一种用于筛选微生物胞外胶原酶的酶谱方法

摘要

本发明公开了一种用于筛选微生物胞外胶原酶的酶谱方法，以利用胶原酶对胶原蛋白的特异性降解作用对胶原酶进行酶谱分析。电泳过程中所采用的凝胶为在10％SDS-PAGE凝胶中添加质量体积比浓度为0.1％的Ⅰ型胶原蛋白。凝胶的处理过程为：电泳结束后先将凝胶用洗脱液振荡洗脱，随后用漂洗液振荡漂洗，最后将凝胶用孵育液在37℃下静置孵育12h；孵育结束后将凝胶先经考马斯亮蓝R-250染色液染色1h，再经脱色液室温振荡脱色直至透明条带清晰。该方法将Ⅰ型胶原蛋白配制到SDS-PAGE凝胶中,凝胶中Ⅰ型胶原蛋白的终浓度为0.1％，在该底物浓度下，胶原酶负染条带以及标准蛋白质标准条带能够同时在凝胶上显色，填补了胶原酶酶谱检测领域的技术空白。

权利要求

1.一种用于筛选微生物胞外胶原酶的酶谱方法，包括电泳和凝胶的处理步骤，其特征在于，所述电泳过程中所采用的凝胶为在10％SDS-PAGE凝胶中添加质量体积比浓度为

0.1％的Ⅰ型胶原蛋白；

所述凝胶的处理过程为：电泳结束后先将凝胶用洗脱液在室温条件下振荡洗脱2次，随后用漂洗液在室温条件下振荡漂洗2次，最后将凝胶用孵育液在37℃下静置孵育12h；孵育结束后将凝胶先经质量体积比为0.1％的考马斯亮蓝R-250染色液染色1h，再经脱色液室温振荡脱色直至透明条带清晰；

所述洗脱液的组成为：由pH值为7.6、浓度为50mmol/L Tr is-HCl缓冲液、聚乙二醇辛基苯基醚和CaCl2组成，所含聚乙二醇辛基苯基醚的体积百分比为2.5％，CaCl2的浓度为

5mmol/L；

所述漂洗液的组成为：由pH值为7.6、浓度为50mmol/L Tris-HCl缓冲液和CaCl2组成，CaCl2的浓度为5mmol/L；

所述孵育液的组成为：pH值为7.6、浓度为50mmol/L Tr is-HCl缓冲液、十二烷基聚乙二醇醚、NaCl和CaCl2，其中，十二烷基聚乙二醇醚的浓度为0.02％，NaCl的浓度为200mmol/L,CaCl2的浓度为5mmol/L；

所述考马斯亮蓝R-250染色液的组成为：1L考马斯亮蓝R-250染色液中含有1.0g考马斯亮蓝R-250、450mL甲醇和100mL冰醋酸；

所述脱色液的组成为：1L脱色液中含有100mL无水甲醇和100mL冰乙酸；

所述电泳过程中所采用的凝胶由浓缩胶和分离胶组成，所述分离胶的组成为：pH值为

8.8、浓度为1.5mol/L的Tr is-HCl缓冲液的体积百分比浓度为24.7％，质量体积比浓度为

30％的丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺凝胶贮液的混合物的体积百分比浓度为33.3％，质量体积比浓度为10％的SDS水溶液的体积百分比浓度为1％，质量体积比浓度为10％的过硫酸铵的水溶液的体积百分比浓度为1％，N,N,N',N'-四甲基乙二胺的体积百分比浓度为0.1％，质量体积比浓度为1％的Ⅰ型胶原蛋白水溶液的体积百分比浓度为10％，余量为超纯水；所述浓缩胶的组成为：pH值为6.8、浓度为0.5mol/L的Tris-HCl缓冲液的体积百分比浓度为

25％,质量体积比浓度为30％的丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺凝胶贮液的混合物的体积百分比浓度为16％，质量体积比浓度为10％的SDS水溶液的体积百分比浓度为1％，质量体积比浓度为10％的过硫酸铵的水溶液的体积百分比浓度为0.5％，N,N,N',N'-四甲基乙二胺的体积百分比浓度为0.1％，余量为超纯水。

