一种高产类胡萝卜素蛹虫草培养方法

摘要

本发明涉及生物制品领域，特别涉及一种高产类胡萝卜素蛹虫草培养方法，包括以下步骤：将蛹虫草进行活化培养，制得孢子悬液；将孢子悬液接种于本发明提供的半合成改良沙氏培养基中进行培养，得到种子液；将种子液接种于本发明提供的发酵培养基中进行培养，得到蛹虫草培养物；对蛹虫草培养物进行类胡萝卜素的提取。本发明提供的高产类胡萝卜素蛹虫草培养方法，将孢子悬液接种于本发明提供的半合成改良沙氏培养基中培养，得到种子液，将种子液接种于本发明提供的发酵培养基进行培养，培养时间较短，将得到的蛹虫草培养物提取类胡萝卜素，提取次数少，且提取得率稳定，得到的类胡萝卜素的产量高。

权利要求

1.一种高产类胡萝卜素蛹虫草培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)将蛹虫草进行活化培养，制得孢子悬液；所述步骤(a)中，蛹虫草活化培养采用沙氏琼脂改良固体培养基，沙氏琼脂改良培养基成分为：麦芽糖5g，蛋白胨10g，酵母膏5g，琼脂

20g，葡萄糖20g，水1000ml；所述活化培养的培养温度为25±2℃，避光培养7天；所述孢子悬液通过以下方式制备：在沙氏琼脂改良固体培养基上用含有体积百分数0.04-0.6％的吐温

80的无菌水洗下菌体，混合得到孢子悬液；

(b)将所述孢子悬液接种于半合成改良沙氏培养基中进行培养，得到种子液，其中，按重量份计，所述半合成改良沙氏培养基包括以下成分：麦芽糖3-8份、葡萄糖15-25份、蛋白胨5-15份、酵母膏3-8份、大米粉30-60份、水800-1200份；在所述步骤(b)中，所述孢子悬液的浓度为1-5×108cfu/ml，所述孢子悬液以体积百分数为5-10％进行接种；所述培养为：培养温度20-30℃，转速200-250rpm/min，避光培养，培养60-80h，得到所述种子液；

(c)将所述种子液接种于发酵培养基中进行培养，得到蛹虫草培养物，其中，所述种子液以体积百分数为8-10％进行接种；所述培养为25±3℃避光培养3-5天；然后23±3℃光照培养6-8天，光照强度为250-300Lux，每天光照12-14h，每2天摇瓶1次，所述发酵培养基包括以下成分：大米粉25-35份、玉米粉或苦荞粉40-50份、亮氨酸0.3-0.5份、磷酸二氢钾0.05-

0.2份、氯化钾0.01-0.1份、硫酸镁0.01-0.1份、硫酸亚铁0.001-0.003份、水80-120份，所述半合成改良沙氏培养基还包括质量百分比为1.5-3％的琼脂粉；

(d)对所述蛹虫草培养物进行类胡萝卜素的提取。

2.根据权利要求1所述的高产类胡萝卜素蛹虫草培养方法，其特征在于，所述步骤(d)具体为：将所述蛹虫草培养物烘干，每克烘干的蛹虫草培养物加入0.8-1.2mol/L盐酸8-12ml室温浸泡40-60min，沸水浴3-5min后置于冰上冷却，3500-5000rpm/min离心5-15min，弃上清，沉淀用蒸馏水洗涤1-2次，离心；

将离心后的沉淀加入18-22ml丙酮，室温下以80-100rpm/min振荡4-6h得到类胡萝卜素浸提液；

将所述类胡萝卜素浸提液3500-5000rpm/min离心10-20min,收集上清液，将所述上清液于35-45℃真空浓缩除去丙酮，得到类胡萝卜素。

说明书

一种高产类胡萝卜素蛹虫草培养方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物制品领域，具体而言，涉及一种高产类胡萝卜素蛹虫草培养方法。

