胆固醇的吸收能力，使大鼠发生动脉粥样硬化的几率增加，严重者影响心肌供血，进一步加重心衰。
[0041] 下面结合附图对本发明提供的具体实施方式做详细说明。
[0042] 实施例1
[0043] 本发明实施例提供了一种慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证动物模型的构建方法，包括以下步骤：
[0044] （1）取清洁级成年雄性SD大鼠，将大鼠置于净化笼中，温度为19-23℃，相对湿度40%-50%，自然采光，以大鼠标准饲料进行饲喂，自由饮水；
[0045] （2）适应性饲喂1周后，以每日所给饲料重量的0.2%的阿霉素进行灌胃；并以3.5mg/kg进行腹腔注射丙基硫氧嘧啶，每周1次；连续6周即得。
[0046] 实施例2
[0047] 本发明实施例提供了一种慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证动物模型的构建方法，包括以下步骤：
[0048] （1）取清洁级成年雄性SD大鼠，将大鼠置于净化笼中，温度为19℃，相对湿度40%，自然采光，以大鼠标准饲料进行饲喂，自由饮水；
[0049] （2）适应性饲喂1周后，以每日所给饲料重量的0.1%的阿霉素进行灌胃；并以2.5mg/kg进行腹腔注射丙基硫氧嘧啶，每周1次；连续6周即得。
[0050] 实施例3
[0051] 本发明实施例提供了一种慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证动物模型的构建方法，包括以下步骤：
[0052] （1）取清洁级成年雄性SD大鼠，将大鼠置于净化笼中，温度为23℃，相对湿度50%，自然采光，以大鼠标准饲料进行饲喂，自由饮水；
[0053] （2）适应性饲喂1周后，以每日所给饲料重量的0.3%的阿霉素进行灌胃；并以4.5mg/kg进行腹腔注射丙基硫氧嘧啶，每周1次；连续6周即得。
[0054] 实施例4
[0055] 1 材料与方法
[0056] 1.1实验动物及分组
[0057] 清洁级成年雄性SD大鼠40只，体重200±15g，购自北京维通利华动物实验公司，动物合格证号：SCXK（京）2012-0001，每笼1只，室温19-23℃，相对湿度40%～50%，自然采光，以大鼠标准饲料进行喂养，自由饮水。适应性喂养1周后按体质量编号，并按随机数字表法分为4组，分别为A组：正常对照(Control)组（n＝10只），B组：丙基硫氧嘧啶（PTU）组（n＝10只），C组：阿霉素(ADR)组（n＝10只），D组：丙基硫氧嘧啶+阿霉素（PTU+ADR）组（n＝10只）。
[0058] 1.2造模药物
[0059] 阿霉素（注射用盐酸多柔比星）10mg/瓶，浙江海正药业股份有限公司生产，批准文号：国药准字H33021980；丙基硫氧嘧啶片50mg/片，苏州东瑞制药有限公司生产，批准文号：国药准字H20013331。
[0060] 1.3仪器
[0061] VisualSonics Vevo770型小动物心脏超声成像系统，加拿大VisualSonics公司生产；Softron BP-2010A大鼠智能无创心率仪，北京软隆生物技术有限公司生产；德国Braun IRT4520耳温计，德国博朗公司生产；Multiskan MK3酶标仪，美国Thermo公司生产；Lica DM4000B正置生物显微镜，德国Leica仪器有限公司生产。
[0062] 1.4试剂
[0063] B型脑钠肽(BNP)ELISA试剂盒、三碘甲腺原氨酸(T3) ELISA试剂盒、四碘甲腺原氨酸(T4)ELISA试剂盒、促甲状腺激素(TSH)ELISA试剂盒，购自美国R&D公司。
[0064] 1.5造模方法
[0065] Control组：生理盐水注射并灌胃6周；
[0066] PTU组：PTU灌胃并生理盐水注射6周；
[0067] ADR组：生理盐水灌胃并ADR注射6周；
[0068] ADR+PTU组：PTU灌胃并ADR注射6周，其中PTU以每日所给饲料重量的0.2%进行灌胃6周；ADR以3.5mg/kg行腹腔注射，每周1次，连续6周。
