一种治疗肺部疾病的药物及其应用

摘要

一种治疗肺部疾病的药物及其应用，属于药物技术领域。该药物包含从广防已或寻骨风中提取的古芸烯和马兜铃烯中一种以上物质。本发明一方面提供了一种治疗肺部疾病的药物，该药物具有脂多糖或化学物诱导的肺水肿、肺炎，扩张支气管，降低支气管黏液分泌等药理作用，本发明另一方面确定了一种治疗肺部疾病的药物的应用，其可作为治疗急性肺炎、哮喘、肺水肿或支气管炎药物使用。

权利要求

1.一种药物在制备治疗肺部疾病药物中的应用，其特征在于该药物包含从广防己或寻骨风中提取的古芸烯和马兜铃烯中一种以上物质，所述的肺部疾病为急性肺炎、哮喘、肺水肿或支气管炎。

说明书

一种治疗肺部疾病的药物及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及含古芸烯和/或马兜铃烯的组合物用途，特别是涉及含古芸烯和/或马兜铃烯的组合物在制备治疗肺部疾病药物中的应用。

背景技术

[0002] 哮喘是当今世界上最常见的疾患之一，被世界卫生组织（WHO）列为四大顽症之一。其主要特征为气道高反应性与气道炎症，严重威胁了人类的健康。近年来，随着全球范围内的空气污染和环境恶化，哮喘的发病率和死亡率呈现逐年上升态势。据WHO估计，全球哮喘病的患者高达3亿人；在我国，哮喘的发病率近年来持续增长，尤其是城市儿童的哮喘患病率呈明显上升趋势。哮喘不仅发病率高，而且容易反复发作，一经患病就需长期甚至终身用药。

[0003] 在治疗哮喘药物中，吸入性β2受体激动剂肾上腺皮质激素一直是最为重要的一类药物，也是目前治疗哮喘最有效的药物，是哮喘长期治疗的一线药物。但是单独使用吸入性激素，在中等剂量范围内，没有明显的量效关系，即使增加吸入性激素剂量，疗效增加也不明显；相反，毒副作用却会有明显的增加。

[0004] 最近，美国科研人员发现肺部存在“苦味受体（TAS2Rs），接受苦味刺激后能从深部打开肺部气道有效地缓解哮喘症状，效果优于β2受体激动剂，且与β2受体激动剂具有协同作用，可减少后者的用量。研究发现，对哮喘小鼠雾化给予苦味物质，可有效地治疗小鼠的哮喘。 目前，苦味诱导的支气管扩张作用目前已得到确认，但这种作用的机制是否仅仅通过BK通道的开启而发挥尚存在争议。这预示着一种全新的治疗策略，通过刺激肺部苦味受体研制出治疗哮喘的新药或提高目前所用药物疗效。

[0005] 中医中药在治疗哮喘等方面具有一定的优势。止咳平喘的苦味中药之所以能用于治疗咳喘病症，在于其苦味能降泄肺气，且兼燥湿化痰之功效；不仅能舒张支气管平滑肌，减少气道阻力等，还能抑制过度释放的炎症介质和痰液。在改善气道高反应性的同时，减少内源性病理物质的产生，增强机体抗病能力，从而扶正祛邪，全面恢复机体功能。而这一功效特点正与“苦味受体”生物学作用相一致。

[0006] TAS2R4是肺部TAS2Rs中表达最高的一种亚型，本发明通过构建基于293T细胞水平的苦味受体TAS2R4激动剂高通量筛选体系，结合分子生物学技术，从“止咳平喘”苦味中药中筛选苦味受体激动剂。研究发现，从广防已或寻骨风提取的古芸烯、马兜铃烯具有显著的TAS2R4激动作用，并在此基础上进行了相关药效学评价。

发明内容

[0007] 针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种治疗肺部感染性疾病的药物及其应用的技术方案。

[0008] 所述的一种治疗肺部疾病的药物，其特征在于包含从广防已或寻骨风中提取的古芸烯和马兜铃烯中一种以上物质。

[0009] 所述的一种治疗肺部疾病的药物在制备治疗肺部疾病药物中的应用。

[0010] 所述的一种治疗肺部疾病的药物的应用，其特征在于所述的肺部疾病为急性肺炎、哮喘、肺水肿或支气管炎。

[0011] 本发明一方面提供了一种治疗肺部感染性疾病的药物，该药物具有抗炎、扩张支气管、降低肺水肿、降低支气管黏液分泌等药理作用，本发明另一方面确定了一种治疗肺部感染性疾病的药物的应用，其可作为治疗急性肺炎、哮喘、肺水肿或支气管炎药物使用。

