乳杆菌、其组合物与用于制备治疗红斑性狼疮引起的心脏与肝脏病变的应用

摘要

本发明涉及一种乳杆菌、其组合物以及用于治疗红斑性狼疮引起的心脏与肝脏病变的用途，所述组合物包含有效量的下述至少一菌种的分离株：副干酪乳杆菌GMNL‑32、罗伊氏乳杆菌GMNL‑89或罗伊氏乳杆菌GMNL‑263，以及药学上可接受的载剂。通过上述乳杆菌和/或含有它的组合物可治疗红斑性狼疮引起的心脏与肝脏病变。

权利要求

1.一种乳杆菌株用于制备治疗红斑性狼疮引起的心脏与肝脏病变的医药组合物的应用，其中该医药组合物包含有效剂量的该乳杆菌株以及药学上可接受的载体，该乳杆菌株为保藏于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC No.M204012的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)GMNL-32、保藏编号为CCTCC No.M207154的罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)GMNL-89或保藏编号为CCTCC No.M209263的罗伊氏乳杆菌GMNL-263，通过经口给予途径每天每只喂食总菌量1×109CFU/g饲料的该乳杆菌株，以缩小心脏细胞之间的间隙，且专一性抑制肝细胞的基质金属蛋白酶MMP-9、C-反应蛋白CRP、IL-1β、TNF-α、IL-6、诱导型一氧化氮合成酶iNOS及caspase-3的活性。

2.根据权利要求1所述的乳杆菌株在用于制备治疗红斑性狼疮引起的心脏与肝脏病变的医药组合物中的应用，其中该乳杆菌株为活的和/或经不活化的。

3.根据权利要求1所述的乳杆菌株在用于制备治疗红斑性狼疮引起的心脏与肝脏病变的医药组合物中的应用，其中该医药组合物的剂型是选自于由溶液、悬浮液、乳剂、粉末、锭剂、丸剂、糖浆、片剂、口嚼胶、浓浆以及胶囊所组成的族群。

4.根据权利要求3所述的乳杆菌株在用于制备治疗红斑性狼疮引起的心脏与肝脏病变的医药组合物中的应用，其中该锭剂包含口含锭。

说明书

乳杆菌、其组合物与用于制备治疗红斑性狼疮引起的心脏与

肝脏病变的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种乳杆菌株及其应用，特别是涉及一种用于治疗红斑性狼疮引起的心脏与肝脏病变的应用的乳杆菌株及其组合物。

背景技术

[0002] 自体免疫性疾病(Autoimmune disease)是一种人体内自己的免疫系统攻击自己身体正常细胞的疾病，就是正常的免疫能力下降，而异常的免疫能力却突显的一种问题。所谓异常的免疫能力，就是认友为敌，把自己身体里本来不是病毒或细菌的物质，当成病毒或细菌来攻击，希望将之驱出体外。人体内免疫系统的抗体是保护身体的一种生理机制，原本是针对外来的抗原或体内不正常的细胞(如肿瘤细胞)进行攻击与清除。但在一些情形下，免疫系统可能会产生出对抗自己身体内正常细胞(甚至细胞内的各种正常组成部分)的抗体，造成不正常的过度炎症反应或是组织伤害，进而影响身体健康，造成疾病。

[0003] 常见的自体免疫疾病包含：乳糜泻(Coeliac disease)、1型糖尿病(Type 1 Diabetes mellitus)、系统性红斑性狼疮(System Lupus Erythematosus；SLE)、修格连氏症候群或干燥症候群(  syndrome)、多发性硬化症(Multiple sclerosis；MS)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、葛瑞夫兹氏病(Graves'disease)、自发性血小板缺乏紫斑症(Idiopathic thrombocytopenic purpura)、类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis；RA)、再生不良性贫血、多发性肌炎及皮肌炎、硬皮症。

[0004] 系统性红斑性狼疮(Systemic lupus erythematosus；SLE)是一种慢性的全身性自体免疫疾病，会侵犯全身器官或组织，包括皮肤、关节、心脏、血管、肝脏、肾脏、脑部和神经系统。SLE的自然病程多表达为病情的加重与缓解交替，通常无法预知何时发病。任何年龄的人都可能患上红斑性狼疮，但它通常发生于年轻女性，有90％的患者是女性。全身性红斑狼疮的症状千奇百怪，每个人均不尽相同。有些人可能一发病便侵犯重要的器官如中枢神经、肾脏、心脏等，也有人终其一生只有轻微的关节症状。以发生的频率来说，约百分之九十以上的人会关节痛或关节炎，70-80％的患者有皮肤红斑或盘状红斑，40-50％的患者有肋膜炎或心包膜炎，40-50％的患者会发生狼疮肾炎，20-60％的患者有中枢神经侵犯，约60％的患者有白血球低下，20％的患者有血小板低下。