说明书

一种用于筛选微生物胞外胶原酶的酶谱方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物蛋白酶检测技术领域，具体涉及一种用于筛选微生物胞外胶原酶的酶谱方法。

背景技术

[0002] 酶谱分析技术是在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳的基础上发展而来的。酶谱分析技术是指使用含有底物蛋白的凝胶进行电泳或在电泳后将不含底物蛋白的凝胶浸泡在底物溶液中，再通过孵育、染色、脱色的方法显示经酶作用后底物蛋白的染色情况的变化，进而对酶活性进行定性分析。

[0003] 虽然酶谱分析的方法常被用来检测蛋白酶类的活性，但现有酶谱技术仍然存在以下几点技术缺陷：

[0004] (1)目前的酶谱技术是在聚丙烯酰胺凝胶上检测到蛋白酶负染条带在聚丙烯酰胺凝胶上的位置，但经常由于底物背景过深而导致不能直接显示蛋白质Marker条带，因此难以通过酶谱分析直接确定未知蛋白酶的分子量。

[0005] (2)目前的酶谱分析技术分析蛋白酶的分子量时，一般需要制备两块凝胶，一块凝胶内配制了高浓度的底物蛋白，另一块胶不包含底物蛋白而用来分析蛋白质量标准(Protein Marker)；电泳结束后，含有底物蛋白的凝胶进行负染，而不含底物蛋白的凝胶直接进行考马斯亮蓝染色；染色结束后将两块胶进行比对，测定目标蛋白酶的分子量。但是凝胶中高浓度的底物蛋白会影响蛋白酶在胶中的迁移率，进而可能导致蛋白酶的分子量计算出现较大偏差。

[0006] (3)若采用将凝胶浸泡在底物溶液中的方法，容易导致蛋白酶的透明条带分辨率低，条带不够集中而清晰。

[0007] (4)目前的酶谱分析中在凝胶孵育过程中常用NaN3作为防腐剂以避免产酶微生物对结果的影响，效果虽然很好但NaN3的毒性很强,存在一定的危险性。

[0008] 胶原酶的化学名为胶原蛋白水解酶(Collagenase)，生理pH和温度条件下胶原酶能够特异性地降解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而其他蛋白酶类则不具备此功能。胶原酶可以广泛应用于医学、食品、化妆品等工业生产中。医学研究中，常用胶原酶治疗腰间盘突出症、瘢痕疙瘩、血栓、溃疡、脓疮等疾病，它有不损伤胞膜及神经细胞且不破坏乳酪蛋白、血红蛋白、硫酸角质素等蛋白质的优点,治疗效果安全有效。工业应用中，常用胶原酶降解动物来源的胶原蛋白，其酶解产物易于被人体吸收与利用，添加至食品及化妆品中可改善人的体质及肤质。

[0009] 胶原酶是一种底物特异性极高的蛋白酶，因为胶原酶与蛋白酶的底物完全不同，胶原酶具有较强的专一性，对其他类型蛋白水解能力差。目前的酶谱技术无法应用于胶原酶。

发明内容

[0010] 本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种用于筛选微生物胞外胶原酶的酶谱方法,利用胶原酶对胶原蛋白的特异性降解作用对胶原酶进行酶谱分析。

[0011] 为实现本发明的目的所采用的技术方案是：

[0012] 一种用于筛选微生物胞外胶原酶的酶谱方法，包括电泳和凝胶的处理步骤，所述电泳过程中所采用的凝胶为在10％SDS-PAGE凝胶中添加质量体积比浓度为0.1％的Ⅰ型胶原蛋白。

[0013] 所述凝胶的处理过程为：电泳结束后先将凝胶用洗脱液在室温条件下振荡洗脱2次，随后用漂洗液在室温条件下振荡漂洗2次，最后将凝胶用孵育液在37℃下静置孵育12h；孵育结束后将凝胶先经质量体积比为0.1％的考马斯亮蓝R-250染色液染色1h，再经脱色液室温振荡脱色直至透明条带清晰；

[0014] 所述洗脱液的组成为：由pH值为7.6、浓度为50mmol/L Tris-HCl缓冲液、聚乙二醇辛基苯基醚和CaCl2组成，所含聚乙二醇辛基苯基醚的体积百分比为2.5％，CaCl2的浓度为5mmol/L；