背景技术

[0002] 随着人们生活水平的提高，人们对身体健康的重视度也在不断提高。天然来源食用色素以及保健品以安全无毒、有效提高身体机能等性质也越来越受到人们的喜爱和重视。天然类胡萝卜素(carotenoid)是一种天然来源食用色素，由八个异戊二烯组成的萜类化合物，颜色涵盖黄色到暗红色。国内外研究表明，几乎所有类胡萝卜素均有增强免疫力、消除体内自由基、抗心血管疾病和抗肿瘤等功能，β-类胡萝卜素和α-类胡萝卜素分别为维生素A和D的前体等。类胡萝卜素作为食品添加剂和营养增补剂，已经得到美国FDA、欧洲共同体、世界卫生组织等组织的认可。

[0003] 类胡萝卜素可由植物、藻类、光合细菌、某些非光合细菌以及真菌合成。目前市面上所使用的天然类胡萝卜素主要由植物提取得到，但其受到环境和时间的限制。由于微生物发酵法生产类胡萝卜素不受环境条件限制、提取工艺简单、有利于工业化生产等特点，逐渐受到国内外普遍重视。

[0004] 蛹虫草(cordycepes militaris)又称北虫草、北冬虫夏草，是真菌寄生于鳞翅目等昆虫的虫体上形成的虫菌复合体，是一种具有滋补作用的重要和营养品。蛹虫草具有抗肿瘤、抗炎等多种药力功效，它已经在东亚地区被广泛作为滋补品及药用菌使用，我国卫生部于2009年3月16日正式将其列为新资源食品。采用蛹虫草生产类胡萝卜素的研究较少，其中，已有的采用蛹虫草进行液体静置发酵，收集发酵液液面上的菌丝用乙醇进行提取，存在发酵时间长、菌丝体得率和类胡萝卜素提取率偏低等缺点；已有的将蛹虫草进行固体培养，收集培养后所得蛹虫草子实体、菌丝体或培养基残渣，破壁后用丙酮、甲醇和乙醇中至少一种有机溶剂进行提取，存在培养时间长耗能大、提取次数多造成成本上升以及类胡萝卜素的提取率不稳定等缺点。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供蛹虫草种子培养基、蛹虫草生长培养基以及一种高产类胡萝卜素蛹虫草培养方法，以解决上述的问题。

[0006] 在本发明的实施例中提供了一种半合成改良沙氏培养基，按重量份计，包括以下成分：麦芽糖3-8份、葡萄糖15-25份、蛋白胨5-15份、酵母膏3-8份、大米粉30-60份、水800-1200份。

[0007] 进一步地，所述半合成改良沙氏培养基还包括质量百分比为1.5-3％的琼脂粉。

[0008] 本发明实施例中还提供了一种发酵培养基，按重量份计，包括以下成分：大米粉25-35份、玉米粉或苦荞粉40-50份、亮氨酸0.3-0.5份、磷酸二氢钾0.05-0.2份、氯化钾
0.01-0.1份、硫酸镁0.01-0.1份、硫酸亚铁0.001-0.003份、水80-120份。

[0009] 一种高产类胡萝卜素蛹虫草培养方法，包括以下步骤：

[0010] (a)将蛹虫草进行活化培养，制得孢子悬液；

[0011] (b)将所述孢子悬液接种于权利要求1所述的半合成改良沙氏培养基中进行培养，得到种子液；

[0012] (c)将所述种子液接种于权利要求3所述的发酵培养基中进行培养，得到蛹虫草培养物；

[0013] (d)对所述蛹虫草培养物进行类胡萝卜素的提取。

[0014] 优选地，在所述步骤(b)中，所述孢子悬液的浓度为1-5×108cfu/ml，所述孢子悬液以体积百分数为5-10％进行接种。

[0015] 优选地，在所述步骤(b)中，所述培养为：培养温度20-30℃，转速200-250rpm/min，避光培养。

[0016] 优选地，在所述步骤(b)中，培养60-80h，得到所述种子液。

[0017] 优选地，在所述步骤(c)中，所述种子液以体积百分数为8-10％进行接种。

[0018] 优选地，在所述步骤(c)中，所述培养为25±3℃避光培养3-5天；然后23±3℃光照培养6-8天，光照强度为250-300Lux，每天光照12-14h，每2天摇瓶1次。

