本发明提供一种HPV高危型分型荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括核酸释放剂和两种或以上的PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷(surfactin)0.01～0.5mmol/L，氯化钾20～300mmol/L，十二烷基磺酸钠0.01～2％和乙醇0.05～1％；其中有一种PCR反应液中包含高危HPV16型和/或18型的引物探针序列，另有一种PCR反应液中包含内标的引物探针序列。应用本发明提供的该试剂盒，可以对疣体表面脱落细胞、妇女宫颈上皮细胞、生殖道分泌物等未知样本中的高危型人乳头瘤病毒的DNA核酸片段进行快速荧光PCR进行分型检测，检测结果可用于高危型人乳头瘤病毒感染的辅助诊断，及宫颈癌的早期筛查、宫颈病变的随访、用于指导疫苗的开发。
1.一种HPV高危型分型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括核酸释放剂和两种或以上的PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷0.01～0.5mmol/L，氯化钾
20～300mmol/L，十二烷基磺酸钠0.01～2％和乙醇0.05～1％；其中有一种PCR反应液中包含高危HPV16型和/或18型的引物探针序列，另有一种PCR反应液中包含内标的引物探针序列；
其中，用于16型、18型和内标扩增和检测的引物探针序列分别为，
16型上游引物：CACAGGAGCCACCCAGAAAG，
16型下游引物：GTCATATACCTCACGTCGCAGTAAC，
16型探针：CCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAAC；
18型上游引物：TCAGAGGAAGAAAACGATGAAATAG，
18型下游引物：CTGGCTTCACACTTACAACACATAC，
18型探针：AATCATCAACATTTACCAGCCCGACG；
内标上游引物：GACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATT，内标下游引物：CCCATAACAGCATCAGGAGTG，内标探针：CAGATCCCCAAAGGACTCAAAGAACC。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中共含任选的2～16种PCR反应液，且在所述2～16种PCR反应液中还共包含高危HPV31型、33型、35型、39型、45型、
51型、52型、53型、56型、58型、59型、66型和68型这13种高危HPV型的引物探针序列中的一种或多种，且每种PCR反应液中含有上述共16种型别中任选的一种或两种型别的引物探针序列；
其中，用于这13种高危HPV型扩增和检测的引物探针序列分别为，
31型上游引物：AGCCAACAACACCACCACATC，
31型下游引物：GCTCTGTTCTTGGTCGCTTAGTAG，
31型探针：TCGCCCGCCGCACACCTTCA；
33型上游引物：ACCGCCCAGCCCCTTAC，
33型下游引物：GTCCGCTGCTTGTTTGTGC，
33型探针：CCGCCTTGGACAATAGAACAGCACG；
35型上游引物：TATTTAGCAGCACAGAACTATCCACT，
35型下游引物：TTGTGATTTGTCTTCTGGGTTTCT，
35型探针：CTACACGCCTACAACACCACCGAGACC；
39型上游引物：CCAGACGGGATGAACCACA，
39型下游引物：CACACCACGGACACACAAATC，
39型探针：AAGCCTCACGGGATACTCTGCGACA；
45型上游引物：TTTGTGTGTCCGTGGTGTGC，
45型下游引物：AAAACCAGCCGTTACAACCC，
45型探针：TCCCCTCCCCGTCTGTACCTTC；
51型上游引物：TCGGATGATGAGGATGAAAATG，
51型下游引物：CCTCTTTGTTTGCCTGTAATTCTT，
51型探针：TACTGAACCTATTAGCAGCACACCTACTCCA；
52型上游引物：CTCCAAGACCTCCGCAGTGT，
52型下游引物：TGTTGTCCCCGCAAAAGG，
52型探针：CACACACCTACAACCACCACAGAAACGA；
53型上游引物：GGTGTGGCTCCTGATCCTGAT，
53型下游引物：TAATGCACACGAGCACCTATTTG，
53型探针：TGCCAAGCCTACTAAAACGCACACC；
56型上游引物：TGTGCGTTTTAGTAGGCTAGGC，
56型下游引物：CAATAATGGCTGCATTTCAATTTC，
56型探针：CATAATAATAATGCACACGAGCACCTATTTG；
58型上游引物：CAGACATTTTTTGGTAGGCTACTG，