[0069] 2. 检测指标及方法
[0070] 2.1证候指标整合判定策略 采用大鼠生理病理指标检测的方法对各组大鼠诊断信息进行整合判定，中医慢性心力衰竭心气虚兼血虚水肿证辨证标准参照2003年版《中药
新药治疗心力衰竭的临床研究指导原则（试行）》制定。将该辨证标准与大鼠诊断信息进行整合对比、等效关联，见表1。并观察大鼠鼻色、爪甲以及毛色、精神状态等一般情况。
新药治疗心力衰竭的临床研究指导原则（试行）》制定。将该辨证标准与大鼠诊断信息进行整合对比、等效关联，见表1。并观察大鼠鼻色、爪甲以及毛色、精神状态等一般情况。
[0071] 表1心气虚兼血瘀水肿证辨证标准与大鼠诊断信息整合对应表
[0072]辨证标准 心悸 胸痛 胸闷气喘 浮肿尿少 胁下积痞 疲劳乏力 形寒肢冷
大鼠诊断 心率 心肌病理切片、 呼吸频率、肺重指 尿量、水肿 肝重指数、肝脏 力竭性游泳 耳温、T3、T4、TSH信息 心重指数 数、肺脏病理切片 情况 病理切片 试验
大鼠诊断 心率 心肌病理切片、 呼吸频率、肺重指 尿量、水肿 肝重指数、肝脏 力竭性游泳 耳温、T3、T4、TSH信息 心重指数 数、肺脏病理切片 情况 病理切片 试验
[0073] 2.2 检测方法 全部指标采用盲法检测。于造模前、后分别测量大鼠左室射血分数(LVEF)、左室内径缩短率(LVFS（) VisualSonics Vevo770型小动物心脏超声成像仪检测）、心率（采用无创套尾法监测）、呼吸频率（上午8～10时熟睡时，记录20秒呼吸次数，结果乘
3）、尿量(统一灌胃5ml水后，收集24小时代谢笼尿液)、耳温（耳温计）、力竭性游泳实验（大鼠连续反复下沉，沉入水下三次，每次超过5秒时间）。腹主动脉取血后，分离血清，-80℃保存；剖取心脏、肺脏、肝脏，洗去残血，滤纸吸干，称量计算心重指数、肺重指数、肝重指数（内脏质量/体重）。取少量左室肌、肺脏、肝脏标本，福尔马林固定，HE染色后，以盲法显微镜下观察并摄片；通过ELISA法检测血清BNP、T3、T4、TSH。
3）、尿量(统一灌胃5ml水后，收集24小时代谢笼尿液)、耳温（耳温计）、力竭性游泳实验（大鼠连续反复下沉，沉入水下三次，每次超过5秒时间）。腹主动脉取血后，分离血清，-80℃保存；剖取心脏、肺脏、肝脏，洗去残血，滤纸吸干，称量计算心重指数、肺重指数、肝重指数（内脏质量/体重）。取少量左室肌、肺脏、肝脏标本，福尔马林固定，HE染色后，以盲法显微镜下观察并摄片；通过ELISA法检测血清BNP、T3、T4、TSH。
[0074] 2.3统计学处理 资料用均数加减标准差( ±s) 表示。采用 SPSS16.0 软件进行四组大鼠数据单因素方差分析。方差齐性检验具有齐次性时选择Tukey检验进行配对比较；
不具齐次性时选用Games-Howell检验进行配对比较。P＜0.05 为有显著性差异，P＜0.01
为有非常显著性差异，P＞0.05 为无显著性差异。均采用双尾检验。
不具齐次性时选用Games-Howell检验进行配对比较。P＜0.05 为有显著性差异，P＜0.01
为有非常显著性差异，P＞0.05 为无显著性差异。均采用双尾检验。
[0075] 3.实验结果
[0076] 3.1一般情况 造模过程中，Control组及PTU组无大鼠死亡，第37天ADR组死亡1只，第34天与第39天，ADR+PTU组死亡共2只。解剖3只死亡大鼠均发现肝大、腹水，尸检结果显示心力衰竭。与其他组比较，ADR+PTU组症状最重，给药1周出现饮食量减少，生长缓慢，3周后出现精神萎靡，活动力下降，喜欢聚团，毛色枯槁，爪甲紫绀，呼吸加快，时有便溏，造模第5周后全部陆续出现了阴部、四肢水肿，甚则蛙状腹。实验终点时，共存活大鼠37只。
[0077] 3.2 慢性心力衰竭疾病模拟的评价
[0078] 如表2所示，造模前四组大鼠之间LVEF与LVFS分别经F-检验（P=0.346，P=0.115），无显著性差异（P＞0.05），故具可比性。
[0079] 3.2.1超声心动图结果
[0080] 经6周造模后，二维超声心动图及M超声心动图显示：三个造模组大鼠的左室收缩功能都有不同程度的下降，如图1所示。
