肺囊康定B0合成相关蛋白glpks3及其编码基因转让专利
申请号 : CN201310056488.5
文献号 : CN104004805B
文献日 : 2016-03-23
发明人 : 刘杏忠 , 安志强 , 岳群 , 陈里 , 向梅春
申请人 : 中国科学院微生物研究所
摘要 :
本发明公开了一种肺囊康定B0合成相关蛋白glpks3及其编码基因。本发明提供的蛋白质，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与肺囊康定B0合成相关的由序列1衍生的蛋白质。抑制Glarea lozoyensis中所述蛋白的编码基因的表达，使肺囊康定B0的产量提高了4倍。本发明为深入研究肺囊康定生物合成的代谢调控提供了理论依据，可用于通过基因敲除提高肺囊康定B0的产量，为卡泊芬净的高产提供保证。
权利要求 :
1.一种生产肺囊康定B0的方法，包括如下步骤：培养工程菌，得到肺囊康定B0；所述工程菌是将抑制glpks3基因表达的产品导入Glarea lozoyensis得到的重组菌；所述glpks3基因为编码glpks3蛋白的DNA分子；所述glpks3蛋白为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述glpks3基因是如下(1)或(2)所述的DNA分子：(1)编码区如序列表中序列3所示的DNA分子；
(2)序列表中序列2所示的DNA分子。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述“抑制glpks3基因表达的产品”为可以通过同源重组使所述glpks3基因失活的质粒。
4.一种重组质粒，它的骨架载体为载体pAg1-H3，在所述骨架载体的不同多克隆位点分别插入序列表的序列2自5’末端第473至3522位核苷酸所示的DNA片段甲和序列表的序列2自5’末端第4332至8512位核苷酸所示的DNA片段乙。
5.将权利要求4所述重组质粒导入Glarea lozoyensis得到的重组菌。
6.权利要求5所述的重组菌在生产肺囊康定B0中的应用。
7.一种蛋白质，为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
8.编码权利要求7所述蛋白的基因，所述基因具体为如下(1)或(2)所述的DNA分子：(1)编码区如序列表中序列3所示的DNA分子；
(2)序列表中序列2所示的DNA分子。
9.含有权利要求8所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
10.权利要求7所述蛋白质在影响肺囊康定B0合成中的应用，或用于抑制权利要求8所述基因表达的产品在提高肺囊康定B0产量中的应用，或权利要求4所述重组质粒在抑制权利要求7所述蛋白的编码基因的表达中的应用。
说明书 :
肺囊康定B0合成相关蛋白glpks3及其编码基因
技术领域
[0001] 本发明涉及一种肺囊康定B0合成相关蛋白glpks3及其编码基因。
背景技术
[0002] 卡泊芬净（Caspofungin）是第一个获得美国FDA批准上市的棘白菌素（Echinocandin）类抗真菌药物，能够特异性的抑制真菌细胞壁β-（1，3）-D-葡聚糖的合成，使真菌溶解，具有良好的抗真菌活性，并且对患者不会产生类似两性霉素B等药物的细胞毒性，因此也被誉为抗真菌药物中的青霉素。
[0003] 卡泊芬净在临床上用于治疗对其它治疗无效或不能耐受的侵袭性曲霉病和念珠菌菌血症及继发的念珠菌性腹腔脓肿和腹膜炎患者。2009年其全球销售额为6.17亿美元，在中国整个抗真菌药物医院市场中所占份额为12.45%，位居第四。目前，尚无国产的卡泊芬净产品，国内使用均需进口，单支售价高达千元。然而，默克公司对于卡泊芬净的专利权将于2013年到期，届时卡泊芬净国产化势在必行，这将带来巨大的经济价值。
[0004] 卡泊芬净的前体物是由Glarea lozoyensis产生的肺囊康定（pneumocandin）B0，因此Glarea lozoyensis中肺囊康定B0合成至关重要。Glarea lozoyensis属于子囊菌门（Ascomycota）锤舌菌纲（Leotiomycetes）柔膜菌目（Helotiales），为无性型丝状真菌。1991年，Adefarati等通过NMR等技术分析了肺囊康定B0的结构，发现该化合物是由苏氨酸、trans-4-羟基脯氨酸、3，4-二羟基高酪氨酸、3-羟基谷氨酰胺、trans-3-羟基脯氨酸和4，5-二羟基鸟氨酸组成的环六肽主链和一条10，12-二甲基-豆蔻酸酯的聚酮侧链构成的。
[0005] 肺囊康定B0的结构（R=H）如下：
[0006] 式（Ⅰ）。
[0007] 代谢调控和分子改造是大幅度提高代谢产物的方法，寻找与肺囊康定B0合成相关的基因，通过分子遗传学操作有效地提高肺囊康定B0的产量是急待解决的关键问题。
发明内容
[0008] 本发明的目的是提供肺囊康定B0合成相关蛋白glpks3及其编码基因。
