一种加速玉米秸秆还田腐解的方法

摘要

本发明属于农作物秸秆利用的领域，公开了一种加速玉米秸秆还田腐解的方法，包括：将玉米秸秆粉碎，与助剂混合，接种秸秆降解菌剂后将秸秆翻埋至土壤中，控制土壤含水量为田间持水量的60％-80％，于20-30℃下进行腐解。盆栽试验表明，本发明方法对玉米秸秆的腐解效果最好，秸秆降解率达51.9％，比秸秆直接还田的处理提高了14％。TR助剂能够显著促进秸秆降解菌剂产纤维素酶类，其滤纸酶(FPA)、纤维素酶活(CMCase)和半纤维素酶(Xylanase)的酶活均有较大升高，直接促进秸秆的降解。本发明方法促进了玉米秸秆的腐解，加速了玉米秸秆的还田过程，可以用于秸秆类废弃物的转化利用，具有广阔的应用前景。

权利要求

1.一种加速玉米秸秆还田腐解的方法，其特征在于包括：将玉米秸秆粉碎，与助剂混合，接种秸秆降解菌剂后将秸秆翻埋至土壤中，控制土壤含水量为田间持水量的

60％-80％，于20-30℃下进行腐解；

所述的助剂为聚乙二醇对异辛基苯基醚；所述的秸秆降解菌剂为菌株NJGZ-2孢子浓7

度10cfu/mL的菌剂；

所述的玉米秸秆与助剂的用量比为50～250：1g/mL；所述的玉米秸秆与秸秆降解菌剂的用量比为1～5：1g/mL。

2.根据权利要求1所述的加速玉米秸秆还田腐解的方法，其特征在于所述的玉米秸秆为1-2cm的玉米秸秆段。

3.根据权利要求1所述的加速玉米秸秆还田腐解的方法，其特征在于所述的玉米秸秆与助剂的用量比为250：1g/mL。

4.根据权利要求1所述的加速玉米秸秆还田腐解的方法，其特征在于所述的玉米秸秆与秸秆降解菌剂的用量比为1～2：1g/mL。

5.根据权利要求1所述的加速玉米秸秆还田腐解的方法，其特征在于所述的秸秆降解菌剂是由以下方法制备而成的：将菌株NJGZ-2接种至产孢子培养基中，20-30℃静止培养

6-8天，然后加入无菌水震荡，过滤培养物后即得孢子悬浮液，用无菌水调节孢子悬浮液中7

孢子浓度为10cfu/mL，即得秸秆降解菌剂；

所述的产孢培养基为：玉米秸秆粉10.0g、蛋白胨5.0g、酵母粉2.0g、尿素0.3g、水

1000mL，pH自然，121℃高压灭菌20min。

6.根据权利要求5所述的加速玉米秸秆还田腐解的方法，其特征在于所述的玉米秸秆粉为玉米秸秆烘干至含水量1％以下、粉碎后过30目筛得到的玉米秸秆粉。

说明书

一种加速玉米秸秆还田腐解的方法

技术领域

[0001] 本发明属于农作物秸秆利用的领域，涉及秸秆类废弃物资源化利用的技术方法，具体涉及一种加速玉米秸秆还田腐解的方法。

背景技术

[0002] 我国每年超过2亿吨玉米秸秆，拥有量居世界首位。传统上秸秆多作为农村薪材或以堆积、荒烧等形式倾入环境中，如今国内愈演愈烈的雾霾天气与秸秆的肆意焚烧有密不可分的联系。与此同时，秸秆类物质由于富含大量的有机碳和丰富的氮、磷、钾等矿质元素而可以作为一类优质的可利用资源。因此将秸秆进行高效的资源化利用不仅可以减少污染、保护环境，而且可以变废为宝，实现可持续发展。秸秆直接还田是秸秆资源化利用中最简便、经济的方法，从国内外技术推广和试验的经验来看，玉米秸秆还田除了能够改善土壤质量，增加土壤肥力之外还可以提高作物产量，产生良好的经济效益。而研究如何运用现代化的技术使还田的秸秆更快的腐解则成为了问题的关键。