58型下游引物：CCAACGCCTGACACAAATCAT，
58型探针：TCCGTGGTTTCTCCTCTGCGTCCT；
59型上游引物：TGGCAATCCAGTATATGAAATAAATG，
59型下游引物：TCTTCCTCGTGCAAATCTAATCTG，
59型探针：ACCATGTCCTTTCAAAAAAACATTTCCA；
66型上游引物：GCCGTAAACGTATTCCCTATTTT，
66型下游引物：CGTTTTACATAGGTATCCGTTG，
66型探针：CTAGGCCGCCACATCGCCATCTG；
68型上游引物：AATAGCAGGAAACTTTACAGGACAG，
68型下游引物：GCACGGTGGGCTTTGGT，
68型探针：CGTGTGCGTCTGCGGTCCTCTC。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中共含8种PCR反应液，且所述8种PCR反应液中分别含有如下型别的引物探针序列：16型和18型，39型和31型，33型和58型，45型和59型，51型和66型，52型和53型，56型和68型，35型和内标。
4.根据权利要求1～3中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸释放剂、PCR反应液、酶混合液、HPV高危型定量参考品、HPV高危型阳性对照和HPV高危型阴性对照。
5.一种HPV高危型分型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括两种或以上的PCR反应液，其中有一种PCR反应液中包含高危HPV16型和/或18型的引物探针序列，另有一种PCR反应液中包含内标的引物探针序列；
其中，用于16型、18型和内标扩增和检测的引物探针序列分别为，
16型上游引物：CACAGGAGCCACCCAGAAAG，
16型下游引物：GTCATATACCTCACGTCGCAGTAAC，
16型探针：CCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAAC；
18型上游引物：TCAGAGGAAGAAAACGATGAAATAG，
18型下游引物：CTGGCTTCACACTTACAACACATAC，
18型探针：AATCATCAACATTTACCAGCCCGACG；
内标上游引物：GACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATT，内标下游引物：CCCATAACAGCATCAGGAGTG，内标探针：CAGATCCCCAAAGGACTCAAAGAACC。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中共含任选的2～16种PCR反应液，且在所述2～16种PCR反应液中还共包含高危HPV31型、33型、35型、39型、45型、
51型、52型、53型、56型、58型、59型、66型和68型这13种高危HPV型的引物探针序列中的一种或多种，且每种PCR反应液中含有上述共16种型别中任选的一种或两种型别的引物探针序列；
其中，用于这13种高危HPV型扩增和检测的引物探针序列分别为，
31型上游引物：AGCCAACAACACCACCACATC，
31型下游引物：GCTCTGTTCTTGGTCGCTTAGTAG，
31型探针：TCGCCCGCCGCACACCTTCA；
33型上游引物：ACCGCCCAGCCCCTTAC，
33型下游引物：GTCCGCTGCTTGTTTGTGC，
33型探针：CCGCCTTGGACAATAGAACAGCACG；
35型上游引物：TATTTAGCAGCACAGAACTATCCACT，
35型下游引物：TTGTGATTTGTCTTCTGGGTTTCT，
35型探针：CTACACGCCTACAACACCACCGAGACC；
39型上游引物：CCAGACGGGATGAACCACA，
39型下游引物：CACACCACGGACACACAAATC，
39型探针：AAGCCTCACGGGATACTCTGCGACA；
45型上游引物：TTTGTGTGTCCGTGGTGTGC，
45型下游引物：AAAACCAGCCGTTACAACCC，
45型探针：TCCCCTCCCCGTCTGTACCTTC；
51型上游引物：TCGGATGATGAGGATGAAAATG，
51型下游引物：CCTCTTTGTTTGCCTGTAATTCTT，
51型探针：TACTGAACCTATTAGCAGCACACCTACTCCA；
52型上游引物：CTCCAAGACCTCCGCAGTGT，
52型下游引物：TGTTGTCCCCGCAAAAGG，
52型探针：CACACACCTACAACCACCACAGAAACGA；
53型上游引物：GGTGTGGCTCCTGATCCTGAT，
53型下游引物：TAATGCACACGAGCACCTATTTG，
53型探针：TGCCAAGCCTACTAAAACGCACACC；
56型上游引物：TGTGCGTTTTAGTAGGCTAGGC，
