本发明涉及一种桃仁蛋白、多糖及低聚糖的制备方法及应用，可有效解决桃仁蛋白、多糖及低聚糖的制备及桃仁多糖在制备增强免疫力的药物和保健品中的应用和桃仁低聚糖、桃仁蛋白在制备抗氧化的药物、保健品、食品添加剂及化妆品中的应用的问题，制备的桃仁多糖在制备增强免疫力的药物和保健品中的应用，制备的桃仁低聚糖、桃仁蛋白在制备抗氧化的药物、保健品、食品添加剂及化妆品中的应用。
1.一种桃仁蛋白、多糖及低聚糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取去皮的桃仁，粉碎，加桃仁重量5-10倍的石油醚，浸泡30min，置于闪式提取器中提取1-3min，过滤，药渣挥去石油醚，晾干，加入桃仁重量8-20倍的pH为10的NaOH溶液，40℃-55℃水浴浸泡1-3h，过滤，滤液加酸调pH至4.5，4000r/min离心15min，滤取上清液备用，得沉淀物，沉淀物冷冻干燥即得桃仁蛋白；
(2)取步骤(1)中滤取的上清液，加碱调pH至中性，4000r/min离心15min，40℃-55℃减压浓缩至比重为1.05-1.12的浸膏，加乙醇至溶液体积含醇量为80％，静置12h，离心，上清液备用，底部沉淀物用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，20-50℃下减压干燥，得桃仁多糖；
(3)取步骤(2)中离心后所得的上清液，35℃-50℃减压挥尽乙醇，4000r/min离心
15min，得上清液即为桃仁低聚糖部位浸膏；将桃仁低聚糖部位浸膏依次经过大孔吸附树脂柱、活性炭柱、阴阳离子混合床树脂柱，最后所得洗脱液减压浓缩，冷冻干燥即得桃仁低聚糖。
2.根据权利要求1所述的桃仁蛋白、多糖及低聚糖的制备方法，其特征在于，所述的大孔吸附树脂为弱极性大孔吸附树脂，阴阳离子混合床离子树脂柱是由阳离子交换树脂与阴离子交换树脂以1:1的重量比混合后装柱制成的。
3.根据权利要求2所述的桃仁蛋白、多糖及低聚糖的制备方法，其特征在于，所述的弱极性大孔吸附树脂为AB-8、D-101、CAD-45、DA-201、HPD-400、SP-825型大孔吸附树脂中的一种；阳离子交换树脂为强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，阴离子交换树脂为强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂。
4.根据权利要求1所述的桃仁蛋白、多糖及低聚糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)取去皮的桃仁，粉碎，加桃仁重量8倍的石油醚，浸泡30min，置于闪式提取器中提取
3min，过滤，药渣挥去石油醚，晾干，加入桃仁重量20倍的pH为10的NaOH溶液，55℃水浴浸泡
3h，过滤，滤液加酸调pH至4.5，4000r/min离心15min，滤取上清液备用，得沉淀物，沉淀物冷冻干燥即得桃仁蛋白；
(2)取步骤(1)中滤取的上清液，加碱调pH至中性，4000r/min离心15min，55℃减压浓缩至比重为1.12的浸膏，加乙醇至溶液体积含醇量为80％，静置12h，离心，上清液备用，底部沉淀物用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，50℃下减压干燥，得桃仁多糖；
(3)取步骤(2)中离心后所得的上清液，50℃减压挥尽乙醇，4000r/min离心15min，得上清液即为桃仁低聚糖部位浸膏；将桃仁低聚糖部位浸膏依次经过AB-8型大孔吸附树脂柱、活性炭柱、阴阳离子混合床树脂柱，最后所得洗脱液减压浓缩，冷冻干燥即得桃仁低聚糖，阴阳离子混合床离子树脂柱是由强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂与强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂以1:1的重量比混合后装柱制成的。
5.根据权利要求1所述的桃仁蛋白、多糖及低聚糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)取去皮的桃仁，粉碎，加桃仁重量10倍的石油醚，浸泡30min，置于闪式提取器中提取1min，过滤，药渣挥去石油醚，晾干，加入桃仁重量8倍的pH为10的NaOH溶液，40℃℃水浴浸泡1h，过滤，滤液加酸调pH至4.5，4000r/min离心15min，滤取上清液备用，得沉淀物，沉淀物冷冻干燥即得桃仁蛋白；