[0005] 目前对SLE的致病原因仍不清楚，但认为与遗传、免疫缺陷、病毒感染、UV及药物等有关。近来研究发现，SLE病患的肝脏异常(例如肝肿大、脾肿大、黄疸、肝功能不正常、肝脏酵素不正常等)、心血管疾病(CVD，例如心肌梗塞(MI))发生率比正常族群高出许多﹐并和动脉粥样硬化有重要关联。在动物模式研究中也发现SLE鼠会有显著肝脏及心脏的炎症反应和细胞凋亡。

[0006] 红斑性狼疮目前无法治愈，但它的症状是可以治疗的，药物是红斑狼疮治疗的非常重要的一环，医师会根据被侵犯器官的不同及其严重度选择适当药物，其中常用来治疗红斑狼疮的药物包括下列几种：

[0007] (一)非类固醇消炎药，简称NSAID

[0008] 可用来治疗关节炎、肋膜炎等较轻的发炎症状。NSAID使用最大的问题就是肠胃的副作用，最近已经有新一代选择性的第二型环氧化脢(COX-2)抑制剂上市。胃肠的副作用较传统的NSAID少得多。

[0009] (二)抗疟药物

[0010] 目前最常用的抗疟药物是羟基氯喹(hydroxychloroquine；商品名plaquenil)。临床经验显示抗疟药物对红斑狼疮的皮肤症状、关节炎及较轻的全身症状有相当不错的疗效，也可减少狼疮复发的机率。

[0011] (三)肾上腺皮质醇

[0012] 即一般俗称的"美国仙丹"或"类固醇"。肾上腺皮质醇是治疗红斑性狼疮最重要的药物。在病况严重、内脏器官受损时，如狼疮肾炎、神经系统狼疮、狼疮肺炎、溶血性贫血或血小板低下等，必须使用大剂量类固醇，必要时医师还会考虑加上大量静脉注射类固醇脉冲疗法，以求能尽快控制病情，待病况控制后再逐渐将剂量减至最低。

[0013] (四)免疫抑制药物

[0014] 免疫抑制药主要的作用是抑制免疫系统的活性，达到控制自体免疫疾病的疗效。这一类的药物通常会和类固醇合用，一方面可以减少类固醇的用量，一方面对较顽固的病情也可以得到有效的控制。常用的免疫抑制剂包括移护宁( azathioprine)、爱得星( cyclophosphamide)、环孢灵(Cyclosporine)、氨基甲基嘌呤
(methotrexate；MTX)等。

[0015] 益生菌(probiotics或probiotic bacteria)一般指源自于人体内、有益于肠道健康的活菌，亦可指外来补充、对身体可能有益的某些微生物，例如乳杆菌(lactic acid bacteria；LAB)和部分酵母菌。人体的免疫系统大约有70％存在于消化道，而早在19世纪末叶，就有俄籍科学家观察到益生菌具有保健效果。过去研究报告显示，有1/3以上的SLE病人会有胃肠道症状，而10％的SLE病人在第一次发病时就有胃肠道病变。目前已知益生菌不仅能恢复肠道菌丛平衡，更具有激发黏膜免疫力、改善肠胃不适及泌尿生殖道菌群。

[0016] 近来，有研究尝试利用乳杆菌治疗系统性红斑性狼疮(SLE)。过去的研究显示，单一乳杆菌可促进抗炎性细胞激素，例如介白素-10(interleukin-10；IL-10)与肿瘤坏死因子-β(tumor necrosis factor-β；TNF-β)等产生，以治疗例如SLE等自体免疫疾病。

[0017] 然而，上述研究鲜少探讨乳杆菌是否可应用于治疗自体免疫疾病症状(例如红斑性狼疮)及其并发症(如：心脏与肝脏病变)，亦未提出乳杆菌株可能涉及的调控机制。