[0015] 所述漂洗液的组成为：由pH值为7.6、浓度为50mmol/L Tris-HCl缓冲液和CaCl2组成，CaCl2的浓度为5mmol/L；

[0016] 所述孵育液的组成为：pH值为7.6、浓度为50mmol/L Tris-HCl缓冲液、十二烷基聚乙二醇醚、NaCl和CaCl2，其中，十二烷基聚乙二醇醚的浓度为0.02％，NaCl的浓度为200mmol/L、CaCl2的浓度为5mmol/L；

[0017] 所述考马斯亮蓝染色液的组成为：1L考马斯亮蓝染色液中含有1.0g考马斯亮蓝R-250、450mL甲醇和100mL冰醋酸；

[0018] 所述脱色液的组成为：1L脱色液中含有100mL无水甲醇和100mL冰乙酸。

[0019] 所述电泳过程中所采用的凝胶由浓缩胶和分离胶组成，所述分离胶的组成为：pH值为8.8、浓度为1.5mol/L的Tris-HCl缓冲液24.7％,质量体积比浓度为30％的丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺凝胶贮液的混合物33.3％，质量体积比浓度为10％的SDS水溶液1％，质量体积比浓度为10％的过硫酸铵的水溶液1％，N,N,N',N'-四甲基乙二胺0.1％，质量体积比浓度为1％的Ⅰ型胶原蛋白水溶液10％，余量为超纯水；所述浓缩胶的组成为：pH值为6.8、浓度为0.5mol/L的Tris-HCl缓冲液25％,质量体积比浓度为30％的丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺凝胶贮液的混合物16％，质量体积比浓度为10％的SDS水溶液1％，质量体积比浓度为10％的过硫酸铵的水溶液0.5％，N,N,N',N'-四甲基乙二胺0.1％，余量为超纯水。

[0020] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：

[0021] 1、本发明的方法通过将Ⅰ型胶原蛋白配制到SDS-PAGE凝胶中,凝胶中Ⅰ型胶原蛋白的终浓度为0.1％(W/V)。在该底物浓度下，胶原酶负染条带以及标准蛋白质标准(Protein Marker)条带能够同时在凝胶上显色，这样既能保证检测到目标蛋白酶的负染条带，同时也能在胶上检测到蛋白质量标准(ProteinMarker)的条带，克服了高浓度底物蛋白对目标胶原酶迁移率的影响，大大减少了胶原酶分子量计算中的误差，使得目标胶原酶的分子量测定更准确，填补了胶原酶酶谱检测领域的技术空白。

[0022] 2、本发明的酶谱筛选方法中，在凝胶的孵育液中添加了无毒的十二烷基聚乙二醇醚(Brij-35)代替了NaN3用于防腐，提高了实验的安全性。

[0023] 3、本发明的酶谱筛选方法中凝胶的配制方法及处理方法简易可行，成本低廉。

附图说明

[0024] 图1所示为利用本胶原酶谱分析方法检测蜡样芽孢杆菌CGMCC NO.8614经过培养不同时间后所产胞外胶原酶的结果。

[0025] 图中1：M为蛋白标准；1-7分别为培养6、12、18、24、30、36、42h后的蜡样芽孢杆菌CGMCC NO.8614粗酶液。

[0026] 图2所示为用硫酸铵浓缩以后的粗酶液SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝溶液染色后的结果。

[0027] 图2中：M为蛋白标准；1为硫酸铵沉淀浓缩后的粗酶液总蛋白。

具体实施方式

[0028] 以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。

[0029] 实施例1

[0030] 1、蜡样芽孢杆菌R75E的分离纯化

[0031] (1)取1mL采集的人初乳用无菌超纯水稀释100倍后取200μL稀释液均匀涂布于5％脱脂奶粉平板上，于37℃培养12h，获得菌落周围具有明显透明圈的菌落。将涂布获得的菌落用牙签挑取分离，于5％脱脂奶粉平板上进行多次划线培养，每次培养条件均为37℃、12h，获得菌株，将其命名为R75E。R75E菌株在5％脱脂奶粉平板上37℃培养12h后的结果如图1所示，从图1中可以看出，在5％脱脂奶粉平板上菌株R75E的单菌落周围出现明显透明圈，经测量发现菌落直径大小约为3mm，透明圈直径约8mm。