[0019] 优选地，所述步骤(d)具体为：

[0020] 将所述蛹虫草培养物烘干，每克烘干的蛹虫草培养物加入0.8-1.2mol/L盐酸8-12ml室温浸泡40-60min，沸水浴3-5min后置于冰上冷却，3500-5000rpm/min离心5-15min，弃上清，沉淀用蒸馏水洗涤1-2次，离心；

[0021] 将离心后的沉淀加入18-22ml丙酮，室温下以80-100rpm/min振荡4-6h得到类胡萝卜素浸提液；

[0022] 将所述类胡萝卜素浸提液3500-5000rpm/min离心10-20min,收集上清液，将所述上清液于35-45℃真空浓缩除去丙酮，得到类胡萝卜素。

[0023] 本发明实施例提供的高产类胡萝卜素蛹虫草培养方法，将孢子悬液接种于本发明提供的半合成改良沙氏培养基中培养，得到种子液，将种子液接种于本发明提供的发酵培养基进行培养，培养时间较短，将得到的蛹虫草培养物提取类胡萝卜素，提取次数少，且提取得率稳定，得到的类胡萝卜素的产量高。

具体实施方式

[0024] 下面通过具体的实施例子对本发明做进一步的详细描述。

[0025] 本发明实施例提供的半合成改良沙氏培养基，按重量份计，包括以下成分：麦芽糖3-8份、葡萄糖15-25份、蛋白胨5-15份、酵母膏3-8份、大米粉30-60份、水800-1200份。

[0026] 进一步地，按重量份计，所述半合成改良沙氏培养基包括以下成分：麦芽糖4-6份，葡萄糖18-22份，蛋白胨8-12份，酵母膏4-6份，大米粉40-50份，水900-1100份。

[0027] 其中，上述的大米粉粒度为1-4mm，优选地，大米粉粒度为2-3mm。

[0028] 得到的半合成改良沙氏培养基营养全面，培养基成分浓度及配比合适；将蛹虫草的孢子悬液接种至本培养基，用蛹虫草菌体生长快速，孢子数扩增快，得到的种子液菌体含量高，且菌体的生长旺盛。

[0029] 进一步地，所述半合成改良沙氏培养基还包括质量百分比为1.5-3％的琼脂粉。加入质量百分比为1.5-3％的琼脂粉，经高温高压灭菌后，得到固态的半合成改良沙氏培养基。

[0030] 本发明实施例中还提供了一种发酵培养基，按重量份计，包括以下成分：大米粉25-35份、玉米粉或苦荞粉40-50份、亮氨酸0.3-0.5份、磷酸二氢钾0.05-0.2份、氯化钾
0.01-0.1份、硫酸镁0.01-0.1份、硫酸亚铁0.001-0.003份、水80-120份。

[0031] 进一步地，按重量份计，包括以下成分：大米粉28-32份、玉米粉或苦荞粉43-47份、亮氨酸0.3-0.5份、磷酸二氢钾0.05-0.1份、氯化钾0.03-0.08份、硫酸镁0.03-0.08份、硫酸亚铁0.001-0.002份、水90-110份。

[0032] 其中，上述的大米粉、玉米粉以及苦荞粉的粒度均为1-4mm，优选地，所述大米粉、玉米粉以及苦荞粉的粒度均为2-3mm。

[0033] 得到的发酵培养基呈半固态，其营养全面，培养基成分浓度及配比合适；将蛹虫草的种子液接种至本培养基，菌体生长旺盛，节约菌体的发酵周期。

[0034] 其中，分别将半合成改良沙氏培养基和发酵培养基各自含有的成分称取后混合，均采用高温高压灭菌，具体为121℃，灭菌20-30min，灭菌后冷却至室温，得到可直接用于培养菌株的培养基，灭菌后各物质成分分布均一。

