一种桉树焦枯病原菌双基因联合PCR检测试剂盒及其使用方法

摘要

本发明公开了一种桉树焦枯病原菌双基因联合PCR检测试剂盒及其使用方法。本发明的试剂盒包括：(1)10×PCR Buffer；(2)25mmol/L Mg2+；(3)10mmol/L dNTP；(4)10mmol/L EF-S-4，10mmol/L EF-A-4，10mmol/L BT-S-9，10mmol/L BT-A-9；其中，引物EF-S-4序列为5＇－CAAGAGTCGGATGGAATCAA－3＇，引物EF-A-4序列为5＇－CACAGGAGGTCGTCAAAC－3＇，引物BT-S-9序列为5＇－TGCGTAAGTGCTCATTCTG－3＇，引物BT-A-9序列为5＇－AACTGGAGGTCGGAGGTA－3＇；(5)5U/μL Taq聚合酶；(6)ddH2O。本发明能够快速、准确的对桉树焦枯病原菌(Cylindrocladium scoparium)进行分子鉴定和桉树焦枯病的早期诊断，对控制桉树焦枯病的检疫及病害的防治具有意义重大。

权利要求

1.一种桉树焦枯病原菌双基因联合PCR检测试剂盒，其特征在于，其包括：(1)10×PCR Buffer；

2+

(2)25mmol/L Mg ；

(3)10mmol/L dNTP；

(4)10mmol/L EF-S-4，10mmol/L EF-A-4，10mmol/L BT-S-9，10mmol/L BT-A-9；其中，引物EF-S-4序列为5＇－CAAGAGTCGGATGGAATCAA－3＇，引物EF-A-4序列为5＇－CACAGGAGGTCGTCAAAC－3＇，引物BT-S-9序列为5＇－TGCGTAAGTGCTCATTCTG－3＇，引物BT-A-9序列为5＇－AACTGGAGGTCGGAGGTA－3＇；

(5)5U/μL Taq聚合酶；

(6)ddH2O。

2.根据权利要求1所述的桉树焦枯病原菌双基因联合PCR检测试剂盒的使用方法，其特征是，其步骤如下：(1)提取纯培养菌株基因组DNA或所取植物组织样总DNA；

2+

(2)PCR扩增体系50μL：10×PCR Buffer 5.0μL，25mmol/L Mg 3μL，10mmol/L dNTP

1.5μL，10mmol/L EF-S-41.0μL，10mmol/L EF-A-41.0μL，10mmol/L BT-S-91.0μL，

10mmol/L BT-A-91.0μL，5U/μL Taq聚合酶0.3μL，ddH2O 32.2μL，加提纯的培养菌株基因组DNA或植物组织样总DNA提取液4.0μL，组成反应混合液；

(3)PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，57℃退火30s，72℃延伸40s，共

35个循环；72℃延伸10min；

(4)PCR产物的电泳检测：扩增结束后取5.0μL PCR产物上样于含0.5μg/mL EB的

1.5％琼脂糖凝胶上电泳，电压为9V/cm、时间为30min，在凝胶成像系统上检测并拍照；如果存在分子量为157bp和272bp的双片段，则判定所述菌株中或植株组织样中存在桉树焦枯病原菌。

说明书

一种桉树焦枯病原菌双基因联合PCR检测试剂盒及其使用

方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是一种桉树焦枯病原菌双基因联合PCR检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

[0002] 桉树与松树、杨树并成为三大世界速生用材林树种，具有较高的经济效益和开发价值。调查显示，世界上的100多个国家均对桉树不同品种有所引进和栽培，但随着桉树种植区域的增加，由Cylindrocladium属病原菌引起的桉树焦枯病发生范围也越来越普遍，其中主要以桉树焦枯病原菌(Cylindrocladium scoparium)为主要致病菌。桉树焦枯病作为一种世界性土传病害，严重影响着桉树的正常生长和材积量的生产，对林业经济的发展产生极大威胁。目前，经报道，在中国广西、福建、海南、四川等多个省市和地区具有桉树焦枯病的发生，桉树焦枯病发生面积甚广，已严重威胁着中国现今桉树的林业生产建设。因此，我国在1996年1月5日便将其列入森林植物检疫对象。综上，检测桉树是否携带焦枯病原菌对于桉树焦枯病的防治意义重大，同时也是减少桉树经济损失的重要保障，亟需建立快速灵敏的检测方法，为桉树焦枯病的防治提供依据。