[0081] 3.2.1.1 LVEF、LVFS和血清BNP浓度
[0082] 表2 四组大鼠心脏超声LVEF、LVFS值及BNP血浓度比较（ ±s）
[0083]
[0084] 注：造模后与Control组比较，☆☆P＜0.01，☆P＜0.05；与ADR组比较，△△P＜0.01，△P＜0.05；与PTU组比较，**P＜0.01，*P＜0.05。
[0085] 造模后，与Control组比较，三个造模组的LVEF均明显降低（P均=0.000），具有非常显著性差异（P均＜0.01）；与ADR组比较，PTU组LVEF明显减低（P=0.000），具有非常显著性差异（P＜0.01），ADR+PTU组的LVEF减低（P=0.010），具有显著性差异（P＜0.05）；与PTU组比较，ADR组、ADR+PTU组的LVEF均明显减低（P均=0.000），具有非常显著性差异（P均＜0.01）。
[0086] 造模后，与Control组比较，三个造模组的LVFS均明显降低（P均=0.000），具有非常显著性差异（P均＜0.01）；与ADR组比较，PTU组、ADR+PTU组LVFS均明显降低（P=0.000，P=0.005），具有非常显著性差异（P均＜0.01）；与PTU组比较，ADR组、ADR+PTU组LVFS均明显降低（P均=0.000），具有非常显著性差异（P均＜0.01）。提示三种造模方法中ADR+PTU组的LVEF、LVFS值最低。
[0087] 3.2.2 血清BNP浓度结果
[0088] 如表2所示，与Control组比较，ADR组、PTU组BNP浓度均升高（P=0.010，P=0.026），具有显著性差异（P均＜0.05），ADR+PTU组明显升高（P=0.003），具有非常显著性差异（P＜0.01）；与ADR组、PTU组分别比较，ADR+PTU组BNP增高（P=0.027， P=0.016），具有显著性差异（P均＜0.05）。其中，三种造模方法中ADR+PTU组的血清BNP浓度值最高。
[0089] 结合超声心功能与BNP结果， ADR+PTU法较其它2种方法更显著地减低大鼠左室整体与半径收缩功能，能够更好地模拟SD大鼠慢性心力衰竭疾病。
[0090] 3.3心气虚兼血瘀水肿证证候模拟的评价
[0091] 3.3.1心率及呼吸频率结果
[0092] 如表3所示，造模前四组大鼠之间心率经F-检验（P＝0.854），故具可比性；造模前经F-检验，四组大鼠之间呼吸频率（P＝0.753），故具可比性。
[0093] 表3 四组大鼠心率与呼吸频率结果比较（ ±s）
[0094]
[0095] 注：造模后与Control组比较，☆☆P＜0.01，☆P＜0.05；与ADR组比较，△△P＜0.01，△P＜0.05；与PTU组比较，**P＜0.01，*P＜0.05
[0096] 造模后与Control组比较，ADR组心率增加不明显（P＝0.313），无显著性差异（P＞0.05），PTU组心率降低（P＝0.023），具有显著性差异（P＜0.05），ADR+PTU组心率增加（P＝
0.007），具有非常显著性差异（P＜0.01）。与PTU组比较，ADR+PTU组心率明显增加（P＝
0.000），具有非常显著性差异（P＜0.01）；与ADR组比较，ADR+PTU组心率无显著增加（P＝
0.367），无显著性差异（P＞0.05）。因此，ADR+PTU造模法可增加心衰大鼠心率，能够模拟心气虚兼血瘀水肿证的心悸症状，但与ADR造模法比较无明显优势。
0.007），具有非常显著性差异（P＜0.01）。与PTU组比较，ADR+PTU组心率明显增加（P＝
0.000），具有非常显著性差异（P＜0.01）；与ADR组比较，ADR+PTU组心率无显著增加（P＝
0.367），无显著性差异（P＞0.05）。因此，ADR+PTU造模法可增加心衰大鼠心率，能够模拟心气虚兼血瘀水肿证的心悸症状，但与ADR造模法比较无明显优势。