[0032] (2)从步骤(1)中的5％脱脂奶粉平板上挑取菌株R75E的单菌落，分别接种至两管5mL LB液体培养基中培养，培养条件为37℃，150r/min，培养12h。培养结束后于1.5mL无菌离心管分别加入0.8mL菌液和0.2mL灭过菌的浓度为80％的甘油溶液，混合均匀后可长期保存于-80℃冰箱中。

[0033] 2、蜡样芽孢杆菌R75E的鉴定

[0034] (1)细菌的形态特征

[0035] 菌落形态：将得到的具有最佳蛋白降解效果的菌株R75E于37℃下在LB固体培养平板上划线培养生长12h后，菌落为灰白色，不透明，边缘不整齐、表面较粗糙，似融蜡状，菌落较大，约3mm。细菌形态：菌体细胞呈杆状,菌体两端较平整，多数呈链状排列。芽胞呈椭圆形，多位于菌体中央或稍偏于一端。菌体大小：通过光学显微镜利用其目镜测微尺与镜台测微尺对菌株R75E单个细胞的大小进行测量，通过测量可知单个细胞宽约为1-2μm，长约为3-5μm。细菌好氧性观察：挑取实施例1中菌株R75E的单菌落于LB液体培养基中，试管密封，于
37℃，培养15h。如果细菌分布于整个溶液中，则是兼性厌氧菌；如果主要分布于培养液表面而内部几乎无菌，则是好氧菌。菌株R75E在LB液体培养基中密封培养后，澄清透明的LB液体培养基变浑浊，细菌分布于整个溶液，表明R75E菌株为兼性厌氧菌。

[0036] (2)菌株R75E的16S rDNA序列分析

[0037] 根据细菌基因组16S rDNA的保守序列设计用于PCR鉴定的引物对，如SEQID No:1所示的引物P1(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和SEQ ID No:2所示的引物P2(5-CTACGGCTACCTTGTTACGACT-3)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

[0038] 用无菌牙签挑取实施例1中所得菌株R75E的单菌落于100μl无菌水充分混匀，获得菌悬液即为扩增16S rDNA片段的模板。50μL菌落PCR反应体系中各成分如下：

[0039]10×PCR缓冲液 5μL
菌悬液 1μL
引物P1(10μmol/L) 1μL
引物P2(10μmol/L) 1μL
dNTP(2mmol/L) 5μL
Taq DNA聚合酶 0.5μL
水 36.5μL

[0040] PCR反应条件设定如下：

[0041]

[0042] 反应结束后，将PCR产物利用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测条件为110V，35min，结检测果如图2所示，利用该菌落PCR方法成功扩增出了分子量接近1.4kb的16S rDNA片段。将PCR产物割胶回收后送往英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序。经测序，实施例1中所得的16S rDNA的序列如SEQ ID No：3所示。

[0043] 利用如SEQ ID No：3所示的R75E菌株16S rDNA序列在Genbank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中做序列同源性(BLAST)比较，发现与菌株R75E同源性最高的菌株是蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus SP31，同源性为100％。

[0044] (3)生理生化试验

[0045] 菌株R75E为革兰氏阳性菌，过氧化氢酶反应阳性，硝酸盐还原反应阳性、酪蛋白分解阳性、卵黄反应阳性、溶血反应阳性、可分解L-酪氨酸。

[0046] (4)菌株R75E糖发酵实验

[0047] 挑取实施例1中菌株R75E的单菌落接种至5mL LB液体培养基中培养，培养条件为37℃，150r/min，12h，参照API50CHB液体培养基(生物梅里埃中国有限公司，API50CHB Medium，货号：50430)使用说明书所述，在适当的API50CHB液体培养基中制备接种物(即菌悬液)，菌悬液制备好以后立即用无菌加样器将菌悬液接入API50CH碳水化合物鉴定试剂条(生物梅里埃中国有限公司)上的50个小管中，37℃厌氧培养24h和48h。试剂条上第一个孔不含任何活性成分，仅为API50CHB培养基，以此作为阴性对照，其余的49个孔分别含有49种不同的碳水化合物，如下表1所示。分别记录培养24h和48h后菌株R75E对49种碳水化合物的发酵结果。