[0003] 伴随着科学技术的进步，分子生物学的飞速发展，越来越受到人们的接受和认可，如今以利用分子生物学技术为支撑的快速PCR检测技术也被广泛的应用到植物真菌、细菌、放线菌、病毒的检测鉴定中。PCR技术及基于PCR的检测方法因其具有快速、准确、灵敏的特点，使其在植物病害的检测上发挥着越来越重要的作用。双重PCR是标准PCR的发展和完善。双重PCR是指在同一反应体系里加上二对引物，同时扩增出二个核酸片段的PCR反应扩增反应。双重PCR较普通PCR具有更高的特异性和准确度，不仅具有普通PCR操作简单、快速、灵敏度高的特点，而且大大减少了因单一基因PCR扩增而出现假阳性或者检测特异性差的可能性。多基因联合检测是指利用不同的靶基因选择分别进行特异性引物的设计，共同建立检测体系的一种快速检测技术，其各靶基因直接无影响，使得各检测条带清晰明了，对PCR扩增结果的可靠性具有进一步提升。因此，建立桉树焦枯病原菌(Cylindrocladium scoparium)的多基因联合快速PCR检测技术对桉树焦枯病的准确、快速鉴定提供了必须保证。

发明内容

[0004] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术在检测桉树焦枯病原菌中存在的不足，提供了一种桉树焦枯病原菌双基因联合PCR检测试剂盒及其使用方法。

[0005] 本发明的技术方案如下：

[0006] 一种桉树焦枯病原菌双基因联合PCR检测试剂盒，其包括：

[0007] (1)10×PCR Buffer；

[0008] (2)25mmol/L Mg2+；

[0009] (3)10mmol/L dNTP；

[0010] (4)10mmol/L EF-S-4，10mmol/L EF-A-4，10mmol/L BT-S-9，10mmol/L BT-A-9；其中，引物EF-S-4序列为5＇－CAAGAGTCGGATGGAATCAA－3＇，引物EF-A-4序列为5＇－CACAGGAGGTCGTCAAAC－3＇，引物BT-S-9序列为5＇－TGCGTAAGTGCTCATTCTG－3＇，引物BT-A-9序列为5＇－AACTGGAGGTCGGAGGTA－3＇；

[0011] (5)5U/μL Taq聚合酶；

[0012] (6)ddH2O。

[0013] 所述的桉树焦枯病原菌双基因联合PCR检测试剂盒的使用方法，其步骤如下：

[0014] (1)提取纯培养菌株基因组DNA或所取植物组织样总DNA；

[0015] (2)PCR扩增体系50μL：10×PCR Buffer 5.0μL，25mmol/L Mg2+3μL，10mmol/L dNTP 1.5μL，10mmol/L EF-S-41.0μL，10mmol/L EF-A-41.0μL，10mmol/L BT-S-91.0μL，10mmol/L BT-A-91.0μL，5U/μL Taq聚合酶0.3μL，ddH2O 32.2μL，加提纯的培养菌株基因组DNA或植物组织样总DNA提取液4.0μL，组成反应混合液；

[0016] (3)PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，57℃退火30s，72℃延伸40s，共35个循环；72℃延伸10min；

[0017] (4)PCR产物的电泳检测：扩增结束后取5.0μL PCR产物上样于含0.5μg/mL EB的1.5％琼脂糖凝胶上电泳，电压为9V/cm、时间为30min，在凝胶成像系统上检测并拍照；如果存在分子量为157bp和272bp的双片段，则判定所述菌株中或植株组织样中存在桉树焦枯病原菌。

[0018] 本发明提供了用于桉树焦枯病原菌Cylindrocladium scoparium双基因联合PCR检测的两对特异性引物EF-S-4/EF-A-4和BT-S-9/BT-A-9，以及含有两对特异性引物的试剂盒。本发明可快速、准确的对桉树焦枯病原菌Cylindrocladium scoparium进行分子鉴定和桉树焦枯病的早期诊断，对控制桉树焦枯病的检疫及病害的防治具有意义重大。

[0019] 本发明利用beta-tubulin gene序列分析和factor 1-alpha(tef1)gene序列分析技术，设计双基因联合PCR检测引物。该方法可以克服常规PCR检测的稳定性差、重复性差等缺点，同时提高了病害检测的准确性，为其它病害的分子检测提供技术参考，特别对于ITS区同源性高难以区分的种属真菌的鉴定和检测提供参考依据。