[0003] 秸秆直接还田过程中存在着秸秆腐解速率慢、木质纤维素类物质降解难、影响后茬作物生长等问题，从而在一定程度上限制了该技术的推广应用。通过接种秸秆降解菌剂可以有效地解决这些难题，这是因为许多微生物可以分泌相关的纤维素酶将秸秆中的木质纤维素类物质分解成葡萄糖、木糖、纤维二糖等可溶性糖，从而破坏秸秆的表面结构，使秸秆转化为能被土壤中的微生物利用的物质。因此通常在玉米秸秆还田时通过施用秸秆降解菌剂来加速秸秆的腐解。但在秸秆降解菌剂的使用中也存在着一些制约因素，例如菌剂、水分和秸秆三者不能充分接触，菌剂在秸秆的蜡质层表皮难以定殖和侵染秸秆内部等。这使得降解菌剂的作用不能完全地发挥，秸秆的腐解速率受到限制。

发明内容

[0004] 1.技术问题

[0005] 本发明旨在提供一种能有效提高降解菌剂的产酶水平，显著促进玉米秸秆还田过程的方法，从而加速玉米秸秆的资源化利用进程，确保农业的可持续发展。

[0006] 2.技术方案

[0007] 一种加速玉米秸秆还田腐解的方法，包括：将玉米秸秆粉碎，与助剂混合，接种秸秆降解菌剂后将秸秆翻埋至土壤中，控制土壤含水量为田间持水量的60％-80％，于20-30℃下进行腐解。

[0008] 所述的玉米秸秆为1-2cm的玉米秸秆段。

[0009] 所述的助剂为聚乙二醇对异辛基苯基醚，又称曲拉通X-100(Triton X-100，简写为TR)。

[0010] 所述的玉米秸秆与助剂的用量比为50～250：1g/mL，优选为250：1g/mL。

[0011] 所述的玉米秸秆与秸秆降解菌剂的用量比为1～5：1g/mL，优选为1～2：1g/mL。

[0012] 所述的秸秆降解菌剂为菌株NJGZ-2孢子浓度107cfu/mL的菌剂。

[0013] 菌株NJGZ-2，分类命名为：草酸青霉(Penicillium oxalicum)，于2013年4月27保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号CGMCC NO.7527；参见发明专利申请201310289313.9，公开号
103667069A。

[0014] 所述的秸秆降解菌剂是由以下方法制备而成的：将菌株NJGZ-2接种至产孢子培养基中，25-30℃静止培养6-8天，然后加入无菌水震荡，过滤培养物后即得孢子悬浮液，用7
无菌水调节孢子悬浮液中孢子浓度为10cfu/mL，即得秸秆降解菌剂；

[0015] 所述的产孢培养基的配制：玉米秸秆粉10.0g、蛋白胨5.0g、酵母粉2.0g、尿素0.3g、水1000mL，pH自然，121℃高压灭菌20min。

[0016] 所述的玉米秸秆粉为玉米秸秆烘干至含水量1％以下、粉碎后过30目筛得到的玉米秸秆粉。

[0017] 3.有益效果

[0018] 盆栽试验表明，本发明方法对玉米秸秆的腐解效果最好，秸秆降解率达51.9％，比秸秆直接还田的处理提高了14％，比只施用秸秆降解菌剂的处理提高了7％以上，这说明添加TR助剂对NJGZ-2秸秆降解菌剂腐解玉米秸秆有明显的促进作用。助剂Triton X-100能够显著促进秸秆降解菌剂产纤维素酶类，其滤纸酶(FPA)、纤维素酶活(CMCase)和半纤维素酶(Xylanase)的酶活均有较大升高，直接促进秸秆的降解。发酵试验结果表明，助剂Triton X-100在0.1％浓度和0.5％浓度下均能促进秸秆降解菌剂腐解玉米秸秆，以0.1％浓度对秸秆降解菌剂腐解玉米秸秆的促进作用最为明显，在30℃条件下液体发酵7天和固体发酵30天，玉米秸秆降解率分别为61.7％和66.8％，比只添加秸秆降解菌剂提高了23％和16.8％。