附图说明

[0012] 图1 药物对脂多糖诱导急性肺炎及肺水肿小鼠的肺组织病理观察图（放大倍数×200）；

[0013] 图2药物对哮喘模型小鼠的肺组织病理观察图（放大倍数×200）。

具体实施方式

[0014] 以下结合实施例来进一步说明本发明。

[0015] 实施例1：古芸烯、马兜铃烯的制备

[0016] 1）将5kg广防已或寻骨风干燥全草粉碎后，加药材质量4倍的水，置水蒸汽蒸馏装置中100℃加热，蒸馏2小时，从蒸馏装置分馏管中可分离、得到约药材质量0.9％的挥发油精油。所得精油用无水硫酸钠干燥过滤。

[0017] 2）用100～140目硅胶湿法装柱，加入硅胶重量25%的脱水挥发油，用50℃以下的石油醚洗脱，依次收集洗脱液，结合薄层层析检查，待挥发油中烯烃部分除至痕量后，改用乙酸乙酯-石油醚（25：100→100:0）梯度洗脱，硅胶薄层检测层析流份，每20mL收集一流份，以石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸（7:3 :0.1）为展开剂，经碘熏后日光下检识，具有相同斑点的流份合并，浓缩至干，分别得到古芸烯和马兜铃烯。

[0018] 实施例2：抗急性肺炎药效试验

[0019] 1  材料与方法

[0020] 1.1 动物与分组

[0021] 清洁级ICR小鼠，18～22g，由浙江省实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK(浙) 2014-0001。按体重随机分为6组：正常对照组、模型对照组、地塞米松组、古芸烯组、马兜铃烯组和古芸烯+马兜铃烯联合给药组，每组10只，雌雄各半，其中古芸烯和马兜铃烯通过实施例1的方法制得。

[0022] 1.2 模型建立及给药

[0023] 除正常对照组给予静脉注射等剂量生理盐水外，其余各组小鼠给予尾静脉注射5mg/kg 脂多糖（LPS）。于造模前5天开始灌胃给药。除正常对照组和模型对照组在同等条件下给予生理盐水外，其余各组给予相应的药物腹腔注射，每天1次，连续5 d。

[0024] 1.3 取材及保存

[0025] 于末次给药后禁食禁水2 h，称重，摘眼球取血后处死，迅速取肺组织，用生理盐水洗净并用无菌滤纸吸干后称全肺重，并计算肺指数及肺指数抑制率。取左侧肺叶称湿量（W），80℃烘箱中烘烤48 h后称干量（D），计算肺组织W/D比值。取右侧肺组织10%福尔马林液固定，用于HE染色和免疫组化分析。

[0026] 1.4 指标检测

[0027] 于LPS尾静脉注射4 h后，小鼠摘眼球取血，2000 rpm离心10min，取其上清液采用BCA法检测血浆蛋白含量。处死小鼠，打开胸腔，用止血钳夹闭右侧主支气管，在气管上段剪断，插入16号针头，用4℃无菌生理盐水进行左肺灌洗，每次2ml，反复灌洗后抽出，共抽洗2次。灌洗液经2000 rpm离心10min，取其上清液采用BCA法检测蛋白含量，以BALF与血浆中蛋白含量的比值表示，计算肺通透指数。另取小鼠右肺，称湿重后，迅速转移到冰盒上，以试剂盒提供的试剂为匀浆介质，按重量体积比1：19加匀浆介质。充分匀浆，制备成5%的组织匀浆，按ELISA试剂盒操作说明，测定TNF-α、IL-1β含量。并以全肺湿重与动物体重的重量百分比为肺指数。

[0028] 2.0 统计方法

[0029] 实验数据采用SPSS 17.0统计分析软件进行统计学处理，所得结果以均数±标准差（ ±s）表示。取P﹤0.05作为显著性差异水平。

[0030] 3 结果

[0031] 3.1 药物对LPS诱导急性肺炎及肺水肿的影响

[0032] 表1  药物对LPS诱导急性肺炎及肺水肿的影响（n=10,  ±s）

[0033]

[0034] 注：与模型对照组相比，*p<0.05，**p<0.01

[0035] 由附图1可知，正常对照组肺泡结构完整，肺泡腔清晰，壁光滑，肺泡腔内无渗出液。模型组，可见肺体积增大，肺水肿程度明显，肺表面出血点增多，光镜下观察，可见大量炎性细胞浸润并扩散，肺间质及肺泡水肿、间质及肺泡内出血。地塞米松组、古芸烯组、马兜铃烯组和古芸烯+马兜铃烯联合给药组镜下显示病变程度较模型组轻，炎性细胞浸润程度明显减少，表明古芸烯和马兜铃烯均能明显减轻LPS导致的急性肺炎。