56型下游引物：CAATAATGGCTGCATTTCAATTTC，
56型探针：CATAATAATAATGCACACGAGCACCTATTTG；
58型上游引物：CAGACATTTTTTGGTAGGCTACTG，
58型下游引物：CCAACGCCTGACACAAATCAT，
58型探针：TCCGTGGTTTCTCCTCTGCGTCCT；
59型上游引物：TGGCAATCCAGTATATGAAATAAATG，
59型下游引物：TCTTCCTCGTGCAAATCTAATCTG，
59型探针：ACCATGTCCTTTCAAAAAAACATTTCCA；
66型上游引物：GCCGTAAACGTATTCCCTATTTT，
66型下游引物：CGTTTTACATAGGTATCCGTTG，
66型探针：CTAGGCCGCCACATCGCCATCTG；
68型上游引物：AATAGCAGGAAACTTTACAGGACAG，
68型下游引物：GCACGGTGGGCTTTGGT，
68型探针：CGTGTGCGTCTGCGGTCCTCTC。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中共含8种PCR反应液，且所述8种PCR反应液中分别含有如下型别的引物探针序列：16型和18型，39型和31型，33型和58型，45型和59型，51型和66型，52型和53型，56型和68型，35型和内标。
一种HPV高危型分型荧光PCR检测试剂盒
技术领域
[0001] 本发明提供一种人乳头瘤病毒(HPV)高危型分型荧光PCR检测试剂盒。
背景技术
[0002] 人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是一类分子量较小的无包膜的双链环状DNA病毒，专性侵染和寄生人体生殖器官及其它组织器官的上皮细胞。在临床上，根据HPV不同亚型致病力大小或致癌危险性大小不同可将HPV分为高危型和低危型两大类。低危型HPV主要引起肛门皮肤及男性外生殖器、女性大小阴唇、尿道口、阴道下段的外生性疣类病变和低度子宫颈上皮内瘤。高危型HPV除可引起外生殖器疣外，更重要的是引起外生殖器癌、宫颈癌及高度子宫颈上皮内瘤变，其病毒亚型主要有HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68型。
[0003] HPV在人群中极易传播扩散，可通过直接或间接接触交叉传染，其感染部位隐蔽，发病隐匿，不易早期发现，可致多种增生性病变，在女性生殖系统所引起的最常见的恶性肿瘤为宫颈癌。全世界每年约有50万妇女宫颈癌新发病例，其中亚洲约占38万；每年约有27万女性死于子宫颈癌。在不同地区、不同经济状况的国家宫颈癌的发病率和死亡率有着显著的差别，其中80％的病例发生在发展中国家。我国每年约有15万宫颈癌新发病例，每年约有3万人死于子宫颈癌，其死亡率居妇科肿瘤的第二位。近年来，宫颈癌病人数目在逐渐上升，并呈年轻化的趋势。
[0004] 对宫颈癌的病因学研究可知，高危HPV持续感染是子宫颈癌的主要致病因素，99.7％宫颈癌患者存在HPV感染。临床研究显示，从HPV的持续感染到一般的宫颈癌前病变并最终发展为宫颈癌大约需要8-10年。因此筛查是目前预防和早期诊断宫颈癌的主要手段。在检出的所有型别中主要有HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68型。早期宫颈病变的治疗效果远比宫颈癌的治疗效果要好得多，因此，快速、准确的检测出HPV高危型的感染，且能够准确分型，对于早期治疗和降低宫颈癌的发病率和死亡率等具有重要的意义。
[0005] 目前，国内外对于宫颈癌的早期筛查方法主要有细胞学检测和分子生物学检测。细胞学的检测方法，有宫颈巴氏(Pap)涂片、阴道镜活检、液基薄层细胞学或薄片制备细胞学检查(TCT)等多种。宫颈巴氏涂片是群体筛查的常规手段，但受取材、涂片制作质量、阅片技术影响，准确性低，假阳性率高，重复性差，敏感性也有限，漏诊率可达30％。TCT法大大改进了细胞学检查的准确性，逐渐取代传统的巴氏法。可观察宫颈上皮血管微小变化的阴道镜检查虽敏感、准确，但会引起不适、操作不便、费用高，不易为广大患者接受。宫颈组织活检有创伤，不利于人群普查。由于宫颈HPV感染多为隐性亚临床感染，且HPV不能在培养环境中稳定生长，大部分HPV感染无临床症状或为亚临床感染但可致严重后果，因此，该感染不能作为一个普通的临床疾病或通过常规筛查计划或性传播疾病调查得以发现，只能通过HPV DNA检测得知。