[0019] 本发明方法促进了玉米秸秆的腐解，加速了玉米秸秆的还田过程，可以用于秸秆类废弃物的转化利用，具有广阔的应用前景。

附图说明

[0020] 图1为液体发酵条件下添加助剂对降解菌剂滤纸酶活的影响。

[0021] 图2为液体发酵条件下添加助剂对降解菌剂纤维素酶活的影响。

[0022] 图3为液体发酵条件下添加助剂对降解菌剂半纤维素酶活的影响。

[0023] 图4为液体发酵不同处理对秸秆腐解的影响，a为处理前秸秆；b为对照组发酵后剩余秸秆；c为添加0.1％Triton X-100发酵后剩余秸秆。

[0024] 图5为固体发酵不同处理对秸秆腐解的影响，a为处理前秸秆；b为对照组发酵后剩余秸秆；c为添加0.1％Triton X-100发酵后剩余秸秆。

[0025] 生物材料保藏信息：

[0026] NJGZ-2，分类命名为：草酸青霉(Penicillium oxalicum)，于2013年4月27保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO.7527。

具体实施方式

[0027] 实施例1

[0028] 该降解菌是从南京紫金山腐烂树叶土壤中筛选得到。利用梯度稀释涂布法将逐级稀释的土壤样品的悬液涂布到CMC-刚果红平板，30℃培养筛选纤维素降解菌。上述CMC-刚果红培养基配方为：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)10g，(NH4)2SO42g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.5g，刚果红0.2g，琼脂20g，水1000mL，121℃高压灭菌20min。

[0029] 挑选在CMC-刚果红平板上产生透明圈较大并生长较快的菌株纯化分离，然后将它们接种至以水稻秸秆为唯一碳源的水稻秸秆粉培养基(水稻秸秆粉培养基配方为：烘干粉碎后的水稻秸秆粉末10g，KH2PO43.0g；NaNO33.0g；CaCl20.5g；MgSO4·7H2O0.5g，FeSO4·7H2O0.0075g，MnSO4·H2O0.0025g，ZnSO40.002g，CoCl20.003g，琼脂20g，水1000mL，
121℃高压灭菌20min；水稻秸秆粉末指的是水稻秸秆烘干至含水量10％以下、粉碎后过
40目筛)上培养，比较各菌株生长速度和生长情况，最终得到能高效降解水稻秸秆的真菌NJGZ-2。在PDA平板上，初期菌落中间呈浅白色、轮廓规则，外观呈绒毛状。菌丝细胞丝状交织，具横隔；分生孢子梗不具足细胞，帚状枝为对称双轮型，瓶梗细长渐变尖锐；分生孢子椭圆形，呈蓝绿色。采用真菌通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，将PCR产物连接pMD-19T载体后测序，所得序列经NCBI比对，与Penicillium oxalicum strain a1s2_d38有99％的相似度。选取和它相近的一些菌株绘制系统发育进化树，以及结合菌落和菌丝形态学特征，鉴定该菌株为草酸青霉(Penicillium oxalicum)。

[0030] 实施例2

[0031] 将菌株NJGZ-2接种至装有50mL产孢子培养基的三角瓶中，30℃静止培养7天，然后加入30mL无菌水在摇床上震荡30min，用无菌纱布过滤培养物后即得孢子悬浮液，用无7
菌水调节孢子悬浮液中孢子浓度为10cfu/mL，即得秸秆降解菌剂。