[0018] 有鉴于治疗自体免疫疾病(例如红斑性狼疮)的药物均有其副作用，且需要病患配合长期治疗与控制慢性疾病，亟需利用本土性的乳杆菌株，开发出可治疗自体免疫疾病症状及其并发症的产品，以同时改善、控制、治疗或预防患者的自体免疫疾病(如红斑性狼疮等)相关的症状及相关并发症，进而开发乳杆菌株的其它应用面。

发明内容

[0019] 本发明的目的之一是在提供一种具有治疗自体免疫疾病及其并发症的活性的乳杆菌属物种(Lactobacillus sp.)的分离株。

[0020] 其次，本发明的另一目的提供一种乳杆菌株，其利用前述菌种的分离株，制备治疗自体免疫疾病症状及其并发症的医药组合物。

[0021] 再者，本发明的又一目的提供一种乳杆菌组合物，其含有前述菌种的分离株，通过经口给予途径，可治疗自体免疫疾病症状及其并发症。

[0022] 根据本发明的上述目的，提出一种具有治疗自体免疫疾病及其并发症的活性的乳杆菌属物种(Lactobacillus sp.)的分离株，其中此分离株可包括但不限于副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)GMNL-32、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)GMNL-89和罗伊氏乳杆菌GMNL-263中至少一种或其任意组合。前述副干酪乳杆菌GMNL-32于2004年2月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection；CCTCC；中国武汉，武汉大学)，保藏编号为CCTCC No.M204012。前述罗伊氏乳杆菌GMNL-89于2007年11月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M207154。前述罗伊氏乳杆菌GMNL-263于2009年11月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M209263。

[0023] 根据本发明的另一目的，提出一种乳杆菌株治疗自体免疫疾病症状及其并发症的医药组合物，其中此医药组合物包含有效剂量的乳杆菌株以及药学上可接受的载体，此乳杆菌株可包括但不限于上述乳杆菌属物种的分离株中的至少一种。

[0024] 根据本发明的又一目的，提出一种乳杆菌组合物，其中此乳杆菌组合物包含有效剂量的乳杆菌株以及可食性材料，以治疗自体免疫疾病及其并发症，其中前述乳杆菌株可包括但不限于上述乳杆菌属物种的分离株中的至少一种。

[0025] 依据本发明一实施例，上述乳杆菌株治疗自体免疫疾病症状及其并发症的医药组合物时，菌体可为活的(live)或不活化的(inactive)。其次，上述医药组合物还包含药学上可接受的载体，其可使用已知的任何载体，此处不另赘述。在此补充的是，上述乳杆菌株可设计成健康食品、添加物、医药组合物、饮食补充物、食品等日常生活易于使用的形式。在其它例示中，上述乳杆菌株可以是冷冻干燥的形式，且此乳杆菌株还可包含其它成分，例如葡萄糖、麦芽糊精(maltodextrin)、婴儿奶粉、果寡糖(fructo-oligosaccharides)、硬脂酸镁(magnesium stearate)、优格香料(yogurt spices)、其它难以分离的成分或上述的任意组合。再者，上述乳杆菌株可用以专一性抑制基质金属蛋白酶(Matrix metallopeptidase 9；MMP-9)、C-反应蛋白(C-reactive protein；CRP)、介白素-1β(interleukin-1β；IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α；TNF-α)、IL-6及诱导型一氧化氮合成酶(inducible NO synthase；iNOS)的活性。

[0026] 依据本发明一实施例，上述自体免疫疾病可例如红斑性狼疮。

[0027] 应用本发明的乳杆菌属物种的分离株、含有它的医药组合物与乳杆菌组合物用于治疗自体免疫疾病症状及其并发症时，通过经口给予途径，可同时专一性抑制自体免疫疾病对象的MMP-9、CRP、IL-1β、TNF-α、IL-6及iNOS的活性，由此治疗自体免疫疾病引起的并发症(如：心脏与肝脏病变)，从而开发乳杆菌株的其它应用面。

附图说明

[0028] 为了使本发明的上述和其它目的、特征、优点与实施例更明显易懂，提供附图，在附图中：

[0029] 图1绘示根据本发明多个实施例的SLE小鼠的肝脏重与体重的重量比的条形图。

[0030] 图2A、图3A、图4A、图5A、图6A、图7A以及图8A分别示出根据本发明多个实施例的SLE小鼠肝脏组织的MMP-9的明胶-SDS-PAGE电泳图(图2A)；CRP(图3A)、IL-1β(图4A)、TNF-α(图5A)、IL-6(图6A)、iNOS(图7A)及caspase-3(图8A)的Western印迹法分析照片；以及MMP-9/MMP-2(图2B)、CRP/肌动蛋白(actin)(图3B)、IL-1β/actin(图4B)、TNF-α/actin(图5B)、IL-6/actin(图6B)、iNOS/actin(图7B)及caspase-3/actin(图8B)的含量比的条形图。