(2)取步骤(1)中滤取的上清液，加碱调pH至中性，4000r/min离心15min，40℃减压浓缩至比重为1.05的浸膏，加乙醇至溶液体积含醇量为80％，静置12h，离心，上清液备用，底部沉淀物用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，20℃下减压干燥，得桃仁多糖；
(3)取步骤(2)中离心后所得的上清液，35℃℃减压挥尽乙醇，4000r/min离心15min，得上清液即为桃仁低聚糖部位浸膏；将桃仁低聚糖部位浸膏依次经过D-101型大孔吸附树脂柱、活性炭柱、阴阳离子混合床树脂柱，最后所得洗脱液减压浓缩，冷冻干燥即得桃仁低聚糖，阴阳离子混合床离子树脂柱是由强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂与强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂以1:1的重量比混合后装柱制成的。
6.根据权利要求1所述的桃仁蛋白、多糖及低聚糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)取去皮的桃仁，粉碎，加桃仁重量7.5倍的石油醚，浸泡30min，置于闪式提取器中提取2min，过滤，药渣挥去石油醚，晾干，加入桃仁重量15倍的pH为10的NaOH溶液，50℃水浴浸泡2h，过滤，滤液加酸调pH至4.5，4000r/min离心15min，滤取上清液备用，得沉淀物，沉淀物冷冻干燥即得桃仁蛋白；
(2)取步骤(1)中滤取的上清液，加碱调pH至中性，4000r/min离心15min，50℃减压浓缩至比重为1.10的浸膏，加乙醇至溶液体积含醇量为80％，静置12h，离心，上清液备用，底部沉淀物用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，20-50℃下减压干燥，得桃仁多糖；
(3)取步骤(2)中离心后所得的上清液，47℃减压挥尽乙醇，4000r/min离心15min，得上清液即为桃仁低聚糖部位浸膏；将桃仁低聚糖部位浸膏依次经过DA-201型的大孔吸附树脂柱、活性炭柱、阴阳离子混合床树脂柱，最后所得洗脱液减压浓缩，冷冻干燥即得桃仁低聚糖，阴阳离子混合床离子树脂柱是由强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂与强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂以1:1的重量比混合后装柱制成的。
7.权利要求1或2-6中任意一项所述方法制备的桃仁多糖在制备增强免疫力的药物和保健品中的应用。
8.权利要求1或2-6中任意一项所述方法制备的桃仁低聚糖、桃仁蛋白在制备抗氧化的药物、保健品、食品添加剂或化妆品中的应用。
一种桃仁蛋白、多糖及低聚糖的制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及医药领域，特别是涉及一种桃仁蛋白、多糖及低聚糖的制备方法及应用。
背景技术
[0002] 桃仁为蔷薇科植物桃Prunus persica(L.)Batsch或山桃Prusua davidiana(Carr.)Franch.的干燥成熟种子。具有活血祛瘀，润肠通便，止咳平喘的功效，临床用于经闭痛经，癥瘕痞块，肺痈肠痈，跌扑损伤，肠燥便秘，咳嗽气喘。桃仁中含有多种活性成分，现在对其活性成分(或化学成分)的研究主要集中在桃仁蛋白、多糖、桃仁苷、野樱甙、油脂等成分，如何解决一体化制备桃仁蛋白、多糖及其他成分，如桃仁低聚糖未见有公开报导，也未见有对桃仁低聚糖的研究的公开报导。
发明内容
[0003] 针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供一种桃仁蛋白、多糖及低聚糖的制备方法及应用，可有效解决桃仁蛋白、多糖及低聚糖的制备及桃仁多糖在制备增强免疫力的药物和保健品中的应用和桃仁低聚糖、桃仁蛋白在制备抗氧化的药物、保健品、食品添加剂及化妆品中的应用的问题。
[0004] 本发明解决的技术方案是，一种桃仁蛋白、多糖及低聚糖的制备方法，包括以下步骤：