[0032] 所述的产孢培养基的配制：玉米秸秆粉10.0g、蛋白胨5.0g、酵母粉2.0g、尿素0.3g、水1000mL，pH自然，121℃高压灭菌20min。

[0033] 所述的玉米秸秆粉为玉米秸秆烘干至含水量1％以下、粉碎后过30目筛得到的玉米秸秆粉。

[0034] 实施例3

[0035] 通过盆栽模拟试验比较了本发明方法与秸秆直接还田法对玉米秸秆腐解的影响。

[0036] 助剂为聚乙二醇对异辛基苯基醚，取1mL聚乙二醇对异辛基苯基醚，加水配制成聚乙二醇对异辛基苯基醚浓度为0.1％的助剂溶液。

[0037] 盆栽模拟试验：玉米秸秆剪成1-2cm的玉米秸秆段，取10g玉米秸秆放入10cm×15cm的100目尼龙网袋中，按表1的设置方法处理后将尼龙袋口扎紧，埋至装有土壤的花盆中，距土表3cm深处，试验过程中控制土壤含水量为田间持水量的60％-80％(每
100g土壤约加水25mL)，20-30℃下静置培养30天后测定玉米秸秆的降解率。

[0038] 玉米秸秆降解率的测定：取处理后的秸秆剩余物，用大量清水洗去秸秆上的菌丝与其他可溶物，70℃烘干至恒重，测定秸秆减少的质量，计算其降解率(见表1)。

[0039] 降解率＝(处理前秸秆质量-处理后秸秆剩余质量)/处理前秸秆质量×100％。

[0040] 表1不同处理方法对玉米秸秆腐解的影响

[0041]

[0042] 注：不同小写字母表示处理间差异达5％显著水平，下同。

[0043] 试验结果表明，处理1对玉米秸秆的腐解效果最好，其降解率为51.9％，比秸秆直接还田的处理(处理4)提高了14％，比只接种降解菌剂的处理(处理2)提高了7％以上，这说明添加TR助剂对菌剂NJGZ-2腐解玉米秸秆有明显的促进作用。

[0044] 实施例4

[0045] 通过固体发酵试验比较了不同浓度的TR助剂对降解菌剂降解玉米秸秆的影响以及助剂对降解菌剂产纤维素酶类的影响。

[0046] 固体发酵试验：首先用TR助剂和水配置浓度分别为0.1％和0.5％的助剂溶液。玉米秸秆剪成1-2cm的小段后取5g加入组培瓶中，加入20mL助剂溶液与玉米秸秆充分混合后经121℃高压灭菌20min；接种5mL秸秆降解菌剂至组培瓶中，30℃静置培养30天。30天后提取粗酶液测定其滤纸酶活(FPA)、纤维素酶活(CMCase)和半纤维素酶活(Xylanase)，并测定秸秆降解率(见表2)。

[0047] 对照试验(CK)：以不添加助剂，只接种秸秆降解菌剂作为对照，其他处理同固体发酵试验。

[0048] 粗酶液的制备及酶活测定：

[0049] 固体发酵30天后向组培瓶中加入50mL无菌水，摇床震荡20min后取发酵液，经5000rpm离心10min后即得粗酶液。用DNS还原糖法测定其滤纸酶活(FPA)、纤维素酶活(CMCase)和半纤维酶活(Xylanase)。酶活的定义参考国际标准：在相应的条件下，50℃下，
1min内催化底物水解生成1μmol生成物的酶量定义为一个酶活性单位(U)。

[0050] DNS试剂的配制方法：6.3g3,5-二硝基水杨酸和21g NaOH，加到500mL含185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中一周后备用。

[0051] 表2固体发酵条件下助剂TR对降解菌剂腐解玉米秸秆的影响

[0052]