[0031] 图2B、图3B、图4B、图5B、图6B、图7B及图8B分别绘示根据本发明多个实施例的SLE小鼠肝脏组织的MMP-9/MMP-2(图2B)、CRP/actin(图3B)、IL-1β/actin(图4B)、TNF-α/actin(图5B)、IL-6/actin(图6B)、iNOS/actin(图7B)及caspase-3/actin(图8B)的含量比的条形图。

[0032] 图9示出根据本发明多个实施例的SLE小鼠CD4+/CD25+脾脏Treg细胞的流式细胞分析结果。

[0033] 图10A至图10D示出根据本发明多个实施例的SLE小鼠心脏组织的Masson三色染色照片。

具体实施方式

[0034] 承前所述，本发明提供一种具有治疗自体免疫疾病及其并发症的活性的乳杆菌属物种(Lactobacillus sp.)的分离株，含有它的医药组合物与乳杆菌组合物，用于治疗自体免疫疾病症状及其并发症，其中此乳杆菌属物种的分离株包含至少一种乳杆菌株，通过经口给予途径可同时降低自体免疫疾病症状及其并发症(如：心脏与肝脏病变)。

[0035] 本发明此处所称的「乳杆菌属物种的分离株」指乳杆菌的分离株，其包含但不限于副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)GMNL-32、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-89或罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-263。前述副干酪乳杆菌GMNL-32于2004年2月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection；CCTCC；中国武汉，武汉大学)，保藏编号为CCTCC No.M204012。前述罗伊氏乳杆菌GMNL-89于2007年11月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M207154。前述罗伊氏乳杆菌GMNL-263于2009年11月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M209263。

[0036] 前述副干酪乳杆菌GMNL-32(亦称GM-080)为已公开的菌种(保藏编号为CCTCC No.M204012)，其相关的菌种特征已公开于中国专利CN100396771C「新的微生物株类干酪乳杆菌GM-080及其治疗过敏相关疾病的用途」，以及中国专利申请案公开号：CN102100704「益生菌株GM-080用于治疗心脏炎性与心脏细胞凋亡的组合物及其用途」。

[0037] 前述罗伊氏乳杆菌GMNL-89亦为已公开的菌种(保藏编号为CCTCC No.M207154)，其相关的菌种特征已公开于中国专利申请公开号：CN102935092「新颖乳杆菌及其组合物和在制备改善糖尿病及其并发症药物中的应用」，以及中国专利CN102115721B「具有抗炎活性的乳杆菌分离株及其用途」。

[0038] 前述罗伊氏乳杆菌GMNL-263亦为已公开的菌种(CCTCC No.M209263)，其相关的菌种特征已公开于中国专利公开号：CN102935092「新颖乳杆菌及其组合物和在制备改善糖尿病及其并发症药物中的应用」以及台湾专利公告号：TW I355939「益生菌株GM-263(ADR-1)用于治疗糖尿病引发的肾纤维化的组合物及其用途」。

[0039] 一般而言，上述乳杆菌株可利用各种已知培养方法获得分离株。本发明此处所称的「分离株」，指前述乳杆菌由单一菌落形成纯培养的菌株，实质上不含其它种类的菌株。

[0040] 在应用时，将上述一或多株纯培养的乳杆菌株，与药学上可接受的载体均匀混合，可制备成含有上述乳杆菌株的医药组成物。前述医药组成物进一步通过具有自体免疫疾病的动物模型(例如SLE小鼠)的分析后，证明可治疗、缓和、控制、改善和/或预防自体免疫疾病引起的心脏与肝脏病变及其相关并发症。

[0041] 简言之，本发明此处所称治疗及改善自体免疫疾病引起的心脏与肝脏病变及其相关并发症，指含有上述乳杆菌株的医药组成物，通过经口给予途径，例如以每天总菌量为每6 11
克约1×10至约1×10 菌落形成单位(CFU)(CFU/g)，连续经口给予至少12周，病患不仅于日常生活中易于使用，更可治疗、缓和、控制、改善和/或预防自体免疫疾病(例如红斑性狼疮)引起动物体内与肝脏病变相关的蛋白质的表达(例如专一性抑制MMP-9、CRP、IL-1β、TNF-α、IL-6及iNOS等的活性)，同时治疗、缓和、控制、改善和/或预防自体免疫疾病引起心脏病变相关的症状(例如恢复心脏重量、减少心肌细胞之间的间隙等)。