附图说明

[0020] 图1为桉树焦枯病原菌双基因联合PCR检测技术实现图。

[0021] 图2为已知供试菌的EF-S-4/EF-A-4和BT-S-9/BT-A-9特异性扩增结果；图中，泳道M为标准分子量大小，泳道1-22是引物EF-S-4/EF-A-4和BT-S-9/BT-A-9对表1中所对应的供试菌株DNA溶液PCR扩增，CK为阴性对照。

[0022] 图3为双重PCR灵敏度检测；图中，泳道M为标准分子量大小DL2000Marker，泳道CK为阴性对照，泳道1-8的桉树焦枯病原菌Cylindrocladium scoparium基因组DNA浓度分别为550ng/μL，55ng/μL，5.5ng/μL，550pg/μL，55pg/μL，5.5pg/μL，550fg/μL，55fg/μL。

[0023] 图4为桉树焦枯病原菌双基因联合PCR检测流程。

[0024] 图5为双基因联合PCR引物检测田间发病植株；图中，泳道M为DL2000Marker，1-8泳道分别为雅安、攀枝花、庐山、广元、重庆、新津、天全、宝兴8个地区的桉树焦枯病组织样品，9为健康组织样品，泳道CK为阴性对照。

具体实施方式

[0025] 以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

[0026] 实施例1

[0027] 图1为桉树焦枯病原菌双基因联合PCR检测技术实现图。

[0028] 主要试剂：DNA提取试剂盒及回收试剂盒均购自天根生化科技公司，引物合成及PCR产物测序交由上海生工生物工程公司完成。

[0029] 1、桉树焦枯病原菌快速分子检测的PCR引物的设计

[0030] 供试菌株来源、名称、寄主、数量等信息详见表1。

[0031] 表1 桉树焦枯病原菌(Cylindrocladium scoparium)及其它参试菌株[0032]

[0033]

[0034] 对表1中的参试真菌利用平板培养法进行纯化培养。将菌株接种在PDA平板，28℃培养5d，使用打孔器取直径为5mm的菌饼分别转接至含有200mL马铃薯-葡萄糖液体(PDB)的锥形瓶中，置于28℃摇床振荡(转速180r/min)培养8d。用灭菌纱布过滤菌丝体后，收集菌丝，灭菌蒸馏水冲洗3次，冷冻干燥，存入灭菌EP管中于-20℃冰箱备用。

[0035] 真菌基因组DNA提取采用CTAB法或试剂盒提取。以CTAB法对病原菌总DNA提取实现为例，其步骤如下：

[0036] (1)取少量菌丝置于研钵中，加液氮后迅速研磨，至菌丝呈白色粉末状；

[0037] (2)迅速转移适量粉末于1.5mL EP管中，加入800μL的裂解液(1ml Lysis Buffer(150mmol/L EDTA，50mmol/L Tris PH8.0，3％SDS))，混匀后于65℃水浴1h；离心(12000r/min，4℃)l0min，取上清；

[0038] (3)加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1(v/v/v)混合有机溶剂，离心(12000r/min，4℃)10min，取上清；

[0039] (4)重复操作(3)方法2次；

[0040] (5)加入2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积3mol/L的醋酸钠溶液，-20℃沉淀1h后离心(12000r/min，4℃)10min，弃上清；

[0041] (6)75％的酒精冲洗3次，待晾干后加入25μL ddH2O溶解沉淀；

[0042] (7)吸取5μL的DNA用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度，其余DNA样品置于-20℃冰箱备用。

[0043] 利 用Cylindrocladium(Calonectria) 属 真 菌 factor 1-alpha(tef1)区 基因通用引物EF1-728F(5＇－CATCGAGAAGTTCGAGAAGG－3＇)，EF2(5＇－GGA(G/A)GTACCAGT(G/C)ATCATGTT－3＇)和beta-tubulin gene区基因通用引物BT-T1-S(5＇－AACATGCGTGAGATTGTAAGT－3＇)，BT-CYLTUBIR-A(5＇－AGTTGTCGGGACGGAAGAG－3＇)分别对桉树焦枯病原菌(Cylindrocladium scoparium)进行常规PCR扩增，二者扩增体系和程序相同如下。

[0044] PCR扩增体系(50μL)：10×PCR Buffer 5.0μL，25mmol/L Mg2+3μL，10mmol/L dNTP 1.5μL，EF1-728F(BT-T1-S)(10mmol/L)1.5μL，EF2(BT-CYLTUBIR-A)(10mmol/L)1.5μL，Taq聚合酶(5U/μL)0.3μL，ddH2O33.2μL，模板DNA 4.0μL。