[0036] 从宏观上肺指数值的大小可以反映肺部病变的严重程度，而肺W/D比值和肺通透性指数可作为衡量肺组织毛细血管通透性增加、间质和肺泡水肿的指标。由表1结果表明，模型对照组肺指数、肺W/D值及肺通透性指数均显著升高，与正常对照组比较，具有显著性差异（P﹤0.01），表明LPS诱导的炎症反应可导致肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞严重受损，造成急性肺损伤和肺水肿。古芸烯、马兜铃烯及其联合给药均可明显降低模型小鼠的肺指数、肺W/D值和肺通透性指数，提高肺指数抑制率，减轻LPS所致小鼠肺炎的病变程度，表明古芸烯和马兜铃烯均能明显减轻LPS导致的肺水肿。

[0037] 3.2 药物对LPS诱导急性肺炎小鼠细胞因子的影响

[0038] 表2  药物对急性肺炎小鼠细胞因子的影响（n=10, ±s）

[0039]

[0040] 注：与模型对照组相比，*p<0.05，**p<0.01

[0041] 模型对照组小鼠血清中TNF-α和IL-1β含量明显升高，与正常对照组相比较，具有显著性差异（P<0.01），表明LPS可诱导小鼠肺组织炎性介质的大量释放，促进肺气血屏障损伤；而经古芸烯和马兜铃烯给药治疗后血清中TNF-α和IL-1β含量均明显降低，与模型对照组相比较，均具有极显著性差异（P<0.01），表明古芸烯和马兜铃烯均可抑制LPS引起的炎症反应的作用。

[0042] 实施例3：抗哮喘药效试验

[0043] 1实验材料

[0044] 清洁级Babl/c小鼠，雌雄各半，18～22g，由上海BK公司提供，动物许可证号：SCXK(沪) 2013-0016。

[0045] 卵清蛋白（批号 JS10710），上海金穗生物科技有限公司；醋酸强的松（批号：120807），浙江仙琚制药股份有限公司。

[0046] 2实验方法

[0047] 2.1 模型的建立及分组

[0048] Babl/c小鼠适应性喂养 1周，常规喂养标准颗粒饲料。而后随机分组，每组8只，雌雄各半。分别设为正常对照组、哮喘模型组、强的松给药组、古芸烯组、马兜铃烯组和古芸烯+马兜铃烯联合给药组。造模方法：模型组每只小鼠分别于第0天和第14天腹腔注射0.2 mL含20 μg OVA和2 mg氢氧化铝混合PBS溶液致敏。第24～30天将小鼠置于封闭容器中，雾化吸入5%OVA 10 mL，每天1次，每次30分钟激发哮喘，至小鼠出现烦躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐、挠鼻等哮喘发作表现。正常对照组以PBS代替OVA注射和雾化吸入，其余均与哮喘组相同。给药组激发和雾化操作与哮喘组相同，每次雾化吸入5%OVA溶液前半小时，雾化吸入药物。

[0049] 2.2 检测指标的测定

[0050] 实验第30天，动物称体重记录后，10%水合氯醛（0.4 ml/100g）腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，2000 rpm离心15 min，分离血清；采用双抗体夹心ABC-ELISA法，INF-γ和IL-6含量测定分别用小鼠INF-γ和IL-6检测试剂盒。同时，迅速取肺组织称重，肉眼观察记录肺脏大体病变情况，计算肺指数（肺重量/体重）。

[0051] 取小鼠右肺中叶，在生理盐水中漂洗干净，立即投入10%的中性甲醛溶液中固定1周，用自动石蜡包埋机包埋，制备4 μm切片。切片经二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ脱蜡各10 min，再依次用无水乙醇、95%乙醇、75%乙醇处理5 min，最后用纯水洗过夜，完成脱蜡至水过程。苏木精液染核5 min，流水冲液 10 min。1%盐水乙醇再分化，然后用95%乙醇脱水2 min，盐酸乙醇沉淀伊红 10 s，二甲苯Ⅰ 和二甲苯Ⅱ 脱透明各5 min。最后中性树胶封固。在光镜下观察肺组织病理变化并拍照。

[0052] 取各组小鼠肺组织适量，冰浴研磨，8000 r/min低温离心20 min，吸其上清，采用Trizol试剂一步法提取肺组织总RNA。反应条件：95℃，1 min；40个循环：94℃，15 s；60℃，45 s（收集荧光）；熔点曲线分析55℃到95℃。共检测40个循环。各个基因的相对表达水平以-△Ct n
相对表达量△Ct值和或(2 ×10 ) 进行分析。

[0053] 3 实验结果

[0054] 3.1 药物对哮喘小鼠血清细胞因子含量的影响

[0055] 表3 药物对哮喘小鼠血清IFN-γ和IL-4含量的影响（n=10，±s）

[0056]