[0005] (1)取去皮的桃仁，粉碎，加桃仁重量5-10倍的石油醚，浸泡30min，置于闪式提取器中提取1-3min，过滤，药渣挥去石油醚，晾干，加入桃仁重量8-20倍的pH为10的NaOH溶液，40℃-55℃水浴浸泡1-3h，过滤，滤液加酸调pH至4.5，4000r/min离心15min，滤取上清液备用，得沉淀物，沉淀物冷冻干燥即得桃仁蛋白；
[0006] (2)取步骤(1)中滤取的上清液，加碱调pH至中性，4000r/min离心15min，40℃-55℃减压浓缩至比重为1.05-1.12的浸膏，加乙醇至溶液体积含醇量为80％，静置12h，离心，上清液备用，底部沉淀物用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，20-50℃下减压干燥，得桃仁多糖；
[0007] (3)取步骤(2)中离心后所得的上清液，35℃-50℃减压挥尽乙醇，4000r/min离心15min，得上清液既为桃仁低聚糖部位浸膏；将桃仁低聚糖部位浸膏依次经过大孔吸附树脂柱、活性炭柱、阴阳离子混合床树脂柱，最后所得洗脱液减压浓缩，冷冻干燥即得桃仁低聚糖；所述的大孔吸附树脂为弱极性大孔吸附树脂，阴阳离子混合床离子树脂柱是由阳离子交换树脂与阴离子交换树脂以1:1的重量比混合后装柱制成的；所述的弱极性大孔吸附树脂为AB-8、D-101、CAD-45、DA-201、HPD-400、SP-825型大孔吸附树脂中的一种；阳离子交换树脂为强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，阴离子交换树脂为强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂。实现以桃仁为原料制备桃仁蛋白、多糖及低聚糖，并有效用于制备增强免疫力的药物、保健品、美白类化妆品和食品添加剂，实现了桃仁多糖在制备增强免疫力的药物和保健品中的应用，桃仁低聚糖、桃仁蛋白在制备抗氧化的药物、保健品、食品添加剂及化妆品中的应用。
[0008] 本发明制备方法简单，易操作，方法简单，原料丰富，产品应用面广，以桃仁为原料同时制备桃仁蛋白、桃仁多糖及桃仁低聚糖，开发了桃仁药材的应用范围，用于制备增强免疫力和抗氧化的药物、保健品、食品添加剂和美白类化妆品，开拓了桃仁蛋白、桃仁多糖及桃仁低聚糖的应用价值，具有很好的社会效益和经济效益，是中药上的巨大创新。
具体实施方式
[0009] 以下结合实施例对本发明的具体情况作详细说明。
[0010] 本发明在具体实施中，可由以下实施例给出：
[0011] 实施例1
[0012] 本发明在具体实施中，包括以下步骤：
[0013] (1)取去皮的桃仁，粉碎，加桃仁重量8倍的石油醚，浸泡30min，置于闪式提取器中提取3min，过滤，药渣挥去石油醚，晾干，加入桃仁重量20倍的pH为10的NaOH溶液，55℃水浴浸泡3h，过滤，滤液加酸调pH至4.5，4000r/min离心15min，滤取上清液备用，得沉淀物，沉淀物冷冻干燥即得桃仁蛋白；
[0014] (2)取步骤(1)中滤取的上清液，加碱调pH至中性，4000r/min离心15min，55℃减压浓缩至比重为1.12的浸膏，加乙醇至溶液体积含醇量为80％，静置12h，离心，上清液备用，底部沉淀物用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，50℃下减压干燥，得桃仁多糖；
[0015] (3)取步骤(2)中离心后所得的上清液，50℃减压挥尽乙醇，4000r/min离心15min，得上清液既为桃仁低聚糖部位浸膏；将桃仁低聚糖部位浸膏依次经过AB-8型大孔吸附树脂柱、活性炭柱、阴阳离子混合床树脂柱，最后所得洗脱液减压浓缩，冷冻干燥即得桃仁低聚糖，阴阳离子混合床离子树脂柱是由强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂与强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂以1:1的重量比混合后装柱制成的。
[0016] 实施例2
[0017] 本发明在具体实施中，包括以下步骤：
[0018] (1)取去皮的桃仁，粉碎，加桃仁重量10倍的石油醚，浸泡30min，置于闪式提取器中提取1min，过滤，药渣挥去石油醚，晾干，加入桃仁重量8倍的pH为10的NaOH溶液，40℃℃水浴浸泡1h，过滤，滤液加酸调pH至4.5，4000r/min离心15min，滤取上清液备用，得沉淀物，沉淀物冷冻干燥即得桃仁蛋白；