[0097] 造模后，与Control组比较，ADR组呼吸频率无显著增加（P＝0.110），无显著性差异（P＞0.05），ADR+PTU组呼吸频率增加（P＝0.043），具有显著性差异（P＜0.05），PTU组呼吸频率明显降低（P＝0.005），具有非常显著性差异（P＜0.01）。与PTU组比较，ADR+PTU组呼吸频率明显增加（P＝0.004），具有非常显著性差异（P＜0.01），但ADR+PTU组与ADR组比较增加不明显（P＝0.608），无显著性差异（P＞0.05），ADR+PTU造模法可增加心衰大鼠呼吸频率，但与ADR造模法比较无明显优势。
[0098] 3.3.2 尿量及力竭性游泳试验结果
[0099] 表4 四组大鼠尿量及力竭性游泳试验结果比较（ ±s）
[0100]
[0101] 注：造模后与Control组比较，☆☆P＜0.01，☆P＜0.05；与ADR组比较，△△P＜0.01，△P＜0.05；与PTU组比较，**P＜0.01，*P＜0.05
[0102] 如表4所示，造模前四组大鼠之间尿量F-检验为（P=0.700），具有可比性；造模前四组大鼠之间力竭性游泳试验经F-检验（P＝0.753），故具可比性。
[0103] 造模后，与Control组比较，其余三组尿量明显减少（P均=0.000），具有非常显著性差异（P均＜0.01）；与ADR组比较，ADR+PTU组尿量减少（P=0.018），具有显著性差异（P＜0.05）；与PTU组比较，ADR+PTU组尿量明显减少（P=0.000），具有非常显著性差异（P＜0.01）。
说明三种造模方法中ADR+PTU组尿量最少，结合大鼠外观皆出现了蛙状腹、四肢阴部水肿，本发明的构建方法可较好的模拟心气虚兼血瘀水肿证的尿少水肿症状。
说明三种造模方法中ADR+PTU组尿量最少，结合大鼠外观皆出现了蛙状腹、四肢阴部水肿，本发明的构建方法可较好的模拟心气虚兼血瘀水肿证的尿少水肿症状。
[0104] 造模后，与Control组比较，ADR组与ADR+PTU组力竭性游泳试验时间明显缩短（P均＝0.000），具有非常显著性差异（P＜0.01），PTU组力竭性游泳试验时间无差异（P＝0.483），无显著性差异（P＞0.05）；与PTU组比较，ADR+PTU组力竭性游泳试验时间明显缩短（P＝0.000），具有非常显著性差异（P＜0.01）；但ADR+PTU组与ADR组比较力竭性游泳试验时间减少无差异（P＝0.264），无显著性差异（P＞0.05）。说明ADR+PTU造模法可减少心衰大鼠力竭性游泳试验时间，可以模拟心气虚兼血瘀水肿证的疲劳乏力症状，但与ADR造模法比较无明显优势。
[0105] 3.3.3 耳温、T3、T4、TSH结果
[0106] 表5 四组大鼠耳温、T3、T4、TSH血浓度比较（ ±s）
[0107]
[0108] 注：造模后与Control组比较，☆☆P＜0.01，☆P＜0.05；与ADR组比较，△△P＜0.01，△P＜0.05；与PTU组比较，**P＜0.01，*P＜0.05
[0109] 如表5示，造模前四组大鼠之间耳温经F-检验分别为（P＝0.668），故具可比性。造模后与Control组比较，PTU组耳温降低（P＝0.022），具有显著性差异（P＜0.05），ADR+PTU组耳温明显降低（P＝0.001），具有非常显著性差异（P＜0.01），ADR组耳温稍降低（P＝0.825），无显著性差异（P＞0.05）；与ADR组比较，PTU组耳温降低（P＝0.050），具有显著性差异（P＜0.05），ADR+PTU组耳温明显降低（P＝0.001），具有非常显著性差异（P＜0.01）；与PTU组比较，ADR+PTU组耳温稍降低（P＝0.994），无显著性差异（P＞0.05）。
[0110] 造模后与Control组比较，ADR组T3降低（P＝0.028），具有显著性差异（P＜0.05），PTU组、ADR+PTU组T3均明显降低（P均＝0.000），具有非常显著性差异（P均＜0.01）；与ADR组比较，PTU组、ADR+PTU组T3降低（P＝0.021，P＝0.041），具有显著性差异（P均＜0.05）；但与PTU组比较，ADR+PTU组T3稍降低（P＝0.970），无显著性差异（P＞0.05）。