[0006] 目前HPV DNA的检测主要通过应用分子生物学方法，包括核酸杂交方法、基因芯片技术以及聚合酶链反应(PCR)技术等。其中核酸杂交方法又包括DNA印迹杂交、原位杂交技术、杂交捕获方法和分子导流杂交。基因芯片技术的出现时间不长，其发展势头迅猛，应用十分广泛，但其存在的缺陷限制了其在临床的应用。首先是成本的问题，由于芯片制作的工艺复杂，信号检测也需专门的仪器设备，一般实验室难以承担其高昂的费用，其次在芯片实验技术上还有多个环节尚待提高，如在探针合成方面，如何进一步提高合成效率及芯片的集成程度是研究的焦点。目前认为PCR技术是检测HPV DNA及分型的最好方法。荧光PCR技术是基于传统PCR技术并结合光谱技术而发展起来的一种更灵敏，更特异，更精确的核酸检测技术。检测结果准确，重复性高，能动态反应患者治疗前、后病原体动态变化及与临床的关系，且整个过程中避免了传统PCR需后处理的问题，减少了污染。大量研究表明用PCR技术检测HPV DNA的阳性率远高于其他检测技术，是当今用于HPV感染诊断最常用的有力工具，且能更好的应用于HPV致病、致癌机理的研究之中。
[0007] 结合国内情况，在临床高危型人乳头瘤病毒感染的分型诊断中，实时荧光PCR技术凭借着快速、敏感、特异等优点显示出了其临床诊断的优越性，目前只有极少量荧光PCR诊断试剂盒在临床高危HPV感染诊断中使用，但是缺乏完善的质控体系，操作比较繁琐，灵敏度不高，还需要进一步完善和提高技术水平，使此类产品更加满足临床准确快速诊断的需要。
[0008] 运用PCR技术进行检测主要涉及到两个方面，核酸的提取和核酸的扩增检测。
[0009] 目前国内临床上主要采用煮沸法对人乳头瘤病毒的核酸进行提取：先将分泌物样本浓缩、洗涤，再加裂解液，煮沸，高速离心，取上清为模板。对于浓缩这一步，不同厂家的浓缩效果不一样，有的可以看到沉淀，有的无法看到，看得到沉淀的是因为将病毒与蛋白都浓缩了，这样，导致后面加入裂解液时很难充分混匀；无法看到沉淀，使操作者无法确定吸弃上清时会不会吹打到病毒核酸。
[0010] 临床上检测高危HPV-DNA的方法目前主要是基于实时荧光定量PCR的技术及其改进，实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点(即Ct值)以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果；如果同一反应中有已知浓度的定量参考品或标准品，则可以通过软件自动分析获得标准曲线，由此实现对未知样本的定值(即定量检测)。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出的荧光能量被淬灭基团吸收，呈现淬灭效应；如果扩增过程中有靶序列的存在，随着目标片段的延伸，探针分子逐渐被Taq酶水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光能量转移效应，荧光报告基团发出的荧光信号被荧光检测装置收集。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。试验结束后，可以通过荧光PCR仪自带的软件自动分析数据，可以获得阴阳性结果和样本浓度的定值结果，因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。
[0011] 国内已有一些基于实时荧光定量PCR技术定量检测高危HPV-DNA的试剂盒应用于临床检测中，这些试剂盒所提供的高危型HPV-DNA提取方法主要是煮沸法，其核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本时，经过煮沸裂解、高速离心富集DNA等多个步骤，样本中的DNA存在损耗，尤其对于高浓度的样本，裂解不充分、富集不完全，会造成DNA的大量丢失导致样本定量偏低，同时由于采用了水浴或金属浴的高温加热步骤，容易造成气溶胶污染。且这些试剂盒的检测灵敏度不高，约在10000copies/ml左右；还因没有设置阳性内对照(即内标)，无法监控假阴性，和一般没有预防PCR产物污染的措施。且现有HPV基因分型方法复杂，操作过程繁琐，需要开盖操作，容易污染，现有的荧光PCR分型试剂，所能区分的型别少。另外，受限于其引物探针序列，本领域还需开发出一种检测高危型HPV-DNA特异性好且综合性能优良的分型PCR检测试剂盒。
发明内容
[0012] 本发明的目的在于解决现有高危型人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒的缺陷，提供一种操作快速、方法简便、检测灵敏度高、检测范围宽的高危型人乳头瘤病毒荧光定量PCR分型检测试剂盒，应用该试剂盒，可以对疣体表面脱落细胞、妇女宫颈上皮细胞、生殖道分泌物等未知样本中的高危型人乳头瘤病毒16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、53型、56型、58型、59型、66型、68型这15种型别的DNA核酸片段进行快速荧光PCR进行分型检测，检测结果可用于高危型人乳头瘤病毒感染的辅助诊断，及宫颈癌的早期筛查、宫颈病变的随访、用于指导疫苗的开发。
[0013] 因此，本发明提供一种HPV高危型分型荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括核酸释放剂和两种或以上的PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷(surfactin)0.01～0.5mmol/L，氯化钾20～300mmol/L，十二烷基磺酸钠0.01～2％和乙醇0.05～1％；其中有一种PCR反应液中包含高危HPV16型和/或18型的引物探针序列，另有一种PCR反应液中包含内标的引物探针序列；