[0042] 以下利用多个实施例说明本发明的应用，然而其并非用以限定本发明，本发明技术领域中的技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，可作各种修改与改变。

[0043] 实施例一：动物评估模型的建立

[0044] 1.乳杆菌株的制备

[0045] 此实施例利用副干酪乳杆菌GMNL-32(保藏编号为BCRC 910220)、罗伊氏乳杆菌GMNL-89(保藏编号为BCRC 910340)或罗伊氏乳杆菌GMNL-263(保藏编号为BCRC 910452)，进行SLE动物实验，以评估上述乳杆菌株通过经口给予途径治疗红斑性狼疮引起的心脏与肝脏病变的效果。

[0046] 上述三株乳杆菌株的每天总菌量可分别为每克约1×109CFU/g。上述三株乳杆菌株可以是冷冻干燥的形式，并可包含其它成分，例如葡萄糖、麦芽糊精、婴儿奶粉、果寡糖、硬脂酸镁、优格香料、其它难以分离的成分、或上述的任意组合。

[0047] 2.SLE动物试验模型的建立

[0048] 此实施例的SLE小鼠是以新西兰黑白小鼠杂交第一代(NZB/W F1)雌性小鼠(Jackson Lab，美国)为例，建立SLE动物试验模型。首先，将SLE小鼠随机分成3组实验组及1组对照组，其中每组各为14周龄SLE小鼠8只。实验组的SLE小鼠每天喂食含不同乳杆菌株(分别为副干酪乳杆菌GMNL-32、罗伊氏乳杆菌GMNL-89或罗伊氏乳杆菌GMNL-263，每只喂食约1×109CFU/g)的饲料。对照组的SLE小鼠每天喂食含与上述乳杆菌株等重量的去离子水的基本饲料。

[0049] SLE小鼠的饲养温度为25±1℃、相对湿度为65±5％、并维持12小时切换的光暗循环，以标准实验室等级的饲料喂食，饲养期间不限制饲料及水的供应。SLE小鼠的饲养条件均依循实验动物设施运行管理指南相关实验动物管理指南进行。

[0050] 所有SLE小鼠在喂食12周后秤重、牺牲后，取出肝脏、心脏及冠状动脉并以蒸馏水清洗，分开左右心房与左右心室再进行秤重及后续分析。

[0051] 3.肝脏组织的提取

[0052] 将前述SLE小鼠肝脏置于裂解缓冲溶液中，以100mg组织/1mL裂解缓冲溶液的比例，进行约1分钟，以均质化肝脏组织，进而裂解出肝脏细胞(hepatocyte)内的蛋白质。前述裂解缓冲溶液可包含20mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液、2mM的乙二胺四乙酸(EDTA)、50mM的2-巯基乙醇、10％的甘油、蛋白质酶抑制剂(Roche)、磷酸酶抑制剂混合液(sigma)，pH 7.4。之后，将所得的均质浆(homogenate)置于冰上约10分钟，再以约12000×g的离心力离心40分钟，共离心两次。然后，取上清液并存放于-80℃，以于后续进行相关评估。

[0053] 4.Western印迹法(Western blot)

[0054] 此实施例利用电泳分析与Western印迹法(Western blot)评估上述三株乳杆菌株对于治疗SLE引起的肝脏病变的效果。以下分述之。

[0055] 将上述所得的均质浆，利用10％的硫酸十二酯钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(SDS-PAGE)，以85伏特、3.5小时进行电泳。之后，取下电泳胶，于含有192mM的甘氨酸(glycine)与20％(v/v)的甲醇的25mM的Tris-HCl溶液(pH 8.3)中平衡15分钟。上述SDS-PAGE的制备及其相关设备为本发明所属技术领域中任何技术人员所熟知，在此不另赘述。