[0035] 一种高产类胡萝卜素蛹虫草培养方法，包括以下步骤：

[0036] (a)将蛹虫草进行活化培养，制得孢子悬液；

[0037] (b)将所述孢子悬液接种于权利要求1所述的半合成改良沙氏培养基中进行培养，得到种子液；

[0038] (c)将所述种子液接种于权利要求3所述的发酵培养基中进行培养，得到蛹虫草培养物；

[0039] (d)对所述蛹虫草培养物进行类胡萝卜素的提取。

[0040] 蛹虫草购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CICC14013。采用本发明提供的半合成改良沙氏培养基和发酵培养基进行蛹虫草的培养，培养方法简单，培养周期短，成本低，得到的蛹虫草类胡萝卜素含量高，且得到的蛹虫草培养物无其他杂质，防止了其他物质对提取物的污染。

[0041] 在所述步骤(a)中，蛹虫草活化培养采用沙氏琼脂改良固体培养基，沙氏琼脂改良培养基成分为：麦芽糖5g、蛋白胨10g、酵母膏5g、琼脂20g、葡萄糖20g、水1000ml，将沙氏琼脂改良培养基成分称取后于121℃，灭菌20-30min，冷却即得沙氏琼脂改良固体培养基。将蛹虫草菌株接种于沙氏琼脂改良固体培养基上活化，培养温度25±2℃，避光培养7天。将沙氏琼脂改良固体培养基上用含有体积百分数为0.04-0.06％的吐温80的无菌水洗下菌体，混合得到孢子悬液。

[0042] 优选地，在所述步骤(b)中，所述孢子悬液的浓度为1-5×108cfu/ml，所述孢子悬8
液以体积百分数为5-10％进行接种。孢子悬液制成浓度为1-5×10cfu/ml，以5-10％的体积百分比进行接种，生长速度快，节约培养时间。

[0043] 优选地，在所述步骤(b)中，所述培养为：培养温度20-30℃，转速200-250rpm/min，避光培养。经验证，培养温度为20-30℃，蛹虫草在半合成改良沙氏培养基中生长快速；转速200-250rpm/min，在不损害蛹虫草孢子的情况下，增加溶氧量，同时可以将半合成改良沙氏培养基混合均匀，利于孢子和菌丝体生长。

[0044] 优选地，在所述步骤(b)中，培养60-80h，得到所述种子液。得到的种子液菌体含量高，且生长旺盛。

[0045] 优选地，在所述步骤(c)中，所述种子液以体积百分数为8-10％进行接种。以8-10％的体积百分数进行接种，得到的发酵液中含有足够多的蛹虫草菌体，其生长速度快，节约培养时间。

[0046] 优选地，在所述步骤(c)中，所述培养为25±3℃避光培养3-5天；然后23±3℃光照培养6-8天，光照强度为250-300Lux，每天光照12-14h，每2天摇瓶1次，这样培养得到的类胡萝卜素含量更高。

[0047] 优选地，所述步骤(d)具体为：

[0048] 将所述蛹虫草培养物烘干，每克烘干的蛹虫草培养物加入0.8-1.2mol/L盐酸8-12ml室温浸泡40-60min，沸水浴3-5min后置于冰上冷却，3500-5000rpm/min离心5-15min，弃上清，沉淀用蒸馏水洗涤1-2次，离心；

[0049] 将离心后的沉淀加入18-22ml丙酮，室温下以80-100rpm/min振荡4-6h得到类胡萝卜素浸提液；

[0050] 将所述类胡萝卜素浸提液3500-5000rpm/min离心10-20min,收集上清液，将所述上清液于35-45℃真空浓缩除去丙酮，得到类胡萝卜素。将所述蛹虫草培养物烘干采用55-65℃烘至含水量为5-7％。采用本方法提取类胡萝卜素，提取方法简单；采用丙酮提取一次，即可将蛹虫草培养物中含有的几乎全部类胡萝卜素提取，得到的类胡萝卜素的提取得率高，且提取得率稳定。