[0014] 其中，用于16型、18型和内标扩增和检测的引物探针序列分别为，
[0015] 16型上游引物：CACAGGAGCCACCCAGAAAG，
[0016] 16型下游引物：GTCATATACCTCACGTCGCAGTAAC，
[0017] 16型探针：CCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAAC；
[0018] 18型上游引物：TCAGAGGAAGAAAACGATGAAATAG，
[0019] 18型下游引物：CTGGCTTCACACTTACAACACATAC，
[0020] 18型探针：AATCATCAACATTTACCAGCCCGACG；
[0021] 内标上游引物：GACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATT，
[0022] 内标下游引物：CCCATAACAGCATCAGGAGTG，
[0023] 内标探针：CAGATCCCCAAAGGACTCAAAGAACC。
[0024] 在一种具体的实施方案中，所述试剂盒中共含任选的2～16种PCR反应液，且在所述2～16种PCR反应液中还共包含高危HPV31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、53型、56型、58型、59型、66型和68型这13种高危HPV型的引物探针序列中的一种或多种，且每种PCR反应液中含有上述共16种型别中任选的一种或两种型别的引物探针序列；
[0025] 其中，用于这13种高危HPV型扩增和检测的引物探针序列分别为，
[0026] 31型上游引物：AGCCAACAACACCACCACATC，
[0027] 31型下游引物：GCTCTGTTCTTGGTCGCTTAGTAG，
[0028] 31型探针：TCGCCCGCCGCACACCTTCA；
[0029] 33型上游引物：ACCGCCCAGCCCCTTAC，
[0030] 33型下游引物：GTCCGCTGCTTGTTTGTGC，
[0031] 33型探针：CCGCCTTGGACAATAGAACAGCACG；
[0032] 35型上游引物：TATTTAGCAGCACAGAACTATCCACT，
[0033] 35型下游引物：TTGTGATTTGTCTTCTGGGTTTCT，
[0034] 35型探针：CTACACGCCTACAACACCACCGAGACC；
[0035] 39型上游引物：CCAGACGGGATGAACCACA，
[0036] 39型下游引物：CACACCACGGACACACAAATC，
[0037] 39型探针：AAGCCTCACGGGATACTCTGCGACA；
[0038] 45型上游引物：TTTGTGTGTCCGTGGTGTGC，
[0039] 45型下游引物：AAAACCAGCCGTTACAACCC，
[0040] 45型探针：TCCCCTCCCCGTCTGTACCTTC；
[0041] 51型上游引物：TCGGATGATGAGGATGAAAATG，
[0042] 51型下游引物：CCTCTTTGTTTGCCTGTAATTCTT，
[0043] 51型探针：TACTGAACCTATTAGCAGCACACCTACTCCA；
[0044] 52型上游引物：CTCCAAGACCTCCGCAGTGT，
[0045] 52型下游引物：TGTTGTCCCCGCAAAAGG，
[0046] 52型探针：CACACACCTACAACCACCACAGAAACGA；
[0047] 53型上游引物：GGTGTGGCTCCTGATCCTGAT，
[0048] 53型下游引物：TAATGCACACGAGCACCTATTTG，
[0049] 53型探针：TGCCAAGCCTACTAAAACGCACACC；
[0050] 56型上游引物：TGTGCGTTTTAGTAGGCTAGGC，
[0051] 56型下游引物：CAATAATGGCTGCATTTCAATTTC，
[0052] 56型探针：CATAATAATAATGCACACGAGCACCTATTTG；
[0053] 58型上游引物：CAGACATTTTTTGGTAGGCTACTG，
[0054] 58型下游引物：CCAACGCCTGACACAAATCAT，
[0055] 58型探针：TCCGTGGTTTCTCCTCTGCGTCCT；
[0056] 59型上游引物：TGGCAATCCAGTATATGAAATAAATG，
[0057] 59型下游引物：TCTTCCTCGTGCAAATCTAATCTG，
[0058] 59型探针：ACCATGTCCTTTCAAAAAAACATTTCCA；
[0059] 66型上游引物：GCCGTAAACGTATTCCCTATTTT，
[0060] 66型下游引物：CGTTTTACATAGGTATCCGTTG，
