一种同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷含量的方法转让专利
申请号 : CN201410292908.4
文献号 : CN104020235B
文献日 : 2016-05-04
发明人 : 师凤华 , 莫乔程 , 赵祥升 , 缪剑华 , 刘凤鸣 , 谭木秀 , 蒲祖宁 , 陈路
申请人 : 广西壮族自治区药用植物园
摘要 :
本发明提供了一种同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷含量的方法，其包括超声波提取和定量分析等，超声波提取时金银花粉末与70％乙醇水溶液的固液比为1∶80-1∶120，提取时间45-60min。UPLC条件为：色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH RP18；流动相：乙腈-0.4％磷酸水；梯度洗脱：0-2min，5％-16％B；2-4min，16％-20％B；4-8min，20％-50％B；8-10min，50％-100％B；10-11min，100％-5％B；检测波长：242nm。本发明方法简单，能够同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷的含量，灵敏度高，精密度和准确度高，重复性好，稳定可靠。
权利要求 :
1.一种同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷含量的方法，其特征在于，能同时对金银花中绿原酸和木犀草苷进行定量分析，其包括以下步骤：超声波提取：取金银花粉末过筛，按照1:80-1:120的固液比，加70％的乙醇水溶液，称定重量，超声提取45-60min，放冷，得金银花提取液；
定量分析：利用UPLC-PDA方法进行定量分析，其中UPLC条件：色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH RP18，其规格为100mm×2.1mm i.d.，1.7μm；室温，流动相：A：B＝0.4％磷酸水：乙腈；梯度洗脱条件：平衡时间为5min；梯度洗脱程序：0～2min，5％～16％B；
2～4min，16％～20％B；4～8min，20％～50％B；8～10min，50％～100％B；10～11min，
100％～5％B；进样量：3μL，检测波长：242nm，体积流量0.2mL/min；在定量分析步骤中还包括：对照品溶液的制备：精密称取绿原酸，木犀草苷对照品：0.889mg，0.920mg，以乙腈-0.4％磷酸水溶液为溶剂，于棕色容量瓶中定容至2mL，作为储备液，其他不同质量浓度的对照品溶液由储备液稀释得到。
2.如权利要求1所述同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷含量的方法，其特征在于，超声波提取步骤中，金银花粉末提前过65-80目筛。
3.如权利要求1所述同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷含量的方法，其特征在于，在定量分析之前进行供试品溶液的制备，包括：取金银花提取液用70％的乙醇水溶液补足重量，摇匀，过滤，过0.22μm微孔滤膜，得供试品溶液。
说明书 :
一种同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷含量的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及金银花有效成分的检测方法，更具体地涉及一种能够同时对金银花的有效成分-绿原酸和木犀草苷进行定量分析的方法。
背景技术
[0002] 金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花，传统中药，具有清热解毒、疏散风热、抗病毒、保肝利胆的功效。金银花主产于河南、山东等地，其主要化学成分为有机酸、三萜类、黄酮类和挥发油等，其中有机酸成分是金银花抑菌、抗病毒的活性成分。绿原酸是金银花的主要有效成分之一，不但作为其原药材的质量控制指标，也是一些成药和制剂的质量控制指标。2010版药典中以绿原酸和木犀草苷为指标性成分对金银花进行质量控制。
[0003] 目前对绿原酸和木犀草苷定量分析的技术和手段主要有：薄层扫描法(TLCS)，毛细管电泳法(CE)，高效液相色谱法(HPLC)，液-质联用技术(LC-MS)等，其中以HPLC法最为普及。超高效液相色谱法(UPLC)是采用小颗粒填料色谱柱(粒径一般小于2μm)和超高压(压力大于105KPa)系统的一种分离技术，相对于HPLC，它更能显著改善色谱峰的分离度和检测灵敏度，同时可以缩短分析时间、减少有机试剂的使用等，目前已广泛应用于中草药的成分分析上。UPLC在金银花中绿原酸的定量分析上已有报道，但如何快速，准确地同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷两种成分含量的方法还有待研究。