[0045] PCR反应条件：94℃热启动5min；94℃变性40s，58℃退火40s，72℃延伸40s，循环30次；最后72℃延伸7min。

[0046] PCR产物送往上海生工生物工程公司进行测序。根据测序结果，结合GENEbank中已知Cylindrocladium属菌株的factor 1-alpha(tef1)gene和beta-tubulin gene区序列，比对后利用软件Premier 6.0分别进行桉树焦枯病原菌(Cylindrocladium scoparium)在各自基因保守区域内的特异性引物的设计，通过基因库Blast比对验证引物的特异性。

[0047] 设计的引物序列如下：

[0048] (1)factor 1-alpha(tef1)gene区：

[0049] 上游引物：EF-S-45＇－CAAGAGTCGGATGGAATCAA－3＇

[0050] 下游引物：EF-A-45＇－CACAGGAGGTCGTCAAAC－3＇，目的片段扩增大小为272bp。

[0051] (2)beta-tubulin gene区

[0052] 上游引物：BT-S-95＇－TGCGTAAGTGCTCATTCTG－3＇

[0053] 下游引物：BT-A-95＇－AACTGGAGGTCGGAGGTA－3＇，目的片段扩增大小为157bp。

[0054] 2、特异性引物的检验

[0055] 用合成的特异性桉树焦枯病原菌(Cylindrocladium scoparium)引物EF-S-4/EF-A-4和BT-S-9/BT-A-9同时对参试菌株的基因组DNA进行扩增，检测其特异性。

[0056] PCR扩增体系(50μL)：10×PCR Buffer 5.0μL，25mmol/L Mg2+3μL，10mmol/L dNTP 1.5μL，EF-S-4(10mmol/L)1.0μL，EF-A-4(10mmol/L)1.0μL，BT-S-9(10mmol/L)1.0μL，BT-A-9(10mmol/L)1.0μL，Taq聚合酶(5U/μL)0.3μL，ddH2O 32.2μL，模板DNA4.0μL。

[0057] PCR反应条件：94℃热启动5min；94℃变性45s，57℃退火30s，72℃延伸40s，循环35次，最后72℃延伸10min。

[0058] 同时用ddH2O代替模板DNA作为阴性对照。扩增结束后取5.0μL PCR产物上样于含0.5μg/mL EB的1.5％琼脂糖凝胶上电泳，电压为9V/cm、时间为30min，在凝胶成像系统上检测并拍照。

[0059] 扩增反应结果见图2，结果显示：桉树焦枯病原菌(Cylindrocladium scoparium)可扩增出两条明亮条带，大小分别为272bp和157bp，而其他同属和非同属参试菌、对照组都没有扩增出条带。通过片段回收测序及与现有的Cylindrocladium scoparium序列比对发现同源率为100％，证明该引物可以从混合DNA样中准确地检测出桉树焦枯病原菌(Cylindrocladium scoparium)，准确率为100％。因此，说明特异性引物EF-S-4/EF-A-4和BT-S-9/BT-A-9用于桉树焦枯病原菌(Cylindrocladium scoparium)林木病害基因组DAN的PCR扩增均获得成功。

[0060] 3、双基因联合PCR灵敏度检测

[0061] 分别稀释桉树焦枯病原菌Cylindrocladium scoparium基因组DNA到：550ng/μL，55ng/μL，5.5ng/μL，550pg/μL，55pg/μL，5.5pg/μL，550fg/μL，55fg/μL浓度梯度，用于双基因联合PCR灵敏度检测。利用引物BT-S-9/BT-A-9和EF-S-4/EF-A-4组合成双引物扩增桉树焦枯病原菌Cylindrocladium scoparium灵敏度结果(图3)；PCR反应体系和程序同2中的两对引物的特异性检测。双基因联合PCR具有较高检测灵敏度，可达到550fg/μL，完全符合田间检测的要求。

[0062] 实施例2构建桉树焦枯病原菌(Cylindrocladium scoparium)双基因联合PCR检测试剂盒

[0063] 1、桉树焦枯病原菌(Cylindrocladium scoparium)双基因联合PCR检测试剂盒2+
的组分包括：PCR扩增体系(50μL)：10×PCR Buffer 5.0μL，25mmol/L Mg 3μL，10mmol/L dNTP 1.5μL，EF-S-4(10mmol/L)1.0μL，EF-A-4(10mmol/L)1.0μL，BT-S-9(10mmol/L)1.0μL，BT-A-9(10mmol/L)1.0μL，Taq聚合酶(5U/μL)0.3μL，ddH2O 32.2μL。