[0009] 本发明提供了一种生产肺囊康定B0的方法，包括如下步骤：培养工程菌，得到肺囊康定B0；所述工程菌是将抑制glpks3基因表达的产品导入Glarea lozoyensis得到的重组菌；所述glpks3基因为编码glpks3蛋白的DNA分子；所述glpks3蛋白为如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与肺囊康定B0合成相关的由序列1衍生的蛋白质。
[0010] 所述glpks3基因具体可为如下（1）或（2）或（3）或（4）所述的DNA分子：（1）编码区如序列表中序列3所示的DNA分子；（2）序列表中序列2所示的DNA分子；（3）在严格条件下与（1）或（2）限定的DNA序列杂交且编码与肺囊康定B0合成相关的蛋白的DNA分子；（4）与（1）或（2）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码与肺囊康定B0合成相关的蛋白的DNA分子。
[0011] 所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠（SDS）、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1%SDS中漂洗；
还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，
0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在
65℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。
还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，
0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在
65℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。
[0012] 所述“抑制glpks3基因表达的产品”为可以通过同源重组使所述glpks3基因失活的质粒。所述同源重组所借助的一对同源臂可为序列表的序列2自5’末端第473至3522位核苷酸所示的同源臂和序列表的序列2自5’末端第4332至8512位核苷酸所示的同源臂。所述“抑制glpks3基因表达的产品”具体可为如下重组质粒：骨架载体为载体pAg1-H3，在所述骨架载体的不同多克隆位点分别插入序列表的序列2自5’末端第473至3522位核苷酸所示的DNA片段甲和序列表的序列2自5’末端第4332至8512位核苷酸所示的DNA片段乙得到的重组质粒。
[0013] 本发明还保护抑制所述glpks3基因表达的产品在提高肺囊康定B0产量中的应用。所述肺囊康定B0产量具体指的是Glarea lozoyensis中的肺囊康定B0的产量。所述“抑制glpks3基因表达的产品”为可以通过同源重组使所述glpks3基因失活的质粒。所述同源重组所借助的一对同源臂可为序列表的序列2自5’末端第473至3522位核苷 酸所示的同源臂和序列表的序列2自5’末端第4332至8512位核苷酸所示的同源臂。所述“抑制glpks3基因表达的产品”具体可为如下重组质粒：骨架载体为载体pAg1-H3，在所述骨架载体的不同多克隆位点分别插入序列表的序列2自5’末端第473至3522位核苷酸所示的DNA片段甲和序列表的序列2自5’末端第4332至8512位核苷酸所示的DNA片段乙得到的重组质粒。
[0014] 本发明还保护一种重组质粒，它的骨架载体为载体pAg1-H3，在所述骨架载体的不同多克隆位点分别插入序列表的序列2自5’末端第473至3522位核苷酸所示的DNA片段甲和序列表的序列2自5’末端第4332至8512位核苷酸所示的DNA片段乙。
[0015] 本发明还保护所述重组质粒在抑制所述glpks3基因表达中的应用。
[0016] 本发明还保护将所述重组质粒导入Glarea lozoyensis得到的重组菌。
[0017] 本发明还保护所述重组菌在生产肺囊康定B0中的应用。所述应用中，用重组菌在生产肺囊康定B0的具体方法如下：将0.5cm×0.5cm的重组菌菌落接种至25mL LYCP-5产孢培养基，然后25℃、200rpm振荡培养4天，得到的孢子液；将所述的孢子液以5%（体积比）的接种量转接至FGY培养基，25℃、200rpm振荡培养14天。
[0018] 本发明还保护glpks3蛋白，来自Glarea lozoyensis，为如下（a）或（b）：
[0019] （a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0020] （b）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与肺囊康定B0合成相关的由序列1衍生的蛋白质。