[0111] 造模后与Control组比较，PTU组、ADR+PTU组T4明显降低（P均＝0.000），具有非常显著性差异（P均＜0.01），ADR组无差异（P＝0.300），无显著性差异（P＞0.05）；但与ADR组、PTU组分别比较，ADR+PTU组T4明显降低（P＝0.000，P＝0.003），具有非常显著性差异（P均＜0.01）。
[0112] 造模后与Control组比较，PTU组、ADR+PTU组TSH均明显增加（P均＝0.000），具有非常显著性差异（P均＜0.01），ADR组TSH无差异（P＝1.000），无显著性差异（P＞0.05）；与ADR组比较，PTU组、ADR+PTU组TSH明显增加（P均＝0.000），具有非常显著性差异（P均＜0.01）；与PTU组比较，ADR组TSH明显减低（P＝0.000），具有非常显著性差异（P均＜0.01），ADR+PTU组TSH稍增加（P＝0.059），无显著性差异（P＞0.05）。结合上述耳温、T3、T4、TSH四项指标，提示ADR+PTU造模法可以模拟心气虚兼血瘀水肿证的形寒肢冷症状，明显优于ADR造模法。
[0113] 3.3.4心重指数、肺重指数、肝重指数
[0114] 表6 四组大鼠心重指数、肺重指数、肝重指数结果比较
[0115]分组 心重指数（g/kg） 肺重指数（g/kg） 肝重指数（g/kg）
Control组 3.79±0.95 (10) 4.47±0.67 (10) 24.70±3.94(10)
ADR组 5.43±0.85 (10)☆☆ 5.15±1.05 (9) 27.75±4.82 (9)
PTU组 4.83±1.24 (10) 4.89±0.57(10) 29.92±5.27 (10)
ADR+PTU组 6.17±0.94 (10)☆☆* 6.41±1.22 (8)☆☆△** 39.32±7.94 (8)☆☆△
Control组 3.79±0.95 (10) 4.47±0.67 (10) 24.70±3.94(10)
ADR组 5.43±0.85 (10)☆☆ 5.15±1.05 (9) 27.75±4.82 (9)
PTU组 4.83±1.24 (10) 4.89±0.57(10) 29.92±5.27 (10)
ADR+PTU组 6.17±0.94 (10)☆☆* 6.41±1.22 (8)☆☆△** 39.32±7.94 (8)☆☆△
[0116] 注：造模后与Control组比较，☆☆P＜0.01，☆P＜0.05；与ADR组比较，△△P＜0.01，△P＜0.05；与PTU组比较，**P＜0.01，*P＜0.05
[0117] 如表6所示，造模后与Control组比较，ADR组、ADR+PTU组心重指数均明显增加（P＝0.007，P＝0.000），具有非常显著性差异（P均＜0.01），PTU组无差异（P＝0.118），无显著性差异（P＞0.05）；与ADR组比较，PTU组、ADR+PTU组心重指数均改变甚微（P＝0. 579，P＝
0.450），无显著性差异（P＞0.05）；与PTU组比较，ADR+PTU组心重指数增加（P＝0.042），具有显著性差异（P＜0.05）。提示ADR+PTU造模法可增加心衰大鼠心重指数，但与ADR法比较无明显优势。
0.450），无显著性差异（P＞0.05）；与PTU组比较，ADR+PTU组心重指数增加（P＝0.042），具有显著性差异（P＜0.05）。提示ADR+PTU造模法可增加心衰大鼠心重指数，但与ADR法比较无明显优势。
[0118] 造模后与Control组比较，ADR+PTU组的肺重指数明显增加（P＝0.000），具有非常显著性差异（P均＜0.01），ADR组、PTU组肺重指数均无显著增加（P＝0.362，P＝0.719），无显著性差异（P均＞0.05）；与ADR组比较，ADR+PTU组肺重指数增高（P＝0.031），具有显著性差异（P均＜0.05）；与PTU组比较，ADR+PTU组肺重指数明显增高（P＝0.005），具有非常显著性差异（P均＜0.01）。提示ADR+PTU造模法可增加心衰大鼠肺重指数，且优于ADR法。
