一种自然杀伤T细胞活化剂多肽及其应用

摘要

本发明涉及药物领域，具体涉及具有活化自然杀伤T细胞，抑制肿瘤坏死因子释放酶、具有减轻急性炎症反应对机体破坏的多肽。其序列为FRQSFQKVLCLRKGS是全新的序列，在体内试验中增加内毒素休克小鼠的生存率，具有潜在的新药开发价值。

权利要求

1.一种多肽，其特征在于其序列为FRQSFQKVLCLRKGS。

2.一种药物组合物，其特征在于其包含如权利要求1所述多肽与一种以上药学上可接受的填充剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、或稳定剂。

3.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物为注射剂。

4.如权利要求1所述的多肽，其特征在于有效剂量为10mg/kg。

5.如权利要求1所述的多肽在制备或治疗急性淋巴细胞性白血病药物中的应用。

说明书

一种自然杀伤T细胞活化剂多肽及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及自然杀伤T细胞活化剂及其应用，具体涉及具有活化自然杀伤T细胞，治疗急性淋巴细胞性白血病的多肽。

背景技术

[0002] 急性淋巴细胞性白血病（ALL）是一种进行性恶性疾病，其特征为大量的类似于淋巴母细胞的未成熟白细胞。这些细胞可在血液、骨髓、淋巴结、脾脏和其它器官中发现。急性淋巴细胞性白血病占儿童急性白血病的80%，发病率高峰在3岁至7岁之间。ALL也可发生于成年人，占所有成年人白血病的20%。近年来随着医学研究的深入，对急性淋巴细胞性白血病的认识和治疗取得了很大进展。生物靶向治疗肿瘤是非常有前景的，靶向治疗是阻断肿瘤发生的某个过程，达到治疗肿瘤的目的。

[0003] 自然杀伤T（natural killer T cells, NKT）细胞是一种具有特定标志的T细胞亚群，既表达T 细胞表面标志，如CD3、TCRaß（人类表达Va24 Vß11，小鼠表达Va14 Ja18），又表达NK 细胞的表面标志。NKT 细胞只能识别由CD1d 分子递呈的特异性糖脂类分子，而不是由主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex，MHC）递呈的多肽。NKT 细胞活化后可迅速分泌一系列的细胞坏死相关因子，如穿孔素和TNF-α，增强其杀伤肿瘤细胞的作用；还可通过激活其他具有杀伤活性的效应细胞，如NK 细胞和CD8＋细胞，发挥抗肿瘤作用。

[0004] 因此，活化自然杀伤T细胞，抑制急性淋巴细胞性白血病发展，是治疗急性淋巴细胞性白血病的新靶点。但是，尚未有开发成熟的自然杀伤T细胞活化剂多肽的治疗急性淋巴细胞性白血病的药物。

[0005] 本专利中的自然杀伤T细胞活化剂多肽已证明在急性淋巴细胞性白血病中有效，具有在其他肿瘤模型中开发的前景。

发明内容

[0006] 发明目的

[0007] 本发明提供全新的序列，该序列自然杀伤T细胞活化剂，对急性淋巴细胞白血病具有很好的疗效。

[0008] 技术方案

[0009] 自然杀伤T细胞活化剂，其特征在于其序列为FRQSFQKVLCLRKGS。

[0010] 自然杀伤T细胞活化剂在制备治疗急性淋巴细胞白血病药物中的应用。

[0011] 有益效果

[0012] 利用固相合成法化学合成自然杀伤T细胞活化剂，该多肽具有全新的序列，该多肽可体外活化自然杀伤T细胞，治疗急性淋巴细胞白血病。在体内试验中增加内毒素休克小鼠的生存率，具有潜在的新药开发价值。

具体实施方式

[0013] 本发明涉及多肽由吉尔生化（上海）合成。

[0014] 实施例1

[0015] 多肽的化学合成方法

[0016] 多肽用Fmoc化学方法合成。合成反应从C端向N端进行，Rink介质（可在Advanced ChemTech公司购得）上有自由氨基，顺序连接氨基酸。每一步连接过程中，氨基酸残基都要活化，活化混合物中有4倍于介质上自由氨基的HBTU，HOBt，DIEA和Fmoc-氨基酸。每次氨基酸的连接反应之后，都用一个吡啶/醋酸/N-甲基咪唑（4:1:0.5）的混合物来封闭未连接的自由氨基，封闭反应10 min。每次氨基酸的连接反应之后，下一个氨基酸连接之前，都要把介质上的Fmoc-基团去掉，去Fmoc-基团使用含20%哌啶的二甲基甲酰胺，需15分钟。最后，当所有氨基酸残基顺序连接之后，多肽用98%三氟乙酸从介质上切割下来，切割在室温下进行2小时。