[0019] (2)取步骤(1)中滤取的上清液，加碱调pH至中性，4000r/min离心15min，40℃减压浓缩至比重为1.05的浸膏，加乙醇至溶液体积含醇量为80％，静置12h，离心，上清液备用，底部沉淀物用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，20℃下减压干燥，得桃仁多糖；
[0020] (3)取步骤(2)中离心后所得的上清液，35℃℃减压挥尽乙醇，4000r/min离心15min，得上清液既为桃仁低聚糖部位浸膏；将桃仁低聚糖部位浸膏依次经过D-101型大孔吸附树脂柱、活性炭柱、阴阳离子混合床树脂柱，最后所得洗脱液减压浓缩，冷冻干燥即得桃仁低聚糖，阴阳离子混合床离子树脂柱是由强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂与强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂以1:1的重量比混合后装柱制成的。
[0021] 实施例3
[0022] 包括以下步骤：
[0023] (1)取去皮的桃仁，粉碎，加桃仁重量7.5倍的石油醚，浸泡30min，置于闪式提取器中提取2min，过滤，药渣挥去石油醚，晾干，加入桃仁重量15倍的pH为10的NaOH溶液，50℃水浴浸泡2h，过滤，滤液加酸调pH至4.5，4000r/min离心15min，滤取上清液备用，得沉淀物，沉淀物冷冻干燥即得桃仁蛋白；
[0024] (2)取步骤(1)中滤取的上清液，加碱调pH至中性，4000r/min离心15min，50℃减压浓缩至比重为1.10的浸膏，加乙醇至溶液体积含醇量为80％，静置12h，离心，上清液备用，底部沉淀物用无水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，20-50℃下减压干燥，得桃仁多糖；
[0025] (3)取步骤(2)中离心后所得的上清液，47℃减压挥尽乙醇，4000r/min离心15min，得上清液既为桃仁低聚糖部位浸膏；将桃仁低聚糖部位浸膏依次经过DA-201型的大孔吸附树脂柱、活性炭柱、阴阳离子混合床树脂柱，最后所得洗脱液减压浓缩，冷冻干燥即得桃仁低聚糖，阴阳离子混合床离子树脂柱是由强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂与强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂以1:1的重量比混合后装柱制成的。
[0026] 上述制备的桃仁多糖、低聚糖经苯酚-硫酸法(常规测定方法，是公知技术)测定，其糖含量均不低于80％。经HPGPC法(公知技术)测定，桃仁低聚糖的分子量均在300-2000之间。经凯氏定氮法测定本发明制备的桃仁蛋白的含量在85％以上。
[0027] 上述仅是给出的几个实施例，在研制中，发明人经反复多次实验，均取得了相同或相近似的结果，方法科学有效，原料丰富，产品应用面广，具有实际的应用价值，并对桃仁蛋白、多糖及低聚糖进行反复的试验均取得了满意的技术效果，有关试验资料如下：
[0028] 桃仁多糖的免疫试验：
[0029] 一.试验材料
[0030] 1.试验动物：18.5～23g昆明种清洁剂小鼠，雌雄各半。由郑州大学实验动物中心提供。
[0031] 2.实验试药：本发明方法制备的桃仁多糖，含量为88.17％，瑞士染液，香菇多糖(湖北广仁药业有限公司)，环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司)，枸橼酸钠，氯化钙，氯化钠，酒石酸钾钠，氯化钾，葡萄糖，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，酚红。
[0032] 二.试验方法
[0033] 1.桃仁多糖对正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