[0061] 66型探针：CTAGGCCGCCACATCGCCATCTG；
[0062] 68型上游引物：AATAGCAGGAAACTTTACAGGACAG，
[0063] 68型下游引物：GCACGGTGGGCTTTGGT，
[0064] 68型探针：CGTGTGCGTCTGCGGTCCTCTC。
[0065] 在本发明中，我们把15种高危HPV型别(HPV16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、53型、56型、58型、59型、66型和68型)和所使用的内标一起简称为16种型别。
[0066] 在本发明中，优选地，所述试剂盒中共含8种PCR反应液，且所述8种PCR反应液中分别含有如下型别的引物探针序列：16型和18型，39型和31型，33型和58型，45型和59型，51型和66型，52型和53型，56型和68型，35型和内标。
[0067] 在一种具体的实施方式中，所述试剂盒包括核酸释放剂、PCR反应液、酶混合液、HPV高危型定量参考品、HPV高危型阳性对照和HPV高危型阴性对照。
[0068] 本发明还提供一种HPV高危型分型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括两种或以上的PCR反应液，其中有一种PCR反应液中包含高危HPV16型和/或18型的引物探针序列，另有一种PCR反应液中包含内标的引物探针序列；
[0069] 其中，用于16型、18型和内标扩增和检测的引物探针序列分别为，
[0070] 16型上游引物：CACAGGAGCCACCCAGAAAG，
[0071] 16型下游引物：GTCATATACCTCACGTCGCAGTAAC，
[0072] 16型探针：CCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAAC；
[0073] 18型上游引物：TCAGAGGAAGAAAACGATGAAATAG，
[0074] 18型下游引物：CTGGCTTCACACTTACAACACATAC，
[0075] 18型探针：AATCATCAACATTTACCAGCCCGACG；
[0076] 内标上游引物：GACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATT，
[0077] 内标下游引物：CCCATAACAGCATCAGGAGTG，
[0078] 内标探针：CAGATCCCCAAAGGACTCAAAGAACC。
[0079] 在一个具体实施方式中，所述试剂盒中共含任选的2～16种PCR反应液，且在所述2～16种PCR反应液中还共包含高危HPV31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、53型、56型、58型、59型、66型和68型这13种高危HPV型的引物探针序列中的一种或多种，且每种PCR反应液中含有上述共16种型别中任选的一种或两种型别的引物探针序列；
其中，用于这13种高危HPV型扩增和检测的引物探针序列如上所示。
[0080] 优选的，所述试剂盒中共含8种PCR反应液，且所述8种PCR反应液中分别含有如下型别的引物探针序列：16型和18型，39型和31型，33型和58型，45型和59型，51型和66型，52型和53型，56型和68型，35型和内标。
[0081] 本发明还提供一种核酸释放剂在HPV高危型分型荧光PCR检测中的应用，所述核酸释放剂包含莎梵婷(surfactin)0.01～0.5mmol/L，氯化钾20～300mmol/L，十二烷基磺酸钠0.01～2％和乙醇0.05～1％。
具体实施方式
[0082] 实施例1
[0083] 本实施例提供一种能检测15种高危型人乳头状瘤病毒并能准确分型的检测试剂盒，它至少由以下组分组成：
[0084] ①核酸释放剂：莎梵婷(surfactin)0.01～0.5mmol/L(质量/体积)，氯化钾(KCl)50～200mmol/L(质量/体积)，十二烷基磺酸钠(SDS)0.01％～2％(质量/体积)，乙醇0.05％～1％(体积/体积)；
[0085] ②PCR反应液：包含HPV16型和18型引物探针序列的第一种PCR反应液，用于检测HPV16型及18型；包含HPV39型和31型引物探针序列的第二种PCR反应液，用于检测HPV39型及31型；包含HPV33型和58型引物探针序列的第三种PCR反应液，用于检测HPV33型及58型；包含HPV45型和59型引物探针序列的第四种PCR反应液，用于检测HPV45型及59型；