[0057] 注：与哮喘模型组比较，*P<0.01。

[0058] 哮喘是一种过敏性疾病，目前研究表明Th1/Th2的失衡与哮喘发生密切相关，Th2优势应答、Th2细胞数目增多、功能亢进和细胞因子产生增加参与哮喘慢性气道炎症。IFN-γ是Thl细胞产生的特征性细胞因子，IFN-γ水平可反映Thl细胞的功能状态，对哮喘有保护作用；而IL-4是Th2细胞转化的必需因子，也是Th2细胞产生的特征性细胞因子，IL-4水平可反映Th2细胞的功能状态。IL-4介导气道高反应性和嗜酸性炎症。IL-4、IL-6和IL-10促进B细胞分泌IgE。由表3结果可见，与正常对照组相比较，哮喘模型组小鼠血清中IFN-γ含量明显降低，具有显著性差异（P<0.01）；强的松给药组小鼠肺组织中IFN-γ含量明显升高，与哮喘模型组相比较，具有显著性差异（P<0.01）；而经古芸烯和马兜铃烯给药治疗后血清中IFN-γ含量明显升高，与哮喘模型组相比较，均有显著性差异（P<0.01）。

[0059] 与正常对照组相比较，哮喘模型组小鼠血清中IL-4含量明显升高，具有显著性差异（P<0.01）；强的松给药组小鼠肺组织中IL-4含量明显降低，与哮喘模型组相比较，具有显著性差异（P<0.01）；而经古芸烯和马兜铃烯给药治疗后血清中IL-4含量明显降低，与哮喘模型组相比较，均有显著性差异（P<0.01）。表明古芸烯和马兜铃烯均能显著提高哮喘小鼠Th1细胞因子IFN-γ水平抑制Th2细胞因子IL-4水平的作用。

[0060] 3.2 对哮喘小鼠肺组织及支气管病理变化的影响

[0061] 肉眼观察正常对照组小鼠肺脏显淡粉红色，未见病变；哮喘模型组可见小鼠肺脏有多个出血点，显暗红色外观。与哮喘模型组比较，强的松组、古芸烯组和马兜铃烯组肺部出血点有不同程度减少。其中，古芸烯给药组肺部出血点最少。

[0062] 光镜下观察各组小鼠肺组织病理变化，正常对照组肺泡大小一致，肺泡壁薄，支气管上皮完整无增厚现象，管腔内无分泌物，无炎症细胞浸润。哮喘模型组则可见外周炎症细胞浸润，支气管上皮脱落且增生现象严重，支气管腔内有少量分泌物，肺泡间隔增厚，充血。与哮喘模型组相比，古芸烯和马兜铃烯给药组肺组织病变均有减轻，肺泡间隔较薄，肺泡壁增生减少，腔内无分泌物，其中以古芸烯给药组的小鼠支气管和肺组织总体病变最轻，疗效较好（结果见附图2），表明古芸烯和马兜铃烯均能显著改善哮喘小鼠支气管炎症和肺部炎症，具有降低支气管黏液、改善肺组织水液代谢的作用。

[0063] 3.3 药物对哮喘小鼠肺组织T2R10和IP3R1mRNA表达的影响

[0064] 表4 药物对哮喘小鼠肺组织T2R10和IP3R1mRNA表达的影响（n=10，±s）[0065]

[0066] 注：与哮喘模型组比较，*P<0.01。

[0067] 苦味受体（TAS2Rs）属于G蛋白偶联受体超家族，是由一条多肽链形成的7个跨膜螺旋结构，可以结合不同结构的苦味物质，这些受体主要在口腔的味蕾中的受体细胞内表达，起到识别苦味的作用。现代研究表明肺部存在“苦味受体”，使用苦味物质刺激肺部受体能够从深处打开肺部气道，研究显示，一些苦味物质可以特异性的与T2S2Rs苦味受体（如T2R10）结合，激活G偶联蛋白，使附着在细胞膜上的磷脂酶C（PLC）活化，磷脂酶C导致三磷酸肌醇水平（IP3）升高。三磷酸肌醇是一种水溶性小分子物质，与细胞内质网膜上的特异Ca2+离子通道结合，使贮存在细胞内质网中的钙离子释放到胞浆中，胞内Ca2+浓度升高，造成K+和Cl-离子快速外流，引起细胞膜的超极化，舒张平滑肌和扩张支气管，降低气道高反应性；同时还可以促使血管活性肠肽、P物质等神经递质的释放，改善气道炎症反应。本实验结果显示，哮喘模型小鼠的肺组织中的苦味受体T2R10及其下游效应基因IP3R1的表达明显降低（P<0.01），古芸烯和马兜铃烯为味苦的中药，给予古芸烯和马兜铃烯治疗后，哮喘小鼠的T2R10和IP3R1 mRNA表达显著升高（P<0.01），从而引起肺部细胞中Ca2+浓度升高，舒张平滑肌和扩张支气管，降低气道高反应性，提示古芸烯和马兜铃烯均能显著提高哮喘小鼠T2R10基因表达作用，具有舒张平滑肌和扩张支气管功效。