[0034] 取小鼠50只，体重18.5～23g，雌雄各半，随机均匀分为5组。分别灌服小、中、大剂量的桃仁多糖水溶液(10mg/ml，20mg/ml，40mg/ml；0.2ml/10g)，香菇多糖混悬液(5mg/ml；0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)。每天给药1次，连续给药7天。于7天早上各组小鼠均腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水混悬液0.5ml。于第7天灌胃给药后2h，注射5％鸡红细胞4h后，脱颈椎处死小鼠，腹腔注入汉氏液2.5ml，轻揉小鼠腹部；然后剪开小鼠腹部皮肤，在腹膜上剪一小孔，用吸管吸取腹腔液2ml置于试管中，混匀；吸取少许腹腔液滴于载玻片上，液点大小约为1.5cm×2cm。将载玻片放在铺有湿纱布的糖瓷盘中，37℃孵育30min，生理盐水冲去附着的细胞，瑞氏染液染色，自来水冲洗晾干；显微镜下观察小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬情况，并计算吞噬百分率和吞噬指数。
[0035]
[0036]
[0037] 表1腹腔巨噬细胞吞噬功能结果
[0038]
[0039] **表示与空白组比P＜0.01，*表示与空白组比P＜0.05
[0040] 从表1可以看出，与空白对照组比，大剂量组可提高小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬百分率，可提高腹腔巨噬细胞的吞噬指数(P＜0.05)；小、中剂量组及香菇多糖组均能显著提高吞噬百分率及吞噬指数(P＜0.01)，其中尤以中剂量桃仁多糖组作用为最强。
[0041] 2.桃仁多糖对正常小鼠溶血素形成的影响
[0042] 取小鼠50只，体重18.5～23g，雌雄各半，随机均匀分为5组。分别灌服小、中、大剂量的桃仁多糖水溶液(10mg/ml，20mg/ml，40mg/ml；0.2ml/10g)，香菇多糖混悬液(5mg/ml；0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)。每天给药1次，连续给药7天。同时，给药第1天各组小鼠均腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水混悬液0.2ml/只，进行免疫，于最后1次给药后2h，小鼠眼眶取血，离心，分离血清。用生理盐水1∶100稀释后，取1ml稀释液与5％鸡红细胞混悬液0.5ml、10％补体0.5ml(豚鼠血清，用鸡红细胞预先饱和6h)混匀，37℃孵育30min，冰水中终止反应。另设不加补体的空白管作对照，吸取各管上清液于UV-T1810型分光光度计540nm处比色，测定各组溶血素形成情况。
[0043] 3.桃仁多糖对正常小鼠溶血空斑形成的影响
[0044] 取小鼠50只，体重18.5～23g，雌雄各半，随机均匀分为5组。分别灌服小、中、大剂量的桃仁多糖水溶液(10mg/ml，20mg/ml，40mg/ml；0.2ml/10g)，香菇多糖混悬液(5mg/ml；0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)。每天给药1次，连续给药7天。同时，给药第1天各组小鼠均腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水混悬液0.2ml/只，进行免疫，于最后1次给药后2h，脱颈椎处死并解剖小鼠，取出脾脏，同组两个小鼠脾脏为一例；匀浆，并调整脾细胞混悬液中脾细胞数为5×106个/ml。取脾细胞混悬液1.0ml，与0.2％鸡红细胞混悬液0.5ml和1∶10的豚鼠血清0.5ml混匀。另设不加补体的空白管，37℃孵育1h，离心，取上清液于UV-2201型分光光度计413nm处比色，测各组溶血空斑形成情况。
[0045] 表2溶血素、溶血空斑形成结果
[0046]
[0047] **表示与空白组比P＜0.01，*表示与空白组比P＜0.05
[0048] 从表2可以看出，与空白对照组比，大、小剂量组溶血空斑均升高(P＜0.05)，中剂量组和香菇多糖组溶血素和溶血空斑均显著提高(P＜0.01)。其中尤以中剂量桃仁多糖组作用为最优。