[0048] 表1.菌株R75E的碳源利用情况

[0049]底物成分 24h 48h 底物成分 24h 48h
阴性对照 - - 七叶灵 + +
甘油 √ √ 柳醇 + +
赤癣醇 － － 纤维二糖 √ +
D-阿拉伯糖 － － 麦芽糖 + +
L-阿拉伯糖 － － 乳糖 - -
核糖 + + 蜜二糖 - -
D-木糖 － － 蔗糖 + +
L-木糖 － － 海藻糖 + +
阿东醇 － － 菊糖 - -
β-甲基-D-木糖甙 － － 松叁糖 - -

[0050]半乳糖 － － 棉子糖 - -
葡萄糖 + + 淀粉 + +
果糖 + + 肝糖 + +
甘露糖 - - 木糖醇 - -
山梨糖 - - 龙胆二糖 √ √
鼠李糖 - - D-土伦糖 √ √
卫矛醇 - - D-来苏糖 - -
肌醇 - - D-塔格糖 - -
甘露醇 - - D-岩糖 - -
山梨醇 - - L-岩糖 - √
α-甲基-D-甘露糖甙 - - D-阿拉伯糖醇 - -
α-甲基-D-葡萄糖甙 - - L-阿拉伯糖醇 - -
N-乙酰-葡萄糖胺 + + 葡萄糖酸钾 √ +
苦杏仁甙 √ √ 2-酮基-葡萄糖 - -
酸盐
熊果甙 + + 5-酮基-葡萄糖 - -
酸盐

[0051] 表中：+：为可利用，-：为不可利用，√：为利用较弱

[0052] 如表1结果所示：菌株R75E能够高效利用核糖、葡萄糖、果糖、七叶灵、柳醇、蔗糖、海藻糖、淀粉、肝糖、N-乙酰-葡萄糖胺和熊果甙作为碳源进行发酵生长；利用甘油、纤维二糖、苦杏仁甙、龙胆二糖、D-土伦糖、L-岩糖、葡萄糖酸钾等碳源进行发酵生长的能力较低；其余的碳源则完全不能被菌株R75E所利用。将该结果与生物梅里埃中国有限公司的芽孢杆菌碳源利用谱数据库进行比对分析表明，本发明菌株R75E与蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus具有99.8％的同源性。

[0053] (5)蛋白质结晶毒素试验

[0054] 综合实施例2中(1)-(4)的结果，结合《伯杰细菌鉴定手册(第八版)》，为了进一步鉴定菌株R75E，取经30℃培养24h并于室温放置2-3天的菌株R75E液体培养物少许于载玻片上，滴加蒸馏水混涂成薄膜。经自然干燥，微火固定后，于涂膜中加甲醇30s后倾掉，再通过火焰干燥，于载片上滴满0.5％碱性复红溶液，放火焰上加热微见蒸汽(勿使染液沸腾)后持续1.5min，移去火焰，使载玻片放置30s，倾去染液。用洁净自来水彻底清洗、晾干、镜检。观察有无游离芽孢和染成黑色的菱形毒素结晶体。如发现游离芽孢形成的不丰富，应将培养物置室温2-3天再行检验。苏云金芽孢杆菌用此法检测为阳性，而蜡样芽孢杆菌为阴性。实验结果表明，实施例1中的菌株R75E室温放置4天后可观察到大量游离芽孢，且无黑色的菱形结晶毒素，即实施例1中的菌株R75E可确定为蜡样芽孢杆菌。

[0055] 综上，依据形态特征、遗传特性16S rDNA、糖发酵、蛋白质结晶毒素试验表明，实施例1所得菌株R75E为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus，该菌株于2013年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101，保藏编号为CGMCC NO.8614。