[0056] 前述SDS-PAGE的电泳胶，可接着进行Western印迹法分析(Western blotting assay)。在此实施例中，利用Western印迹试剂盒，例如Bio-Rad Scientific Instruments Transfer Unit)，以85伏特、2.5小时，将前述电泳胶的蛋白质转印到转印膜，其中转印膜例如可为聚偏二氟乙烯转印膜(polyvinylidene difluoride membrane，PVDF膜；孔径0.45m；Millipore,Bedford,MA,U.S.A.)。之后，加入5％脱脂奶粉溶于TBS缓冲液(Tris-Base，NaCl，Tween-20，pH 7.4)中作为封闭溶液，于室温约1小时后，加入一级抗体(以抗体结合溶液稀释500倍，抗体结合溶液的配方后述)，于4℃反应至隔天。然后，以TBS缓冲液清洗三次，每次10分钟。随后，加入以TBS缓冲液稀释500倍的二级抗体，于37℃反应1小时后，以TBS缓冲液清洗三次，每次10分钟。而后，加入冷光呈色剂，例如增强型化学冷光(Enhanced Chemi Luminescence；ECL)Western印迹光敏反应试剂(Pierce Biotechnology Inc.,Rockford,IL,USA)，并利用冷光荧光分析仪系统(GELAS-4000,GE Healthcare Life Sciences Inc.,USA)分析判读结果。

[0057] 前述使用的一级抗体例如可针对CRP(Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Texas,USA)、IL-1β(Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Texas,USA)、TNF-α(Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Texas,USA)、IL-6(Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Texas,USA)及iNOS(Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Texas,USA)的单株抗体。前述使用的二级抗体例如可为结合辣根过氧化酶的山羊抗小鼠IgG(goat anti-mouse IgG-HRP)、结合辣根过氧化酶的山羊抗兔IgG(goat anti-rabbit IgG-HRP)、或结合辣根过氧化酶的驴抗山羊IgG(donkey anti-goat IgG-HRP)(以上产品出自Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)(Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Texas,USA)。

[0058] 5.明胶蛋白酶电泳法(Gelatin Zymography Protease Assay)

[0059] 将上述所得的肝脏均质浆，进行下列基质金属蛋白质酶活性测试。将上述肝脏均质浆注入含明胶(0.1％)的SDS-PAGE(8％)中，以100-120伏特、进行电泳3-4小时。然后，取下电泳胶，于2.5％的Triton X-100溶液中摇晃冲洗30分钟一至二次，使蛋白酶功能还原。上述明胶-SDS-PAGE的制备及其相关设备为本发明所属技术领域中任何技术人员所熟知，在此不另赘述。

[0060] 之后，将上述电泳胶置于含有40mM的Tris-HCl(pH 8.0)、10mM CaCl2与0.01％NaN3的溶液中，于37℃反应16小时。随后，再以0.25％的考马斯亮蓝R-250(Coomassie Brilliant Blue R-250；Sigma-Aldrich Inc.USA)染色30分钟，再以脱色溶液(含有875mL dH2O、50mL甲醇以及75mL醋酸)进行脱色。利用市售的影像分析软件/设备，例如光密度测定仪(densitometer；Appraise,Beckman-Coulter,Brea,CA,USA)测量所得电泳胶上的血清MMP-9(约92kDa)、血清MMP-2(约62kDa)的色带浓度后，计算出MMP-9/MMP-2的含量比。

[0061] 上述实验例所得的数据皆以平均值±平均标准差(mean±standard error of mean)表示，并利用SAS 9.1版进行分析，并以Tukey型多重比较检验(Tukey-type multiple comparison test)以t化残差(studentized)比较各组间差异显著性，其中图号＊表示各实验组相较于对照组间具有差异显著性(p＜0.05)。

[0062] 6.免疫组织染色法(Immunohistochemistry,IHC)

[0063] 将利用较佳化切片温度(optimal cutting temperature；OCT)包埋剂包埋好的组织，以市售冷冻切片机切成5μm厚的组织切片，将切片附着于玻片上(此玻片可贮存于-20℃下)。接着，利用Masson三色(Masson Trichrome；Sigma-Aldrich Inc.USA)染色观察，或以α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗体进行间接免疫染色观察，由此观察心脏组织及细胞的形态结构是否产生变化。上述OCT包埋、组织切片、Masson三色等为本发明所属技术领域中技术人员所熟知，此处不再赘述。

[0064] 实施例二：评估乳杆菌株对于治疗SLE引起的肝脏病变的功效

[0065] 1.评估乳杆菌株对于SLE动物肝脏重量的影响

[0066] 实施例一的SLE小鼠经喂食去离子水(对照组)、副干酪乳杆菌GMNL-32、罗伊氏乳杆菌GMNL-89罗伊氏乳杆菌GMNL-263，12周后，其肝脏重与体重的结果如表1所示，而肝脏重与体重的重量比的结果则如表1以及图1所示。