发明内容
[0004] 针对上述问题，本发明的目的是提供一种准确、快速而且能同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷的含量的方法。
[0005] 本发明所述同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷含量的方法，包括以下步骤：
[0006] 超声波提取：取金银花粉末过筛，按照1∶80-1∶120的固液比，加70％的乙醇水溶液，称定重量，超声提取45-60min，放冷，得金银花提取液。
[0007] 定量分析：利用UPLC-PDA方法进行定量分析，其中UPLC条件：色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH RP18(100mm×2.1mm i.d.，1.7μm)；室温，流动相：A：B＝0.4％磷酸水：乙腈；梯度洗脱条件：平衡时间为5min；梯度洗脱程序：0～2min，5％～16％B；2～4min，
16％～20％B；4～8min，20％～50％B；8～10min，50％～100％B；10～11min，100％～
5％B；进样量：3μL，检测波长：242nm，体积流量0.2mL/min。
16％～20％B；4～8min，20％～50％B；8～10min，50％～100％B；10～11min，100％～
5％B；进样量：3μL，检测波长：242nm，体积流量0.2mL/min。
[0008] 优选地，超声波提取步骤中，金银花粉末按照1∶120的固液比，加70％的乙醇水溶液，称定重量，超声提取45min，放冷，得金银花提取液。
[0009] 优选地，在定量分析步骤中还包括：对照品溶液的制备：精密称取绿原酸，木犀草苷对照品：0.889mg，0.920mg，以乙腈-0.4％磷酸水溶液为溶剂，于棕色容量瓶中定容至2mL，作为储备液。其他不同质量浓度的对照品溶液由储备液稀释得到。
[0010] 优选地，超声波提取步骤中，金银花粉末过65-80目筛。
[0011] 优选地，在定量分析之前进行供试品溶液的制备，包括：取金银花提取液用70％的乙醇水溶液补足重量，摇匀，过滤，过0.22μm微孔滤膜，得供试品溶液。
[0012] 本发明所述同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷含量的方法，方法简单，能够同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷的含量，具有灵敏度高，精密度和准确度高，重复性好，稳定可靠的优点。
[0013] 1，方法简单，时间短，本发明中采用超声波提取，操作简单，效率高，所述超声波提取步骤中，选用70％的乙醇水溶液大大提高提取效率，缩短了提取时间，发明人研究发现，选用70％的乙醇水溶液作为提取溶剂，提取时间仅仅需要45min即可，大大缩短了提取时间。
[0014] 2，提取效率高，检测结果准确，超声波提取步骤中，金银花粉末按照1∶120的固液比，加70％的乙醇水溶液，称定重量。发明人研究发现，当金银花粉末和70％的乙醇水溶液的固液比低于1∶120时，金银花提取液中绿原酸会有过载现象，当金银花粉末和70％的乙醇水溶液的固液比高于1∶120时，木犀草苷的响应值较低，影响检测结果。
[0015] 3，本发明所述同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷含量的方法，利用超高效液相色谱法(UPLC)，超高效液相色谱法(UPLC)是采用小颗粒填料色谱柱(粒径一般小于2μm)和超高压(压力大于105KPa)系统的一种分离技术，相对于HPLC，它更能显著改善色谱峰的分离度和检测灵敏度，同时可以缩短分析时间、减少有机试剂的使用等。
[0016] 4、本发明利用UPLC-PDA方法同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷的含量，其采用的色谱条件可以实现在较短的分析时间内，使两种物质达到较好的分离。梯度洗脱时，流动相采用0.4％的磷酸水溶液得到的色谱图基线平稳，且绿原酸和木犀草苷的分离度良好；使用RP18柱分离效果较好；当波长为242nm时，其响应值可以准确反应绿原酸和木犀草苷的含量。
[0017] 本发明所述同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷含量的方法能同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷的含量，方法准确、快速、为金银花的质量控制提供了可靠的评价方法。
附图说明