[0053] 注：gds表示每克干重底物。

[0054] 结果表明，经过固体发酵后的玉米秸秆表面都受到不同程度的破坏(见图5)，但是对照试验中的秸秆大部分被分解，只有少量段状结构剩余；而经TR助剂处理的玉米秸秆大部分已被分解成纤维状，仅有少量片段剩余。在30℃条件下固体发酵30天，0.1％TR处理的玉米秸秆降解率达66.8％，0.5％TR处理的降解率达60.7％，分别比对照组提高了16.8％和10.7％。TR助剂对促进降解菌剂产纤维素酶类的效果十分明显，其滤纸酶(FPA)、纤维素酶(CMCase)和半纤维素酶(Xylanase)的酶活均有较大的提高，且0.1％TR处理的产酶效果好于0.5％TR处理。由此可见添加助剂TR可以显著促进降解菌剂腐解玉米秸秆，尤其以0.1％TR处理的促进作用最为明显。

[0055] 实施例5

[0056] 通过液体发酵试验比较了不同浓度的TR助剂对降解菌剂降解玉米秸秆的影响以及助剂对降解菌剂产纤维素酶类的影响。

[0057] 液体发酵试验：首先用TR助剂和水配置浓度分别为0.1％和0.5％的助剂溶液。玉米秸秆剪成1-2cm的小段后取2g加入250mL三角瓶中，加入100mL助剂溶液与玉米秸秆充分混合后经121℃高压灭菌20min；接种2mL秸秆降解菌剂至三角瓶中，30℃、170rpm培养7天。每天取粗酶发酵液测定其滤纸酶活(FPA)(见图1)、纤维素酶活(CMCase)(见图2)和半纤维素酶活(Xylanase)(见图3)，7天后测定秸秆降解率(见表3)。

[0058] 对照试验(CK)：以不添加助剂，只接种秸秆降解菌剂作为对照，其他处理同液体发酵试验。

[0059] 粗酶液的制备及酶活测定：无菌条件下每天同一时段自三角瓶中取少量发酵液经5000rpm离心10min后即得粗酶液，酶活测定方法同实施例4。

[0060] 表3液体发酵条件下助剂TR对降解菌剂腐解玉米秸秆的影响

[0061]

[0062] 结果表明，液体发酵后的秸秆表面都受到不同程度的破坏(见图4)，但是对照试验中的秸秆仅有少部分被破坏，仍有许多秸秆保持段状结构；而经TR助剂处理后的秸秆几乎全部呈纤维状，且质量减少明显。添加助剂TR可以显著促进降解菌剂腐解玉米秸秆，在30℃条件下液体发酵7天，0.1％TR处理的降解率达61.7％，0.5％TR处理的降解率达53.7％，分别比对照组提高了23％和15％，以TR为0.1％浓度时对降解菌剂腐解玉米秸秆的促进作用最为明显。TR助剂对促进降解菌剂产纤维素酶类的效果十分明显，0.1％TR处理的滤纸酶活(FPA)7天内成连续上升趋势，最大值为42.01U/gds，比0.5％TR处理(26.72U/gds)和对照组(13.39U/gds)均有明显提升；纤维素酶活(CMCase)也呈现同样变化趋势，0.1％TR处理的酶活第7天时达到最大值(174.3U/gds)，比0.5％TR处理提高了35.5U/gds，是对照组(68.28U/gds)的2.5倍；各处理的半纤维素酶活(Xylanase)在1-5天内呈现较快的上升趋势，5天后趋于平稳，其中0.5％TR与对照组在前6天内无显著差异，到第7天时酶活比对照组(1637.3U/gds)增加了533.4U/gds，0.1％TR处理的酶活在7天内呈现较快上升趋势，7天后半纤维酶活达3524U/gds，比对照组提高了1.15倍。这说明TR助剂在0.1％浓度和0.5％浓度时均能提高NJGZ-2降解菌剂的产纤维素酶水平，对腐解玉米秸秆有明显的促进作用，尤以0.1％浓度的产纤维素酶水平最为显著。