[0049] 4.桃仁多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响[0050] 取小鼠60只，体重18.5～23g，雌雄各半，随机均匀分为6组。除空白对照组外，其余各组均建立环磷酰胺致免疫抑制模型共5组(剂量为8mg/ml；第1、2、3天连续腹腔注射)，模型组建立完成后，分别灌服桃仁多糖水溶液(5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml；0.2ml/10g)，香菇多糖混悬液(5mg/ml，0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)。每天给药1次，连续给药7天。于给药最后一天早上各组小鼠均腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水混悬液0.5ml，灌胃给药后2h，给鸡红细胞后4h，脱颈椎处死小鼠。腹腔注入汉氏液2.5ml，轻揉小鼠腹部，然后剪开小鼠腹部皮肤，在腹膜上剪一小孔，用移液枪吸取腹腔液2ml置于试管中，混匀；吸取少许腹腔液滴于载玻片上，液点大小约为1.5cm×2cm。将载玻片放在铺有湿纱布的糖瓷盘中，37℃孵育30min，生理盐水冲去附着的细胞，瑞氏染液染色，自来水冲洗晾干，显微镜下观察小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬情况，并计算吞噬百分率和吞噬指数。
[0051] 表3腹腔巨噬细胞吞噬功能结果
[0052]
[0053] **表示与模型组比P＜0.01
[0054] 从表3可以看出，与空白组相比，模型组小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬指数和吞噬百分率显著降低(P＜0.01)，说明造模成功。与模型组相比，大、中、小剂量多糖组和香菇多糖组可显著提高小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬指数和吞噬百分率(P＜0.01)。
[0055] 5.桃仁多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠溶血素形成的影响
[0056] 取小鼠60只，体重18.5～23g，雌雄各半，随机均匀分为6组。除空白对照组外，其余各组均建立环磷酰胺致免疫抑制模型共5组(剂量为8mg/ml；第1、2、3天连续腹腔注射)；模型组建立完成后，各组小鼠(含空白组)均腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水混悬液0.2ml/只，进行免疫；并开始分别灌服桃仁多糖水溶液(5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml；0.2ml/10g)、香菇多糖混悬液(5mg/ml，0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)，每天给药1次，连续给药7天。最后1次给药后2h，小鼠眼眶取血，离心，分离血清；以生理盐水1∶100稀释后，取1ml稀释液与5％鸡红细胞混悬液0.5ml、10％补体0.5ml(豚鼠血清，用鸡红细胞预先饱和6h)混匀；37℃孵育30min，冰水中终止反应，另设不加补体的空白管作对照；吸取各管上清液于UV-T1810型分光光度计540nm处比色，测定各组溶血素形成情况，结果见表4。
[0057] 6.桃仁多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠溶血空斑形成的影响
[0058] 取小鼠60只，体重18.5～23g，雌雄各半，随机均匀分为6组。除空白对照组外，其余各组均建立环磷酰胺致免疫抑制模型共5组(剂量为8mg/ml；第1、2、3天连续腹腔注射)；模型组建立完成后，各组小鼠(含空白组)均腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水混悬液0.2ml/只，进行免疫；并开始分别灌服桃仁多糖水溶液(5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml；0.2ml/10g)、香菇多糖混悬液(5mg/ml，0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)，每天给药1次，连续给药7天。于最后1次给药后2h，脱颈椎处死并解剖小鼠，取出脾脏，同组中两个小鼠脾脏为一例，匀浆，并调整脾细胞混悬液中脾细胞数为5×106个/ml。取脾细胞混悬液1.0ml，与0.2％鸡红细胞混悬液0.5ml和1∶10的豚鼠血清0.5ml混匀。另设不加补体的空白管，37℃孵育1h，离心，取上清液于UV-2201型分光光度计413nm处比色，测各组溶血空斑形成情况，结果见表4。