[0021] 所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0022] 为了使（a）中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0023] 表1标签的序列
[0024]标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6（通常为5个） RRRRR
Poly-His 2-10（通常为6个） HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
Poly-Arg 5-6（通常为5个） RRRRR
Poly-His 2-10（通常为6个） HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
[0025] 上述（b）中的取代和/或缺失和/或添加，可由自然变异或人工诱变引起。
[0026] 上述（a）或（b）中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2或3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变， 和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0027] 编码所述蛋白的基因（glpks3基因）也属于本发明的保护范围。
[0028] 所述glpks3基因具体可为如下（1）或（2）或（3）或（4）所述的DNA分子：（1）编码区如序列表中序列3所示的DNA分子；（2）序列表中序列2所示的DNA分子；（3）在严格条件下与（1）或（2）限定的DNA序列杂交且编码与肺囊康定B0合成相关的蛋白的DNA分子；（4）与（1）或（2）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码与肺囊康定B0合成相关的蛋白的DNA分子。
[0029] 所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠（SDS）、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1%SDS中漂洗；
还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，
0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在
65℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。
还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，
0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在
65℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。
[0030] 含有所述glpks3基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
[0031] 本发明还保护所述glpks3蛋白在影响肺囊康定B0合成中的应用。
[0032] 本发明通过分析Glarea lozoyensis基因组发现了与肺囊康定B0产量提高相关的蛋白及其编码基因。抑制Glarea lozoyensis中该基因的表达，将大幅度提高肺囊康定B0的产量。本发明为深入研究肺囊康定生物合成的代谢调控提供了理论依据，可通过基因敲除提高肺囊康定B0的产量，为卡泊芬净的高产提供保证。
附图说明
[0033] 图1为实施例2中的PCR鉴定结果；1：1kb DNA ladder marker(1kb-10kb)；2-4为使用引物对丙扩增得到的PCR产物；2：Glarea lozoyensis；3：重组菌；4：重组质粒pAg1-H3-glpks3；5-7为使用引物对丁扩增得到的PCR产物；5：Glarea lozoyensis；6：重组菌；7：重组质粒pAg1-H3-glpks3。
[0034] 图2为实施例2中的LC-MS图谱。
[0035] 图3为实施例2中的抑菌试验结果；1：肺囊康定B0标准品溶液；2：Glarea lozoyensis；3：重组菌；4：DMSO。
具体实施方式
[0036] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0037] 肺囊康定B0标准品：购自加拿大Molcan Corporation，CAS号为135575-42-7。
[0038] Glarea lozoyensis（野生菌）：美国模式培养物集存库（ATCC，网址为www.atcc.org/），ATCC编号为20868。