[0018] 图1为本发明所述同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷含量的方法其中一个样品和对照品的UPLC-PDA色谱图。
具体实施方式
[0019] 下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0020] 本发明所述同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷含量的方法，包括以下步骤：
[0021] 超声波提取：取金银花粉末过筛，按照1∶80-1∶120的固液比，加70％的乙醇水溶液，称定重量，超声提取45-60min，放冷，得金银花提取液。
[0022] 定量分析：取金银花提取液用70％的乙醇水溶液补足重量，摇匀，过滤，过0.22μm微孔滤膜，得供试品溶液；
[0023] UPLC条件：色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH RP18(100mm×2.1mm i.d.，1.7μm)；室温，流动相：A：B＝0.4％磷酸水：乙腈；梯度洗脱条件：平衡时间为5min；梯度洗脱程序：0～2min，5％～16％B；2～4min，16％～20％B；4～8min，20％～50％B；8～
10min，50％～100％B；10～11min，100％～5％B；进样量：3μL，检测波长：242nm，体积流量0.2mL/min。
10min，50％～100％B；10～11min，100％～5％B；进样量：3μL，检测波长：242nm，体积流量0.2mL/min。
[0024] 其中，超声波提取步骤中，金银花粉末按照1∶120的固液比，加70％的乙醇水溶液，称定重量，超声提取45min，放冷，得金银花提取液。
[0025] 其中，在定量分析步骤中还包括：对照品溶液的制备：精密称取绿原酸，木犀草苷对照品：0.889mg，0.920mg，以乙腈-0.4％磷酸水溶液为溶剂，于棕色容量瓶中定容至2mL，作为储备液。其他不同质量浓度的对照品溶液由储备液稀释得到。
[0026] 其中，超声波提取步骤中，金银花粉末过65-80目筛。
[0027] 实施例1
[0028] 本发明所述同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷的含量的方法，采用的仪器和材料：
[0029] Waters Acquity UPLC H-Class系统，包括四元泵，真空在线脱气机，自动进样器，PDA检测器，Empower工作站。十万分之一天平(梅特勒公司)；EL204万分之一天平(上海精密仪器有限公司)；KQ-250DE超声波清洗器(昆山市超声波仪器有限公司)。
[0030] 甲醇与乙腈(色谱纯，Fisher公司)，乙醇，磷酸(分析纯，北京化工厂)，双蒸水。对照品绿原酸(NO：110753-201314)和木犀草苷(NO：111720-201106)购自中国食品药品检定研究院。金银花材料来源见表3，经广西药用植物园吴庆华副研究员鉴定为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾。
[0031] 本发明所述同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷的含量的方法，包括以下步骤：
[0032] (1)对照品溶液的制备：精密称取绿原酸，木犀草苷对照品：0.889mg，0.920mg，以乙腈-0.4％磷酸水溶液为溶剂，于棕色容量瓶中定容至2mL，作为储备液。其他不同质量浓度的对照品溶液由储备液稀释得到。
[0033] (2)供试品溶液的制备：取金银花粉末(过60目筛)约0.25g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加70％的乙醇水溶液25mL，称定重量，超声提取(功率250W，频率40HZ)45min，放冷，用70％的乙醇水溶液补足减少的重量，摇匀，过滤，取续滤液适量，过
0.22μm微孔滤膜，即得。
0.22μm微孔滤膜，即得。
[0034] (3)色谱条件：色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH RP18(100mm×2.1mm i.d.，1.7μm)；室温，流动相为0.4％磷酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱，平衡时间为5min，梯度洗脱程序：0～2min，5％～16％B；2～4min，16％～20％B；4～8min，20％～50％B；8～
10min，50％～100％B；10～11min，100％～5％B；进样量：3μL，检测波长：242nm，体积流量0.2mL/min。
10min，50％～100％B；10～11min，100％～5％B；进样量：3μL，检测波长：242nm，体积流量0.2mL/min。
[0035] (4)样品测定