[0056] 3、蜡样芽孢杆菌CGMCC NO.8614胞外胶原酶的酶谱检测与质谱鉴定[0057] (1)用于胶原酶谱检测的SDS-PAGE凝胶的配制

[0058] 配制凝胶所用溶液的配制方法如下：

[0059] pH值为8.8、浓度为1.5mol/L Tris-HCl缓冲液：称取181.71g Tris粉末溶解于500mL超纯水中，用3mol/L HCl溶液调pH值至8.8，再用超纯水定容至1L。

[0060] pH值为6.8、浓度为0.5mol/L Tris-HCl缓冲液：称取60.57g Tris粉末溶解于500mL超纯水中，用3mol/L HCl溶液调pH至6.8，再用超纯水定容至1L。

[0061] 30％丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺凝胶贮液：称取30g丙烯酰胺和0.8g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为80mL的水中，于37℃水浴条件下搅拌至溶解，用超纯水定容至100m L，置于棕色瓶中保存。

[0062] 10％(W/V)十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液：称取10g SDS粉末溶解于60mL超纯水中，再用超纯水定容至100mL。

[0063] 10％(W/V)过硫酸铵(AP)水溶液：称取1g过硫酸铵粉末溶于5mL超纯水中，最终用超纯水定容至10mL，分装至1.5mL离心管中(50μL/管)，于-20℃条件下保存。

[0064] 1％(W/V)Ⅰ型胶原蛋白水溶液：称取0.5g牛跟腱来源的Ⅰ型胶原蛋白(北京索莱宝科技有限公司)溶于30mL超纯水中，最终用超纯水定容至50mL，于4℃条件下保存。

[0065] ①将pH值为8.8、浓度为1.5mol/L的Tris-HCl缓冲液、质量体积比浓度为30％的丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺凝胶贮液的混合物、质量体积比浓度为10％的SDS水溶液、质量体积比浓度为10％的过硫酸铵的水溶液、N,N,N',N'-四甲基乙二胺、质量体积比浓度为1％的Ⅰ型胶原蛋白水溶液和超纯水按量依次加入到容器中充分混匀得到分离胶溶液。各个组分的配比如表2所示。

[0066] ②将pH值为6.8、浓度为0.5mol/L的Tris-HCl缓冲液、质量体积比浓度为30％的丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺凝胶贮液的混合物、质量体积比浓度为10％的SDS水溶液、质量体积比浓度为10％的过硫酸铵的水溶液、N,N,N',N'-四甲基乙二胺和超纯水按量依次加入到容器中充分混匀得到浓缩胶溶液。各个组分的配比如表3所示。

[0067] ③分离胶溶液混匀后立即注入玻璃板间隙中，每个间隙中加量为入5ml，之后，在每个间隙的顶层加入300μL异丙醇，以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用，在室温条件下聚合20min。分离胶聚合完成后倒掉覆盖在其顶层的异丙醇液体，用超纯水润洗2-3次，再用滤纸吸干水分即可加入步骤(2)所得的浓缩胶溶液；之后，插入梳子，避免混入气泡，于室温条件下聚合40min，待凝胶聚合完全后置于密封袋内可在于4℃条件下长期保存。

[0068] 表2：分离胶的组成及配比

[0069]

[0070]

[0071] 表3:浓缩胶的组成及配比

[0072]加样顺序 成分 体积
1 0.5mol/L Tris-HCl缓冲液,pH6.8 1.25mL
2 30％丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺凝胶贮液 0.8mL
3 10％(W/V)十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液 50μL
4 10％(W/V)过硫酸铵(AP)水溶液 25μL
5 N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED) 5μL
6 超纯水 2.85mL
7 总体积 5mL

[0073] (2)、蜡样芽孢杆菌CGMCC NO.8614所产胞外胶原酶的时间进程酶谱分析[0074] ①粗酶液的制备：首先将在-80℃条件下冻存的蜡样芽孢杆菌CGMCCNO.8614在LB固体培养平板上划线培养3代，每代培养条件为37℃，12h，进行菌种复壮；随后，从LB固体培养平板上挑取单菌落接种至5mL LB液体培养基中培养，培养条件为37℃，150r/min，12h，最后，按照体积比1:100的接种量接种至1000mL LB液体培养基中，培养6小时后，吸取50mL菌培养液于4℃条件下12000r/min离心15min。将离心后留取上清液，将上清液用孔径为0.45μm的过滤膜进行除菌过滤，所得滤液即为培养6小时后的蜡样芽孢杆菌CGMCC NO.8614粗酶液。依次类推，在菌液培养的第12h、18h、24h、30h、36h、42h分别吸取50mL菌培养液，与上述操作相同，分别获得培养12h、18h、24h、30h、36h、42h后的蜡样芽孢杆菌CGMCC NO.8614粗酶液，并将上述粗酶液于4℃条件下保存。