[0039] 载体pAg1-H3：公众可以从中国科学院微生物研究所获得；参考文献：A.Zhang et al.,Efficient disruption of a polyketide synthase gene(pks1)required for melanin synthesis through Agrobacterium-mediated transformation of Glarea lozoyensis.Molecular Genetics and Genomics268,645(2003).。
[0040] 农杆菌AGL-1（Agrobacterium tumefaciens AGL-1）：公众可以从中国科学院微生物研究所获得；参考文献：X.Chen,M.Stone,C.Schlagnhaufer,C.P.Romaine,A Fruiting body tissue method for efficient Agrobacterium-mediated transformation of Agaricus bisporus.Appl Environ Microb66,4510(2000).。
[0041] 白色念珠菌SC5314（Candida albicans SC5314）：公众可以从中国科学院微生物研究所获得；参考文献：J.Gómez-Raja,E.Andaluz,B.Magee,R.Calderone,G.Larriba,A single SNP,G929T(Gly310Val),determines the presence of a functional and a non-functional allele of HIS4in Candida albicans SC5314:detection of the non-functional allele in laboratory strains.Fungal Genet Biol45,527(2008).。
[0042] IMAS液体培养基(200mL)：80mL2.5×MM、0.36g葡萄糖、1mL甘油，加水至192mL，灭菌后加入8mL1M MES和4mL10mM AS。
[0043] IMAS固体培养基(200mL)：80mL2.5×MM、0.18g葡萄糖、1mL甘油、3g琼脂，加水至188mL，灭菌后加入8mL1M MES和4mL10mM AS。
[0044] 1M MES(100mL)：21.325g MES和100mL水混匀，用氢氧化钾调pH至5.3，过滤除菌。
[0045] 10mM AS(100mL)：0.1962g乙酰丁香酮和100mL水混匀，用氢氧化钾调pH至8.0，过滤除菌。
[0046] 2.5×MM(1L)：3.625g磷酸氢二钾、5.125g磷酸二氢钾、1.25g硫酸镁、0.375g氯化钠、0.165g氯化钙、0.0062g硫酸亚铁和1.25g硫酸铵，溶于水并定容至1L。
[0047] M-100培养基(1L)：62.5mL M-100盐溶液、10g葡萄糖、3g硝酸钾和15g琼脂，溶于水并定容至1L。
[0048] M-100盐溶液(1L)：16g磷酸二氢钾、4g硫酸钠、8g氯化钾、2g硫酸镁、1g氯化钙和8mL M-100微量元素溶液，溶于水并定容至1L。
[0049] M-100微量元素溶液(500mL)：30mg硼酸、70mg氯化锰、200mg氯化锌、20mg钼酸钠、50mg氯化铁和200mg硫酸铜，溶于水并定容至500mL。
[0050] LYCP-5产孢培养基（pH6.0）：将2.5g葡萄糖、0.9g磷酸二氢钾、0.5g酵母提取物、1g棉籽粉、0.2mL85g/100mL乳酸水溶液、1mL微量元素混合物，溶于水并定容至100mL。
[0051] FGY培养基（pH5.3）：将4g果糖、0.8g谷氨酸钠、0.8g酵母提取物、1.5g脯氨酸、0.15g磷酸二氢钾、0.04g硫酸镁、1mL微量元素混合物，溶于水并定容至100mL。
[0052] 微量元素混合物：0.1g硫酸亚铁、0.1g硫酸锰、0.02g硫酸锌、0.01g氯化钙、0.0056g硼酸、0.0025g硫酸铜、0.0019g钼酸铵、12M盐酸水溶液5ml，溶于水并定容至
100mL。
100mL。
[0053] 实施例1、glpks3蛋白及其编码基因的发现
[0054] 对Glarea lozoyensis进行全基因组测序，测序结果经过组装、基因预测及注释发现了一个聚酮合酶，将该蛋白命名为glpks3蛋白。
[0055] glpks3蛋白如序列表的序列1所示。将编码glpks3蛋白的基因命名为glpks3基因，基因组DNA如序列表的序列2所示，cDNA中的开放阅读框如序列表的序列3所示。
[0056] 实施例2、glpks3蛋白及其编码基因的功能验证
[0057] 一、glpks3基因敲除载体pAg1-H3-glpks3的构建
[0058] 1、根据glpks3基因的序列，设计两对引物如下：
[0059] Primer C和Primer D组成引物对甲，靶序列为序列表的序列2自5’末端第473至3522位核苷酸。
[0060] Primer C：5’-CCTTAATTAAGGACTTCTTCTAGAGGTTG-3’（下划线标注PacI识别序列）；
[0061] Primer D：5’-GACTAGTCTGTCACTTCGTTTGCG-3’（下划线标注SpeI识别序列）。