[0064] 2、桉树焦枯病原菌(Cylindrocladium scoparium)双基因联合PCR检测试剂盒的使用方法，其步骤如下：

[0065] (1)提取纯培养菌株基因组DNA或所取植物组织样总DNA；

[0066] (2)PCR扩增体系(50μL)：10×PCR Buffer 5.0μL，25mmol/L Mg2+3μL，10mmol/L dNTP 1.5μL，EF-S-4(10mmol/L)1.0μL，EF-A-4(10mmol/L)1.0μL，BT-S-9(10mmol/L)1.0μL，BT-A-9(10mmol/L)1.0μL，Taq聚合酶(5U/μL)0.3μL，ddH2O 32.2μL，加提纯的培养菌株基因组DNA或植物组织样总DNA提取液4.0μL，组成反应混合液。

[0067] (3)PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，57℃退火30s，72℃延伸40s，共35个循环；72℃延伸10min。

[0068] (4)PCR产物的电泳检测：扩增结束后取5.0μL PCR产物上样于含0.5μg/mL EB的1.5％琼脂糖凝胶上电泳，电压为9V/cm、时间为30min，在凝胶成像系统上检测并拍照。如果存在分子量为157bp和272bp的双片段，则可判定所述菌株中或植株组织样中存在桉树焦枯病原菌Cylindrocladium scoparium。

[0069] 实施例3桉树焦枯病原菌(Cylindrocladium scoparium)双基因联合PCR检测试剂盒检测野外发病植株

[0070] 图4为桉树焦枯病原菌双基因联合PCR检测流程。

[0071] 1、基因组DNA提取

[0072] 真菌基因组DNA提取采用CTAB法或试剂盒提取。以CTAB法对病原菌总DNA提取实现为例，其步骤如下：

[0073] (1)取少量菌丝置于研钵中，加液氮后迅速研磨，至菌丝呈白色粉末状；

[0074] (2)迅速转移适量粉末于1.5mL EP管中，加入800μL的裂解液(1ml Lysis Buffer(150mmol/L EDTA，50mmol/L Tris PH8.0，3％SDS))，混匀后于65℃水浴1h；离心(12000r/min，4℃)l0min，取上清；

[0075] (3)加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1(v/v/v)混合有机溶剂，离心(12000r/min，4℃)10min，取上清；

[0076] (4)重复操作(3)方法2次；

[0077] (5)加入2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积3mol/L的醋酸钠溶液，-20℃沉淀1h后离心(12000r/min，4℃)10min，弃上清；

[0078] (6)75％的酒精冲洗3次，待晾干后加入25μL ddH2O溶解沉淀；

[0079] (7)吸取5μL的DNA用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度，其余DNA样品置于-20℃冰箱备用。

[0080] 若用试剂盒提取菌丝基因组或病组织DNA，可依TIANGEN公司PlantGenomic DNA Kit说明书所述的方法提取。

[0081] 2、利用试剂盒对所提DNA进行PCR扩增

[0082] PCR扩增体系(50μL)：10×PCR Buffer 5.0μL，25mmol/L Mg2+3μL，10mmol/L dNTP 1.5μL，EF-S-4(10mmol/L)1.0μL，EF-A-4(10mmol/L)1.0μL，BT-S-9(10mmol/L)1.0μL，BT-A-9(10mmol/L)1.0μL，Taq聚合酶(5U/μL)0.3μL，ddH2O 32.2μL，加提纯的培养菌株基因组DNA或植物组织样总DNA提取液4.0μL，组成反应混合液。

[0083] PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，57℃退火30s，72℃延伸40s，共35个循环；72℃延伸10min。

[0084] 3、电泳检测

[0085] 检测结果：扩增结束后取5.0μL PCR产物上样于含0.5μg/mL EB的1.5％琼脂糖凝胶上电泳，电压为9V/cm、时间为30min，在凝胶成像系统上检测并拍照。如果存在分子量为157bp和272bp的双片段，则可判定所述菌株中或植株组织样中存在桉树焦枯病原菌Cylindrocladium scoparium。

[0086] 分别从雅安、攀枝花、庐山、广元、重庆、新津、天全、宝兴8个地区对疑似桉树焦枯病的病害采样，利用双基因联合PCR检测试剂盒进行检测，结果如图5，并通过片段回收测序及与现有的Cylindrocladium scoparium序列比对发现同源率为100％，证明该引物可以从混合DNA样中准确地检测出桉树焦枯病原菌(Cylindrocladium scoparium)，准确率为100％。

[0087] 应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。