[0051] 本发明实施例提供的高产类胡萝卜素蛹虫草培养方法，将孢子悬液接种于本发明提供的半合成改良沙氏培养基中培养，得到种子液，将种子液接种于本发明提供的发酵培养基进行培养，培养时间较短，将得到的蛹虫草培养物提取类胡萝卜素，提取次数少，且提取得率稳定，得到的类胡萝卜素的产量高。

[0052] 实施例1

[0053] 按重量份计，称取以下成分：麦芽糖3份、葡萄糖15份、蛋白胨5份、酵母膏3份、大米粉30份、水800份；然后121℃，灭菌20min，灭菌后冷却至室温，得到半合成改良沙氏培养基，其中，大米粉粒度为1-2mm；

[0054] 按重量份计，称取以下成分：大米粉25份、玉米粉40份、亮氨酸0.3份、磷酸二氢钾0.05份、氯化钾0.01份、硫酸镁0.01份、硫酸亚铁0.001份、水80份；然后121℃，灭菌20min，灭菌后冷却至室温，得到发酵培养基，其中，大米粉和玉米粉的粒度均为1-2mm；

[0055] 高产类胡萝卜素蛹虫草培养方法，包括以下步骤：

[0056] (a)将蛹虫草接种在沙氏琼脂改良固体培养基进行活化培养，培养温度25±2℃，避光培养7天；将沙氏琼脂改良固体培养基上用含有体积百分数为0.04％的吐温80的无菌水洗下菌体，混合得到孢子悬液；其中，沙氏琼脂改良培养基成分为：麦芽糖5g、蛋白胨10g、酵母膏5g、琼脂20g、葡萄糖20g、水1000ml，将沙氏琼脂改良培养基成分称取后于121℃，灭菌20min，冷却即得沙氏琼脂改良固体培养基；

[0057] (b)将孢子悬液制成浓度为1×108cfu/ml，然后以体积百分数为7％接种至权利要求1所述的半合成改良沙氏培养基中，以培养温度20℃、转速250rpm/min进行避光培养，培养60h，得到种子液；

[0058] (c)将种子液以体积百分数为8％接种于权利要求3所述的发酵培养基中进行培养，培养条件为25±3℃避光培养3天；然后23±3℃光照培养6天，光照强度为250Lux，每天光照12h，每2天摇瓶1次，得到蛹虫草培养物；

[0059] (d)将蛹虫草培养物于55℃烘干至含水量为7％，每克烘干的蛹虫草培养物加入0.8mol/L盐酸12ml室温浸泡40min，沸水浴3min后置于冰上冷却，3500rpm/min离心15min，弃上清，沉淀用蒸馏水洗涤1次，离心；

[0060] 将离心后的沉淀加入18ml丙酮，室温下以80rpm/min振荡6h得到类胡萝卜素浸提液；

[0061] 将类胡萝卜素浸提液3500rpm/min离心20min,收集上清液，将上清液于35℃真空浓缩除去丙酮，得到呈鲜亮橙黄色的类胡萝卜素，每克烘干的蛹虫草培养物得到类胡萝卜素1500μg。

[0062] 实施例2

[0063] 按重量份计，称取以下成分：麦芽糖4份、葡萄糖18份、蛋白胨8份、酵母膏4份、大米粉40份、水900份；然后121℃，灭菌25min，灭菌后冷却至室温，得到半合成改良沙氏培养基，其中，大米粉粒度为2mm；

[0064] 按重量份计，称取以下成分：大米粉28份、苦荞粉43份、亮氨酸0.4份、磷酸二氢钾0.1份、氯化钾0.03份、硫酸镁0.03份、硫酸亚铁0.002份、水90份；然后121℃，灭菌25min，灭菌后冷却至室温，得到发酵培养基，其中，大米粉和苦荞粉的粒度均为2mm；