包含HPV51型和66型引物探针序列的第五种PCR反应液，用于检测HPV51型及66型；包含HPV52型和53型引物探针序列的第六种PCR反应液，用于检测HPV52型及53型；包含HPV56型和68型引物探针序列的第七种PCR反应液，用于检测HPV56型及68型；包含HPV35型和β-globin引物探针序列的第八种PCR反应液，用于检测HPV35型及内标。其中每种PCR反应液均包括10×PCR反应缓冲液5μl，0.05mmol/L～0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，且八种PCR反应液中相应每种靶核苷酸引物探针序列的浓度均为0.1μmol/L～0.3μmol/L，八种PCR反应液中总共的引物序列记为：HPV16-F与HPV16-R、HPV18-F与HPV18-R、HPV31-F 与 HPV31-R、HPV33-F 与 HPV33-R、HPV35-F 与 HPV35-R、HPV39-F 与 HPV39-R、HPV45-F与HPV45-R、HPV51-F与HPV51-R、HPV52-F与HPV52-R、HPV53-F与HPV53-R、HPV56-F与HPV56-R、HPV58-F与HPV58-R、HPV59-F与HPV59-R、HPV66-F与HPV66-R、HPV68-F 与HPV68-R；八种PCR反应液中总共的探针序列记为：HPV16-P、HPV18-P、HPV31-P、HPV33-P、HPV35-P、HPV39-P、HPV45-P、HPV51-P、HPV52-P、HPV53-P、HPV56-P、HPV58-P、HPV59-P、HPV66-P、HPV68-P；第八种PCR反应液中还包括0.05μmol/L～0.2μmol/L的用于内标片段扩增的上下游引物IC-F与IC-R和0.05μmol/L～0.2μmol/L的用于检测内标的探针IC-P。所述10×PCR反应缓冲液包括pH7.5的200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、
20mmol/L氯化镁溶液、500mmol/L氯化钾溶液、0.2％(体积/体积)曲拉通溶液和10％(体积/体积)甲酰胺溶液；所述脱氧核糖核苷三磷酸为dATP、dCTP、dUTP、dGTP或dTTP；所述引物探针的碱基序列见表1。
[0086] 表1
[0087]
[0088]
[0089] ③酶混合液：耐热DNA聚合酶(Taq酶)1U/μl～5U/μl，尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)0.05U/μl～0.2U/μl；其中UNG酶具有降解含有dU的PCR产物的功能，利用UNG酶和PCR反应液中的dUTP可以起到预防PCR产物污染的作用；
[0090] ④高危HPV定量参考品：来源于使用高危HPV企业定量线性参考品L1～L5定值后的高危HPV强阳性质粒，其特征在于该高危HPV定量参考品包括A、B、C、D四个浓度组成的梯度参考品，其浓度分别为1.00～5.00E+07copies/ml(A)、1.00～5.00E+06copies/ml(B)、1.00～5.00E+05copies/ml(C)、1.00～5.00E+04copies/ml(D)；定量参考品能对15种高危HPV型别检测结果进行定量分析。
[0091] ⑤高危HPV阳性对照：为临床医院收集的HPV高危型强阳性样本，其浓度为1.00～5.00E+05copies/ml。
[0092] ⑥高危HPV阴性对照：为灭菌生理盐水。
[0093] 实施例2
[0094] 将实施例1中的高危型人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒用于检测疣体表面脱落细胞、妇女宫颈上皮细胞、生殖道分泌物等未知样本中的高危HPV-DNA的操作步骤是：
[0095] 一、试剂准备
[0096] 取出试剂盒中的各组分，室温放置，待其温度平衡至室温，混匀后备用；
[0097] 取8种HPV PCR反应液各n份，每份为38～44μl分别与8×n份酶混合液，每份为1～2μl混匀为PCR-mix，瞬时离心后备用。其中，n＝待检样本数+质控品2个，所述质控品即为阴性对照和阳性对照。另外，因含HPV16和18型引物探针的PCR反应液还需做定量参考品的PCR，因此，取该种PCR反应液n+4份。
[0098] 二、在样本处理区进行样本、质控品、定量参考品处理与加样
[0099] 1、样本、质控品预处理：
[0100] 待测样本：往样本收集管中加入1ml无菌生理盐水，充分振荡混匀，然后把全部液体倒入1.5ml灭菌离心管中(棉拭子靠离心管壁挤干后丢弃)，瞬时离心后吸取20～50μl至另一1.5ml灭菌离心管中，加入20～50μl核酸释放剂，充分混匀后作为待测样本备用。
[0101] 阴性对照、阳性对照分别取20～50μl与20～50μl核酸释放剂混匀待用。
[0102] 定量参考品A～D分别取2～5μl与2～5μl核酸释放剂混匀待用。
[0103] 2、加样(阴性对照、阳性对照与待测样本同步处理)
[0104] 每个PCR反应管中分别加入上述处理后的待测样本、阴性对照、阳性对照各4～10μl，需重复8次，即每个样本分别取4～10μl样本和核酸释放剂的混合液加入一个八连管的PCR反应管中；定量参考品A～D和核酸释放剂的混合液仅需要加一次。
[0105] 间隔10分钟以上，各待测样本、阴性对照、阳性对照的8个反应管分别加入40～45μl上述已配制好的8种PCR-mix，其中定量参考品A～D加入配置好的HPV(16、18型)PCR-mix，盖上管盖。