[0067] 表1

[0068]

[0069] 参照表1与图1，其中表1示出根据本发明一实施例的SLE小鼠肝脏重(g)、体重(g)以及肝脏重与体重的重量比的结果，而图1则绘示根据本发明多个实施例SLE小鼠的肝脏重与体重的重量比的条形图，且表1与图1的p<0.05。

[0070] 由表1与图1的结果可知，相较于喂食含去离子水的基本饲料的对照组SLE小鼠，喂食不同乳杆菌株(分别为副干酪乳杆菌GMNL-32、罗伊氏乳杆菌GMNL-89或罗伊氏乳杆菌GMNL-263)的实验组SLE小鼠的肝脏重与体重的重量比，在统计学上并无显著差异。代表喂食上述乳杆菌株并不会对肝脏重与体重造成显著影响。

[0071] 2.评估乳杆菌株对于SLE动物肝脏组织的MMP-9、CRP、IL-1β、TNF-α、IL-6、iNOS及caspase-3表达量的影响

[0072] 参照图2A、图3A、图4A、图5A、图6A、图7A以及图8A，其分别示出根据本发明多个实施例的SLE小鼠肝脏组织的MMP-9的明胶-SDS-PAGE电泳图(图2A)；CRP(图3A)、IL-1β(图4A)、TNF-α(图5A)、IL-6(图6A)、iNOS(图7A)及caspase-3(图8A)的Western印迹法分析照片；以及MMP-9/MMP-2(图2B)、CRP/actin(图3B)、IL-1β/actin(图4B)、TNF-α/actin(图5B)、IL-6/actin(图6B)、iNOS/actin(图7B)及caspase-3/actin(图8B)的含量比的条形图。

[0073] 在图2A中，第1泳道代表市售蛋白质标记，第2-4泳道代表对照组，第5-7泳道代表喂食副干酪乳杆菌GMNL-32的实验组，第8-10泳道代表喂食罗伊氏乳杆菌GMNL-89的实验组，第10-13泳道代表喂食罗伊氏乳杆菌GMNL-263的实验组，并以MMP-2的表达量为内部对照(internal control)组。

[0074] 在图3A、图4A、图5A、图6A、图7A以及图8A中，第1-3泳道代表对照组，第4-6泳道代表喂食副干酪乳杆菌GMNL-32的实验组，第8-10泳道代表喂食罗伊氏乳杆菌GMNL-89的实验组，第10-13泳道代表喂食罗伊氏乳杆菌GMNL-263的实验组，并以肌动蛋白(actin)的表达量为内部对照组。

[0075] 另外，同时参照图2B、图3B、图4B、图5B、图6B、图7B及图8B，其分别绘示根据本发明多个实施例的SLE小鼠肝脏组织的MMP-9/MMP-2(图2B)、CRP/actin(图3B)、IL-1β/actin(图4B)、TNF-α/actin(图5B)、IL-6/actin(图6B)、iNOS/actin(图7B)及caspase-3/actin(图
8B)的含量比的条形图。

[0076] 由图2A与图8B的结果可知，相较于喂食含去离子水的基本饲料的对照组SLE小鼠，喂食副干酪乳杆菌GMNL-32、罗伊氏乳杆菌GMNL-89、罗伊氏乳杆菌GMNL-263的实验组SLE小鼠，确实可有效降低其肝脏的炎性指标(例如血清MMP-9、CRP、IL-1β、TNF-α、IL-6等)以及细胞凋亡(例如caspase-3)的含量。

[0077] 实施例三：评估乳杆菌株对CD4+/CD25+脾脏调节型T(Treg)细胞的功效[0078] 将实施例一各组SLE小鼠的脾脏切成小块后，浸于HBSS水溶液(1g/10mL)以及脱氧核糖核酸酶I(Life Technologies,Inc.,USA)，于37℃反应15分钟。上述HBSS水溶液含有胶原酶I型(0.05mg/mL)、胶原酶IV型(0.05mg/ml)、透明质酸酶(hyaluronidase，0.025mg/ml)以及大豆胰蛋白酶抑制剂(1mg/ml；Life Technologies,Inc.,USA)。接着，利用离心收集细胞后，重新悬浮于HBSS分解溶液(digestion solution)中，于37℃反应15分钟。然后，利用过滤移除未分解的组织块，其余的脾脏细胞以RPMI 1640培养液清洗。之后，利用Ficoll-Paque梯度来分离清洗后的脾脏细胞，以移除死细胞。