[0036] 分别取10批不同产地的金银花药材粉末，利用本发明所述同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷的含量的方法，并采用外标法计算，结果见表1。
[0037] 表1 10批不同产地的金银花药材中绿原酸和木犀草苷的含量测定结果[0038]
[0039] 由表1可知，利用本发明所述同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷含量的方法，所测金银花中绿原酸和木犀草苷的含量精确，数据可靠。
[0040] 如图1所示，从样品7和对照品的UPLC-PDA色谱图中可以看出，金银花中绿原酸1和木犀草苷2的波峰清晰，且分离效果好，便于快速准确地测量。
[0041] 实施例2
[0042] 本发明所述同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷的含量的方法，包括以下步骤：
[0043] (1)对照品溶液的制备：精密称取绿原酸，木犀草苷对照品：0.889mg，0.920mg，以乙腈-0.4％磷酸水溶液为溶剂，于棕色容量瓶中定容至2mL，作为储备液。其他不同质量浓度的对照品溶液由储备液稀释得到。
[0044] (2)供试品溶液的制备：取金银花粉末(过60目筛)约0.25g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加70％的乙醇水溶液30mL，称定重量，超声提取(功率250W，频率40HZ)45min，放冷，用70％的乙醇水溶液补足减少的重量，摇匀，过滤，取续滤液适量，过
0.22μm微孔滤膜，即得。
0.22μm微孔滤膜，即得。
[0045] (3)色谱条件：色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH RP18(100mm×2.1mm i.d.，1.7μm)；室温，流动相为：0.4％磷酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱，平衡时间为5min，梯度洗脱程序：0～2min，5％～16％B；2～4min，16％～20％B；4～8min，20％～50％B；8～
10min，50％～100％B；10～11min，100％～5％B；进样量：3μL，检测波长：242nm，体积流量0.2mL/min。
10min，50％～100％B；10～11min，100％～5％B；进样量：3μL，检测波长：242nm，体积流量0.2mL/min。
[0046] (4)标准曲线的建立
[0047] a，线性关系、检测限(LOD)和定量限(LOQ)的考察
[0048] 分别精密吸取对照品储备液，用流动相逐级稀释成一系列不同浓度的对照品溶液，分别进样3μL，测定(n＝3)。绿原酸和木犀草苷以浓度X为横坐标，平均峰面积Y为纵坐标进行线性回归，考察线性关系。取混合对照品储备液适量，加流动相逐级稀释，在上述色谱条件下进样测定，信噪比为3∶1和10∶1时的浓度分别为绿原酸和木犀草苷的检测限(LOD)和定量限(LOQ)。由表2可知，各回归方程呈良好的线性关系。
[0049] 表2 绿原酸和木犀草苷的标准曲线、相关系数、线性范围、LOD和LOQ测定结果[0050]
[0051] b，精密度、重复性和稳定性试验
[0052] 精密吸取对照品混合液3μL，在上述色谱条件下连续进样6次，测得绿原酸和木犀草苷的RSD值分别为：0.85％，1.04％，结果表明仪器的精密度良好。取同一批金银花粉末约0.25g，共6份，精密称定，按供试品制备方法制成供试品溶液，在上述色谱条件下进行测定，测得绿原酸的平均含量为34.86mg/g，RSD为1.17％；木犀草苷的平均含量为1.24mg/g，RSD为1.28％，结果表明该法重复性良好。取同一批金银花粉末(No∶7山东曲阜)供试品溶液，室温下放置，分别于0，2，4，8，16，24h进样3μL，按上述色谱条件进行测定，记录峰面积，绿原酸和木犀草苷峰面积的RSD值分别为1.64％、1.59％，结果表明供试品溶液在24h内稳定。
[0053] c，回收率试验
[0054] 采用加样回收法。取已知含量的金银花粉末9份，每份约0.125g，精密称定，分成3组，按低(80％)，中(100％)，高(120％)浓度分别精密加入一定量的绿原酸和木犀草苷对照品溶液，按照供试品的制备方法制备，在上述色谱条件进行测定，计算回收率。结果显示，回收率全达到97％以上，见表3。结果证实所建立的方法对于同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷的含量具有较高的准确度。
[0055] 表3 加样回收试验结果(n＝9)
[0056]
[0057]
[0058] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。