[0106] 三、荧光PCR反应与结果分析(在荧光定量PCR扩增仪上进行)
[0107] 1)将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称及定量参考品浓度。
[0108] 2)荧光检测通道选择：选择FAM通道(Reportere:FAM,Quencher:None)检测HPV16、33、39、45、51、52、56、35-DNA；选择HEX或VIC通道(Reporter:VIC,Quencher:None)检 测 HPV18、31、53、58、59、66、68-DNA 及 β-globin(内 标 )；参 比 荧 光 (Passive Reference)设置为none。
[0109] 3)荧光定量PCR反应条件为：
[0110] 表2
[0111]
[0112] 4)结果分析
[0113] 反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析)，然后记录样本Ct值和定值结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct(即cycle threshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值)；仪器软件根据各样本Ct值大小，通过4个浓度梯度定量参考品绘制的标准曲线，可以自动求得各样本的定值结果。并按下表进行结果判定：
[0114] 表3
[0115]
[0116] 对表3中第1-7种HPV PCR-mix FAM和HEX通道以及第8种HPV PCR-mix FAM通道，若通道测定Ct值≤39，且β-globin检测为阳性(Ct值≤40)的样本，报告相对应的HPV型别阳性。
[0117] 对表3中第1-7种HPV PCR-mix FAM和HEX通道以及第8种HPV PCR-mix FAM通道，若通道测定Ct值≤39，但是β-globin检测为阴性(Ct值>40或无显示)的样本，表明标本内没有宫颈上皮细胞，但该患者近期接触过HPV病毒，病人是否感染HPV不能确定。建议对此样本进行重新取样再进行实验。
[0118] 对表3中第1-7种检测混合液FAM和HEX通道以及第8种检测混合液FAM通道，若测定Ct值都>39，且β-globin检测为阳性(Ct值≤40)的样本，报告高危型人乳头瘤病毒(15型)阴性。
[0119] 对表3中第1-7种检测混合液FAM和HEX通道以及第8种检测混合液FAM通道，若测定Ct值都>39，且β-globin检测Ct值>40或无显示，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重新取样再进行实验。
[0120] 本发明仅能检测出相应型别HPV DNA，不能检测出其他型别HPV DNA及非HBV病原体DNA，说明本发明试剂盒具有很好的特异性。本发明中以如下方式两两组合HPV(16、18型)、HPV(39、31型)、HPV(33、58型)、HPV(45、59型)、HPV(51、66型)、HPV(52、53型)、HPV(56、68型)、HPV(35型、β-globin)形成PCR反应液时为最优选择。本发明对高危型HPV-DNA的提取方法进行了比较和优化，选择了核酸释放的方法，采用强烈的蛋白变性剂，快速破坏病原体外壳蛋白结构，释放出病原体核酸，无需加热即可完成DNA的释放和提取，检测灵敏度可达400copies/ml，定量线性范围为400copies/ml～4.00E+09copies/ml。另外，对PCR反应体系进行了优化组合，利用UNG酶可以降解含dU的DNA链的特点，在PCR体系中添加了UNG酶和dUTP，可以预防前次PCR产物的污染，防止样本检测假阳性；利用内标监控DNA提取和PCR反应过程，监控反应体系是否有效，防止样本检测假阴性。荧光定量PCR扩增结束后，通过曲线形状及Ct值判断HPV高危型-DNA阴阳性，检测结果可用于HPV高危型感染及分型的诊断和宫颈癌的早期筛查。
[0121] 使用本发明中的试剂盒检测中国食品药品检定研究院的人乳头瘤病毒全基因组分型参考品、企业工作参考品，阴阳性参考品符合率为100％，定量线性参考品、灵敏度参考品的检测结果符合质量标准。且精密度试验表明：批内和批间重复性好，检测结果Ct值的变异系数<10％，浓度变异系数<50％。另外，特异性试验表明：与常见性病病原体(CT、NG、HSV、UU等)和低危型HPV(6、11、40、42、43、44等)无交叉反应。
[0122] DNA不同提取方法对HPV高危型-DNA检测的影响试验表明：通过同时检测梯度稀释样本发现，本发明的核酸快速释放法与煮沸法提取核酸的检测结果没有明显差异，而本发明方法操作更为简便快速，无需加热。同时，煮沸法试剂没有内标监测，如提取的DNA中有PCR抑制物存在时，会导致HPV高危型阳性样本检测为阴性，即出现假阴性，本发明的快速检测试剂盒中加入内标的引物探针序列，可以有效监控假阴性的存在。PCR产物污染的预防试验表明：PCR反应体系中加入适量的UNG酶可以预防PCR产物污染。