[0119] 造模后与Control组比较，ADR+PTU组的肝重指数明显增加（P＝0.004），具有非常显著性差异（P＜0.01），ADR组、PTU组均无显著增加（P＝0.459，P＝0.095），无显著性差异（P均＞0.05）；与ADR组比较，ADR+PTU组肝重指数增高（P＝0.019），具有显著性差异（P＜0.05）；与PTU组比较，ADR+PTU组肝重指数无明显增加（P＝0.060），无显著性差异（P＞
0.05）。提示ADR+PTU造模法可增加心衰大鼠肝重指数，且优于ADR法。
0.05）。提示ADR+PTU造模法可增加心衰大鼠肝重指数，且优于ADR法。
[0120] 3.4心脏、肝脏、肺脏病理切片结果
[0121] 与正常组比较，PTU组部分心肌细胞轻度肿胀，个别心肌细胞胞浆疏松，心肌细胞溶解消失，部分心肌细胞横纹变浅或消失，心肌间质可见散在的慢性炎细胞浸润。ADR组心肌细胞肿胀，部分心肌细胞胞浆疏松，少数心肌细胞溶解消失，心肌细胞横纹变浅或消失，心肌间质可见慢性炎细胞浸润。ADR＋PTU组可见较多的心肌细胞明显肿胀，心肌细胞胞浆
染色变浅，浆疏松呈网状，部分心肌细胞核增大，部分血管周围心肌细胞溶解消失，心肌细胞横纹变浅多数消失，心肌间质可见点灶状炎细胞浸润。结合心重指数结果，提示ADR+PTU造模法可模拟心气虚兼血瘀水肿证的胸痛症状，优于ADR法。
染色变浅，浆疏松呈网状，部分心肌细胞核增大，部分血管周围心肌细胞溶解消失，心肌细胞横纹变浅多数消失，心肌间质可见点灶状炎细胞浸润。结合心重指数结果，提示ADR+PTU造模法可模拟心气虚兼血瘀水肿证的胸痛症状，优于ADR法。
[0122] 与正常组比较，PTU组气管及肺泡腔未见明显渗出，少数肺泡腔可见肺泡巨噬细胞增大。部分肺泡隔轻度增宽可见少量炎细胞浸润。ADR模型组气管及肺泡腔可见渗出，少数肺泡腔内可见少量水肿液，部分肺泡腔内可见肺泡巨噬细胞增大、聚集，部分肺泡隔增宽可见炎细胞浸润，血管及气管周围也可见炎细胞增多。ADR＋PTU组气管及肺泡腔可见渗出，多数肺泡腔内可见少量水肿液，多数肺泡腔内可见肺泡巨噬细胞增大、聚集，部分肺泡腔内可见巨噬细胞肺泡炎的改变，部分肺泡隔增宽可见炎细胞浸润，血管及气管周围也可见炎细
胞增多，部分区域可见肺泡融合。结合呼吸频率、肺重指数结果，提示ADR+PTU造模法可模拟心气虚兼血瘀水肿证的胸闷憋喘症状，明显优于ADR法。
胞增多，部分区域可见肺泡融合。结合呼吸频率、肺重指数结果，提示ADR+PTU造模法可模拟心气虚兼血瘀水肿证的胸闷憋喘症状，明显优于ADR法。
[0123] 与正常组比较，PTU组肝窦轻度扩张充血，肝细胞浊肿。ADR组肝窦明显扩张充血，肝细胞浊肿，可见肝细胞点灶状坏死，并可见急慢性炎细胞浸润。ADR＋PTU组肝窦明显扩张充血，肝细胞浊肿，可见肝细胞点灶状坏死，并可见急慢性炎细胞浸润，个别区域可见肝细胞脂肪变性。结合肝重指数结果，提示ADR+PTU造模法可模拟心气虚兼血瘀水肿证的胁下积痞体征，明显优于ADR法。
[0124] 综上，本发明的实验结果表明，与Control组比较，ADR组的LVEF、LVFS、BNP都有显著性差异，但心率、呼吸频率、耳温、T3、T4、TSH无显著性差异，说明ADR组能够模拟慢性心力衰竭疾病，却不能完全模拟心气虚兼血瘀水肿证，。与单纯ADR造模法比较，ADR+PTU组在模拟慢性心力衰竭疾病(LVEF、LVFS、BNP)方面有明显优势外，还能够更好的模拟胸痛（心肌病理切片）、胸闷憋气（肺重指数、肺脏病理切片）、胁下痞块（肝重指数、肝脏病理切片）、浮肿尿少（尿量）、形寒肢冷（耳温、T3、T4、TSH），但在模拟疲劳乏力（力竭性游泳试验）方面未见明显优势。综合评价后，无论在反应心衰疾病诊断指标方面，还是在心气虚兼血瘀证的整合信息指标方面，ADR+PTU组明显优于其他组别。即 ADR+PTU双重因子攻击法能够更好的模拟慢性心力衰竭心气虚兼水肿血瘀证。
[0125] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。