[0065] 高产类胡萝卜素蛹虫草培养方法，包括以下步骤：

[0066] (a)将蛹虫草接种在沙氏琼脂改良固体培养基进行活化培养，培养温度25±2℃，避光培养7天；将沙氏琼脂改良固体培养基上用含有体积百分数为0.05％的吐温80的无菌水洗下菌体，混合得到孢子悬液；其中，沙氏琼脂改良培养基成分为：麦芽糖5g、蛋白胨10g、酵母膏5g、琼脂20g、葡萄糖20g、水1000ml，将沙氏琼脂改良培养基成分称取后于121℃，灭菌25min，冷却即得沙氏琼脂改良固体培养基；

[0067] (b)将孢子悬液制成浓度为2×108cfu/ml，然后以体积百分数为5％接种至权利要求1所述的半合成改良沙氏培养基中，以培养温度25℃、转速230rpm/min进行避光培养，培养70h，得到种子液；

[0068] (c)将种子液以体积百分数为9％接种于权利要求3所述的发酵培养基中进行培养，培养条件为25±3℃避光培养5天；然后23±3℃光照培养8天，光照强度为270Lux，每天光照14h，每2天摇瓶1次，得到蛹虫草培养物；

[0069] (d)将蛹虫草培养物于60℃烘干至含水量为6％，每克烘干的蛹虫草培养物加入1mol/L盐酸10ml室温浸泡50min，沸水浴4min后置于冰上冷却，4000rpm/min离心10min，弃上清，沉淀用蒸馏水洗涤2次，离心；

[0070] 将离心后的沉淀加入20ml丙酮，室温下以90rpm/min振荡4h得到类胡萝卜素浸提液；

[0071] 将类胡萝卜素浸提液4000rpm/min离心15min,收集上清液，将上清液于40℃真空浓缩除去丙酮，得到呈鲜亮橙黄色的类胡萝卜素，每克烘干的蛹虫草培养物得到类胡萝卜素2000μg。

[0072] 实施例3

[0073] 按重量份计，称取以下成分：麦芽糖6份、葡萄糖22份、蛋白胨12份、酵母膏6份、大米粉50份、水1100份；然后121℃，灭菌30min，灭菌后冷却至室温，得到半合成改良沙氏培养基，其中，大米粉粒度为3mm；

[0074] 按重量份计，称取以下成分：大米粉32份、玉米粉47份、亮氨酸0.5份、磷酸二氢钾0.2份、氯化钾0.08份、硫酸镁0.08份、硫酸亚铁0.003份、水110份；然后121℃，灭菌30min，灭菌后冷却至室温，得到发酵培养基，其中，大米粉和玉米粉的粒度均为3mm；

[0075] 高产类胡萝卜素蛹虫草培养方法，包括以下步骤：

[0076] (a)将蛹虫草接种在沙氏琼脂改良固体培养基进行活化培养，培养温度25±2℃，避光培养7天；将沙氏琼脂改良固体培养基上用含有体积百分数为0.06％的吐温80的无菌水洗下菌体，混合得到孢子悬液；其中，沙氏琼脂改良培养基成分为：麦芽糖5g、蛋白胨10g、酵母膏5g、琼脂20g、葡萄糖20g、水1000ml，将沙氏琼脂改良培养基成分称取后于121℃，灭菌30min，冷却即得沙氏琼脂改良固体培养基；

[0077] (b)将孢子悬液制成浓度为4×108cfu/ml，然后以体积百分数为10％接种至权利要求1所述的半合成改良沙氏培养基中，以培养温度30℃、转速200rpm/min进行避光培养，培养60h，得到种子液；

[0078] (c)将种子液以体积百分数为10％接种于权利要求3所述的发酵培养基中进行培养，培养条件为25±3℃避光培养5天；然后23±3℃光照培养8天，光照强度为300Lux，每天光照12h，每2天摇瓶1次，得到蛹虫草培养物；