[0062] PrimerA和Primer B组成引物对乙，靶序列为序列表的序列2自5’末端第4332至8512位核苷酸。
[0063] Primer A：5’-caGGGCCCTCAGCAAGACTACTTCTC-3’（下划线标注ApaI识别序列）；
[0064] Primer B：5’-caCCCGGGTTAACAACGACTTGTGAG-3’（下划线标注XmaI识别序列）。
[0065] 2、以Glarea lozoyensis的基因组DNA为模板，用引物对甲进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0066] 3、用限制性内切酶PacI和SpeI双酶切步骤2得到的PCR扩增产物，得到酶切产物。酶切产物PacI识别序列和SpeI识别序列之间的序列如序列表的序列2自5’末 端第473至3522位核苷酸所示。
[0067] 4、用限制性内切酶PacI和SpeI双酶切载体pAg1-H3，回收载体骨架（约6.5kb）。
[0068] 5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pAg1-H3L-glpks3。
[0069] 6、以Glarea lozoyensis的基因组DNA为模板，用引物对乙进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0070] 7、用限制性内切酶ApaI和XmaI双酶切步骤6得到的PCR扩增产物，得到酶切产物。酶切产物ApaI识别序列和XmaI识别序列之间的序列如序列表的序列2自5’末端第4332至8512位核苷酸所示。
[0071] 8、用限制性内切酶ApaI和XmaI双酶切重组质粒pAg1-H3L-glpks3，回收载体骨架（约9.5kb）。
[0072] 9、将步骤7的酶切产物和步骤8的载体骨架连接，得到重组质粒pAg1-H3-glpks3。
[0073] 根据测序结果，对重组质粒pAg1-H3-glpks3进行结构描述如下：骨架载体为载体pAg1-H3，PacI和SpeI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第473至3522位核苷酸所示的DNA片段甲，ApaI和XmaI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第4332至8512位核苷酸所示的DNA片段乙，DNA片段甲和DNA片段乙之间具有潮霉素抗性基因；DNA片段甲和DNA片段乙可以与Glarea lozoyensis的基因组DNA发生同源重组，用潮霉素抗性基因取代基因组DNA中的glpks3基因片段，从而使glpks3基因失活。
[0074] 二、重组菌的获得
[0075] 1、将重组质粒pAg1-H3-glpks3导入农杆菌AGL-1，得到重组农杆菌。
[0076] 2、将重组农杆菌重悬于IMAS液体培养基中使OD660nm值为0.15，28℃、200rpm振荡培养4-6小时，得到OD660nm值介于0.6-0.8之间的重组农杆菌菌液。
[0077] 3、将Glarea lozoyensis的孢子用蒸馏水重悬，得到孢子浓度为106个孢子/mL的孢子悬液。
[0078] 4、将100μL步骤3得到的孢子悬液与100μL步骤2得到的重组农杆菌菌液混合，涂布于IMAS固体培养基平板上，28℃培养2天，然后用含300μg/mL噻孢霉素和200μg/mL潮霉素的M-100培养基覆盖，25℃培养2-3周。
[0079] 5、挑取步骤4中生长的菌落，接种至含300μg/mL噻孢霉素和200μg/mL潮霉素的PDA固体培养基平板上，25℃培养2-3周，获得纯培养的菌株。
[0080] 6、提取步骤5获得的纯培养的菌株的基因组DNA，用引物对丙和引物对丁进行PCR鉴定，如果用引物对丙和引物对丁的PCR鉴定结果均为阳性，则该菌株为重组菌。
[0081] 引物对丙由Pc800F和P22’组成（分别对应DNA片段甲和DNA片段乙上的序列），如果具有约3.7kb的PCR扩增产物，PCR鉴定结果为阳性（如果PCR扩增产物约为3.7kb， 说明通过同源重组潮霉素抗性基因取代基因组DNA中的glpks3基因片段；如果PCR扩增产物约为2.1kb，说明未进行同源重组，引物对丙的靶序列基因片段并未被潮霉素抗性基因取代）。
[0082] Pc800F：5’-CTCGATGTCCCATACTTGGC-3’；
[0083] P22’：5’-GCTGTCGAGGATTGTGTTG-3’。
[0084] 引物对丁由Primer Y和Primer S组成（Primer Y对应glpks3基因的5’UTR，Primer S对应载体骨架），如果具有约4kb的PCR扩增产物，PCR鉴定结果为阳性。
[0085] Primer Y：5’-TAATCTTCCCAAAATCAATCAAC-3’；
[0086] Primer S：5’-TTGACATGCTCCTCTTCTTTACTC-3’。