[0059] 表4溶血素、溶血空斑形成结果
[0060]
[0061] **表示与模型组比P＜0.01
[0062] 从上表可看出，与空白对照组比，模型组溶血素和溶血空斑均显著降低(P＜0.01)，说明造免疫抑制模型成功。与模型组比，各个剂量桃仁多糖组及香菇多糖组均可显著促进小鼠溶血素和溶血空斑的形成(P＜0.01)。其中，尤以0.2g/kg剂量桃仁多糖组为最佳。
[0063] 桃仁蛋白及桃仁低聚糖的活性试验
[0064] 一、实验材料
[0065] (1)实验动物 选用40只普通级昆明种小鼠，鼠龄2个月，体重(20±2)g，雌雄各半。由郑州大学医学院动物实验中心提供(合格证号：SCXK(豫)2005-0001；使用许可证号：SCXK(豫)2005-0012)。
[0066] (2)实验试药 丙二醛(MDA)测定试剂盒，生化试剂，南京建成生物工程研究所；超氧化物岐化酶(SOD)测试盒，南京建成生物工程研究所；谷胱甘肽酶(GSH-PX)测试盒，南京建成生物工程研究所；桃仁低聚糖及桃仁蛋白为本发明方法所制备，低聚糖含量为86.42％，蛋白含量为89.65％。
[0067] 二、实验方法
[0068] (1)动物的喂养与取样 取体重(20±2)g的昆明种小鼠70只,适应性饲养1周后,随机分成7组,每组10只。分别为空白组、桃仁低聚糖低剂量组(100mg/kg)、桃仁低聚糖中剂量组(200mg/kg)、桃仁低聚糖高剂量组(400mg/kg)，桃仁蛋白低剂量组(100mg/kg)、桃仁蛋白中剂量组(200mg/kg)、桃仁蛋白高剂量组(400mg/kg)，连续15天口服给药(空白对照组给等量纯净水)，每天小鼠给药体积为0.2mL/10g。末次给药后24h，处死动物，分别取小鼠血清及制备10％肝组织匀浆，待测。
[0069] 制备10％小鼠肝组织匀浆：取肝组织在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，称0.5g，放入5mL-10mL的小烧杯内，取总量(总量为4.5mL)2/3的生理盐水于烧杯中，用眼科剪尽快剪碎组织块，将剪碎的组织倒入匀浆管中，用剩余1/3的生理盐水用来冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中，进行匀浆，使组织匀浆化,将匀浆液离心(3000r/min，
10min)，取适量上清液进行以下测定。
[0070] 血清制备：摘眼球取出血样，37℃水浴30min加速血液凝固。血液凝固后用竹签沿试管四周轻轻剥离血块使血清尽快自行析出，然后2500r/min离心10min，用吸管吸出上层血清备用。
[0071] (2)检测方法
[0072] 蛋白质含量测定：采用考马斯亮兰法。蛋白质分子具有-NH3+基团，当棕红色的考马斯亮兰显色剂加入蛋白标准液或样品中时，考马斯亮兰染料上的阴离子与蛋白-NH3+基团结合，致使溶液变蓝，通过测定吸收度可计算出样品中蛋白质的含量。具体操作详见试剂盒说明书。
[0073] SOD测定：采用黄嘌呤氧化酶法。血清中SOD活力以每毫升反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD量为一个亚硝酸盐单位(NU)，即U/mL；组织中SOD活力以每毫克组织蛋白在1mL反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD量为一个亚硝酸盐，即U/mgprot。具体操作详见试剂盒说明书。
[0074] GSH-Px测定：采用二硫对硝基苯甲酸法测定，具体操作详见试剂和说明书，血清单位为U/mL，组织单位为U/mgprot。
[0075] MDA测定：采用硫代巴比妥酸法(TBA)测定，过氧化脂质降解产物中MDA可与TBA缩合，形成的红色产物在523nm处有最大吸收峰，因底物为TBA，所以此法称TBA法。血清单位为nmol/mL，组织单位为nmol/mgprot。具体操作详见试剂盒说明书。
[0076] 表5桃仁低聚糖及桃仁蛋白对小鼠肝组织中SOD、GSH-Px、MDA的影响( n＝10)[0077]