[0079] (d)将蛹虫草培养物于65℃烘干至含水量为5％，每克烘干的蛹虫草培养物加入1.2mol/L盐酸12ml室温浸泡60min，沸水浴5min后置于冰上冷却，5000rpm/min离心5min，弃上清，沉淀用蒸馏水洗涤2次，离心；

[0080] 将离心后的沉淀加入22ml丙酮，室温下以100rpm/min振荡4h得到类胡萝卜素浸提液；

[0081] 将所述类胡萝卜素浸提液5000rpm/min离心10min,收集上清液，将所述上清液于45℃真空浓缩除去丙酮，得到呈鲜亮橙黄色的类胡萝卜素，每克烘干的蛹虫草培养物得到类胡萝卜素1800μg。

[0082] 实施例4

[0083] 按重量份计，称取以下成分：麦芽糖8份、葡萄糖25份、蛋白胨15份、酵母膏8份、大米粉60份、水1200份；然后121℃，灭菌30min，灭菌后冷却至室温，得到半合成改良沙氏培养基，其中，大米粉粒度为4mm；

[0084] 按重量份计，称取以下成分：大米粉35份、苦荞粉50份、亮氨酸0.5份、磷酸二氢钾0.2份、氯化钾0.1份、硫酸镁0.1份、硫酸亚铁0.003份、水120份；然后121℃，灭菌30min，灭菌后冷却至室温，得到发酵培养基，其中，大米粉和苦荞粉的粒度均为4mm；

[0085] 高产类胡萝卜素蛹虫草培养方法，包括以下步骤：

[0086] (a)将蛹虫草接种在沙氏琼脂改良固体培养基进行活化培养，培养温度25±2℃，避光培养7天；将沙氏琼脂改良固体培养基上用含有体积百分数为0.06％的吐温80的无菌水洗下菌体，混合得到孢子悬液；其中，沙氏琼脂改良培养基成分为：麦芽糖5g、蛋白胨10g、酵母膏5g、琼脂20g、葡萄糖20g、水1000ml，将沙氏琼脂改良培养基成分称取后于121℃，灭菌30min，冷却即得沙氏琼脂改良固体培养基；

[0087] (b)将孢子悬液制成浓度为5×108cfu/ml，然后以体积百分数为10％接种至权利要求1所述的半合成改良沙氏培养基中，以培养温度30℃、转速250rpm/min进行避光培养，培养80h，得到种子液；

[0088] (c)将种子液以体积百分数为10％接种于权利要求3所述的发酵培养基中进行培养，培养条件为25±3℃避光培养3天；然后23±3℃光照培养6天，光照强度为300Lux，每天光照12h，每2天摇瓶1次，得到蛹虫草培养物；

[0089] (d)将蛹虫草培养物于60℃烘干至含水量为6％，每克烘干的蛹虫草培养物加入1.0mol/L盐酸10ml室温浸泡60min，沸水浴5min后置于冰上冷却，4500rpm/min离心15min，弃上清，沉淀用蒸馏水洗涤2次，离心；

[0090] 将离心后的沉淀加入22ml丙酮，室温下以100rpm/min振荡6h得到类胡萝卜素浸提液；

[0091] 将所述类胡萝卜素浸提液4500rpm/min离心20min,收集上清液，将所述上清液于40℃真空浓缩除去丙酮，得到呈鲜亮橙黄色的类胡萝卜素，每克烘干的蛹虫草培养物得到类胡萝卜素1900μg。

[0092] 本发明实施例提供的高产类胡萝卜素蛹虫草培养方法，将孢子悬液接种于本发明提供的半合成改良沙氏培养基中培养，得到种子液，将种子液接种于本发明提供的发酵培养基进行培养，培养时间较短，将得到的蛹虫草培养物提取类胡萝卜素，提取1次，得到的蛹虫草类胡萝卜素呈鲜亮橙黄色，每克干蛹虫草培养物得到类胡萝卜素1500-2000μg，提取得率高，且提取得率稳定。

[0093] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。