[0087] 部分结果见图1。
[0088] 三、对照菌的获得
[0089] 用载体pAg1-H3代替重组质粒pAg1-H3-glpks3进行步骤二的操作，得到对照菌。
[0090] 四、glpks3蛋白及其编码基因的功能验证
[0091] 分别将重组菌、对照菌和野生菌进行如下步骤（平行处理）：
[0092] 1、将0.5cm×0.5cm的菌落接种至25mL LYCP-5产孢培养基，然后25℃、200rpm振荡培养4天，得到的孢子液。
[0093] 2、将步骤1的孢子液以5%（体积比）的接种量转接至FGY培养基，25℃、200rpm振荡培养14天。
[0094] 3、取完成步骤2的培养体系，用15倍体积甲醇浸提（25℃、200rpm振荡培养2小时），然后用0.22μm滤膜过滤，收集滤液。
[0095] 4、采用LC-MS检测滤液中肺囊康定B0含量。
[0096] 液相色谱分析仪器为Agilent公司1200高效液相色谱，色谱柱为Agilent Zorbax Extend-C181.8μm、2.1×50mm的C18柱；流动相总流速为0.3mL/min；流动相为流动相A、流动相B或流动相A和流动相B的混合物，流动相A为0.1%（体积比）甲酸水溶液、流动相B为乙腈；总洗脱时间为25分钟；洗脱过程为：0～0.5min，流动相B占流动相的体积比为30%，0.5～4min流动相B占流动相的体积比由30%线性上升至70%，4～12min流动相B占流动相的体积比由70%线性上升至100%，12～17min流动相B占流动相的体积比为100%，
17～17.5min流动相B占流动相的体积比由100%线性下降至30%，17.5～25min流动相B占流动相的体积比为30%；柱温40℃，样品的进样量为10μL，柱后流出液不经分流直接进入质谱检测。
17～17.5min流动相B占流动相的体积比由100%线性下降至30%，17.5～25min流动相B占流动相的体积比为30%；柱温40℃，样品的进样量为10μL，柱后流出液不经分流直接进入质谱检测。
[0097] 质谱分析仪器为Agilent6520四极杆飞行时间质谱（Agilent,USA），采用电喷雾离子源正离子模式检测；碎裂电压和毛细管电压分别为130V和3500V；脱溶剂气为高纯氮气，温度为300℃，流量为10L/min；雾化器压力为25psi；质量扫描范围 为80～1200m/z；每0.97秒采集一次数据。
[0098] LC-MS图谱见图2。对照菌的LC-MS图谱与野生菌的LC-MS图谱基本一致。
[0099] 使用不同浓度的肺囊康定B0标准品制作标准曲线，得到标准曲线方程：6 2
y=2×10x+47076，R=0.995，y代表肺囊康定B0的浓度（单位为μg/mL），x代表峰面积。
y=2×10x+47076，R=0.995，y代表肺囊康定B0的浓度（单位为μg/mL），x代表峰面积。
[0100] 根据标准曲线计算得出：重组菌步骤3得到的滤液中，肺囊康定B0的浓度为5.8914±0.4128μg/mL，将该浓度乘以16即为步骤2得到的培养体系中肺囊康定B0的浓度，（为94.2626μg/mL）；野生菌步骤3得到的滤液中，肺囊康定B0的浓度为1.5858±0.7857μg/mL，将该浓度乘以16即为步骤2得到的培养体系中肺囊康定B0的浓度（为25.3729μg/mL）；对照菌步骤3得到的滤液中，肺囊康定B0的浓度为1.5764±0.7356μg/mL，将该浓度乘以16即为步骤2得到的培养体系中肺囊康定B0的浓度（为25.2224μg/mL）。结果表明，抑制glpks3基因表达后，重组菌肺囊康定B0的产量是野生菌的4倍，即glpks3蛋白与肺囊康定B0的合成有关。
[0101] 5、抑菌试验
[0102] （1）取完成步骤2的培养体系，真空冷冻干燥机冻干，样品按冻干前体积加入等体积甲醇，浸提（25℃、200rpm振荡培养1小时），然后离心（5000rpm、5min）取上清10mL于玻璃烧杯中，加入2mL DMSO后置于通风橱中过夜干燥至体积为2mL。
[0103] （2）挑取白色念珠菌SC5314置于沙堡氏葡萄糖肉汤培养基（SDB培养基），30℃过夜培养至OD660nm值为0.4，然后以3%（体积比）的接种量接种至沙堡氏葡萄糖琼脂培养基（SDA培养基）中摇匀后倒入9cm塑料平板中。
[0104] （3）取10μL步骤（1）得到的溶液，加入到0.5cm滤纸片上，然后放置于步骤（2）得到的平板上，30℃培养20小时后观察抑菌圈。采用5mg/mL的肺囊康定B0标准品溶液（溶剂为DMSO）作为步骤（1）得到的溶液的阳性对照，采用DMSO作为步骤（1）得到的溶液的阴性对照。
[0105] 结果见图3。
[0106] 肺囊康定B0标准品溶液、野生菌培养物的提取物、重组菌培养物的提取物均能观察到抑菌圈的产生，重组菌培养物的提取物的抑菌圈显著大于野生菌培养物的提取物的抑菌圈，加入DMSO的滤纸片周围不能观察到抑菌圈的产生。结果表明，正是由于重组菌提高了肺囊康定B0产量，所以其培养物的提取物的抑菌能力显著增加了。
[0107] 实施例2进行三次重复试验，结果一致。