[0017] 应用上述化学条件可合成并获得多肽，序列为FRQSFQKVLCLRKGS，该序列为全新序列。

[0018] 实施例2

[0019] 自然杀伤T细胞活化剂1对体外培养肿瘤细胞的生长和存活IC50。

[0020] 采用MTT 比色法。将对数生长的U937细胞，以 1.0×105加入 96 孔培养板中，培养 24h，实验孔、阳性药物对照孔分别加入不同浓度的实验药物自然杀伤T细胞活化剂1和阳性对照药物长春新碱；空白组加入相同体积的溶剂。每孔设五个复孔，培养 48h，分别在0h、2h、8h、14h、20h、24h、36h、，48h 每孔加入MTT，作用4h后，加入 DMSO，孵育 30min，在酶标仪 620nm 处测定吸光度 A 值，按公式肿瘤细胞生长抑制率＝（1-实验组吸光值/对照组吸光值）×100％。计算出实验药物的 IC50 为5.77μM。

[0021] 实施例3

[0022] 用内毒素休克模型检测自然杀伤T细胞活化剂1的体内活力

[0023] 在建立内毒素休克模型之前，我们首先测定了LPS（E. coli 0111：B4，sigma公司购买）小白鼠的LD50为50 µg每只小鼠，在实验中我们采用了100 µg每只小鼠，这样，对照组的小鼠可全部死亡。在我们前面的科研工作中，发现Regasepin2（另外一条多肽抑制剂，已公开）可提高C57BL/6小鼠在内毒素休克过程中的生存率。为了在我们的小白鼠上建立内毒素休克模型，我们用Regasepin2做了一个阳性对照实验。对照组小鼠注射100 µg LPS，而Regasepin2实验组的小鼠在注射LPS 5分钟之后，每只小鼠再注射0.7 mg的多肽。通过制作Kaplan-Meier生存曲线发现Regasepin2可有效的保护注射了100 µg的小鼠，提高了生存率。成功地在小白鼠上建立内毒素休克模型之后，用该模型检测自然杀伤T细胞活化剂1的体内活力。对照组小鼠（12只）注射100 µg LPS，而自然杀伤T细胞活化剂1组小鼠（12只）在注射LPS 5 min后，每只小鼠注射0.7 mg自然杀伤T细胞活化剂1。用Kaplan-Meier生存曲线分析，自然杀伤T细胞活化剂1可有效地保护小白鼠，提高内毒素休克小鼠的生存率。

[0024] 实施例4

[0025] 整合素阻断剂多肽Ⅰ、多肽Ⅱ和多肽Ⅲ对黑色素瘤B16F10 C57BL/6黑鼠移植肿瘤生长抑制试验

[0026] 取生长旺盛期的瘤组织在无菌条件下碾磨，制备成1×107个/ml细胞悬液，以0.1 ml接种于小鼠右侧腋部皮下。小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200 mm3后动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察整合素阻断剂多肽对受试动物肿瘤的抑制效果。肿瘤直径的测量次数为每2天1次，每次测量同时还需称量鼠重。实验组左侧腋部皮下注射多肽，阴性组同时给等量生理盐水，给药14 d，其中环磷酰胺隔天皮下给药一次，紫杉醇组每3天皮下给药一次，多肽低剂量一天给药两次组一天给两次，其它各组一天给药一次。治疗14 d后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。肿瘤体积(tumor volume ,TV)的计算公式为：

[0027] TV = 1/2×a×b2

[0028] 其中a、b分别表示长宽。

[0029] 根据测量的结果计算出相对肿瘤体积（relative tumor volume，RTV），计算公式为： RTV = Vt/V0。其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C（%），计算公式如下：

[0030]

[0031] TRTV：治疗组RTV ；CRTV：阴性对照组RTV。

[0032] 试验独立重复3次，试验得到的结果计算mean ± SD，并进行统计t检验，*P < 0.05为显著性差异，**P < 0.01为极显著性差异。

[0033] 表1 多肽对黑色素瘤B16F10 C57BL/6黑鼠移植肿瘤生长的抑制作用

[0034]