[0079] 所得的细胞进行细胞测量分析。以直接共轭抗体将上述细胞的表面标记染色，上述直接共轭抗体为：异硫氰酸盐(FITC)共轭抗-CD4+单株抗体、抗-CD25+单株抗体(BioLegen Inc.,CA,USA)。在表面染色之后，根据供货商的操作手册将细胞固定后，利用流式细胞仪(Becton Dickinson,Mountain View,CA,USA)分析其荧光强度，其结果如图9所示。

[0080] 参照图9，其示出根据本发明多个实施例的SLE小鼠CD4+/CD25+脾脏Treg细胞的流式细胞分析结果，其中左上角的方格显示对照组的结果，左下角的方格显示喂食副干酪乳杆菌GMNL-32的实验组的结果，右上角的方格显示喂食罗伊氏乳杆菌GMNL-89的实验组的结果，而右下角的方格为喂食罗伊氏乳杆菌GMNL-263的实验组的结果。

[0081] 由图9的结果可知，喂食罗伊氏乳杆菌GMNL-263的实验组SLE小鼠，可有效提升其CD4+/CD25+脾脏Treg细胞的比例。

[0082] 实施例四：评估乳杆菌株对于SLE动物心脏的影响

[0083] 1.评估乳杆菌株对于SLE动物心脏重量的影响

[0084] 实施例一的对照组与实验组SLE小鼠经喂食去离子水(对照组)或不同乳杆菌株(副干酪乳杆菌GMNL-32、罗伊氏乳杆菌GMNL-89罗伊氏乳杆菌GMNL-263)12周后，其心脏重、左心室重、体重与胫骨长的相关结果如表2所示。

[0085] 表2

[0086]

[0087] 由表2表的结果可知，相较于对照组SLE小鼠，喂食副干酪乳杆菌GMNL-32、罗伊氏乳杆菌GMNL-89、罗伊氏乳杆菌GMNL-263的SLE小鼠，确实可增加其心脏重、左心室重、体重与胫骨长。

[0088] 2.评估乳杆菌株对于SLE动物心脏组织及细胞的形态结构的影响

[0089] 参照图10A至图10D，其示出根据本发明多个实施例的SLE小鼠心脏组织的Masson三色染色照片，其中图10A代表对照组，图10B代表喂食副干酪乳杆菌GMNL-32的实验组，图10C代表喂食罗伊氏乳杆菌GMNL-89的实验组，图10D代表喂食罗伊氏乳杆菌GMNL-263的实验组。

[0090] 由图10A至图10D的结果可知，相较于对照组SLE小鼠(图10A)，喂食副干酪乳杆菌GMNL-32(图10B)、罗伊氏乳杆菌GMNL-89(图10C)、罗伊氏乳杆菌GMNL-263(图10D)的SLE小鼠，确实可缩小心脏细胞之间的间隙。

[0091] 需补充的是，本发明虽以特定的菌株、特定的分析方法或特定仪器作为例示，说明本发明的乳杆菌株用于制备治疗自体免疫疾病引起的心脏与肝脏病变的医药组合物，但本发明所属技术领域中任何技术人员可知，本发明并不限于此，在不脱离本发明的精神和范围内，本发明的乳杆菌株用于制备治疗自体免疫疾病引起的心脏与肝脏病变的医药组合物亦可使用其它分析方法或仪器进行，其可取的相同技术效果。

[0092] 由上述本发明实施例可知，本发明的乳杆菌属分离株、含有它的医药组合物与乳杆菌组合物用于治疗自体免疫疾病引起的心脏与肝脏病变时，其优点在于上述乳杆菌株本身具有多种有益功能且无副作用，通过经口给予途径可方便病患在日常生活中易于使用，进而治疗、缓和、控制、改善和/或预防自体免疫疾病(例如红斑性狼疮)相关症状及引起的相关并发症(例如心脏与肝脏病变)，从而开发乳杆菌株的其它应用面。

[0093] 虽然本发明已以多个实施例揭露如上，然而其并非用以限定本发明，在本发明所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可作各种修改与改变，因此本发明的保护范围以说明书所界定为准。