[0075] 其中，粗酶液制备所用的培养基配制方法如下：

[0076] LB液体培养基：在900mL去离子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g，用5mol/L NaOH调pH值至7.0，用去离子水定容至1000mL，于121℃高压蒸汽灭菌锅中灭菌20分钟后冷却待用。

[0077] LB固体培养平板：在900mL去离子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g、琼脂10g，用5mol/L NaOH调pH值至7.0，用去离子水定容至1000mL，于121℃高压蒸汽锅中灭菌20分钟，将灭菌后的培养基分装至90mm×90mm的无菌培养皿中(10mL/皿)，冷却凝固后待用。

[0078] ②电泳：首先，将步骤(1)中所得的不同时间的粗酶液按照体积比为5:1的比例分别与5×SDS上样缓冲液混合，在室温下静置10min，吸取15μL混合好的不同培养时间的粗酶液样品，分别上样至凝胶的胶孔底部；最终，将小型垂直电泳槽(Mini PROTAIN3)与电泳仪连接，设定电压为110V，在4℃条件下进行电泳，直至溴酚兰指示剂到达凝胶的最下沿，关闭电源停止电泳。

[0079] 其中，5×上样缓冲液由pH值为6.8、浓度为250mmol/L Tris-HCl缓冲液，0.5％(V/V)溴酚兰，50％(V/V)甘油，10％(W/V)十二烷基硫酸钠(SDS)，5％(V/V)β-巯基乙醇组成。

[0080] ③凝胶的处理：电泳结束后先将凝胶用洗脱液在室温条件下60r/min振荡洗脱2次，每次45min，随后用漂洗液在室温条件下60r/min振荡漂洗2次，每次20min，最后将凝胶用孵育液在37℃下静置孵育12h。孵育结束后将凝胶先经0.1％(w/v)的考马斯亮蓝R-250染色液染色1h，再经脱色液室温振荡脱色直至透明条带清晰。

[0081] 结果如图1所示，在每一个时间点均观察到两条明显的负染条带，该负染条带由胶原酶水解底物胶原蛋白形成。两条负染条带的分子量分别为116kDa(蛋白Ⅰ)和95kDa(蛋白Ⅱ)。而且随着蜡样芽孢杆菌CGMCC NO.8614培养时间的逐渐延长，胶原酶负染谱带逐渐变粗。表明，随着培养时间的逐渐延长，所得粗酶液的胶原酶活性逐渐增强，这与微生物培养过程中胞外酶的分泌规律相符，表明该胶原酶谱法可靠。

[0082] 其中，电泳过程中所用的溶液配制方法如下：

[0083] 洗脱液：pH值为7.6、浓度为50mmol/L Tris-HCl缓冲液，内含2.5％(V/V)聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、5mmol/L CaCl2。

[0084] 漂洗液：pH值为7.6、浓度为50mmol/L Tris-HCl缓冲液，内含5mmol/LCaCl2。

[0085] 孵育液：pH值为7.6、浓度为50mmol/L Tris-HCl缓冲液，内含0.02％十二烷基聚乙二醇醚(Brij)、200mmol/L NaCl、5mmol/L CaCl2。

[0086] 考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R-2501.0g溶于450mL甲醇与冰醋酸100mL的混合溶液后用蒸馏水定容至1L。

[0087] 脱色液：100mL无水甲醇和100mL冰乙酸混合后用蒸馏水定容至1L。

[0088] (3)、胶原酶谱分析所得蛋白的质谱鉴定

[0089] 为了确定本发明的胶原酶谱法中分析得到的蛋白是否属于胶原酶，进而确定该酶谱鉴定方法的准确性。在0℃冰浴条件下向本实施例所得用于电泳的蜡样芽孢杆菌CGMCC NO.8614的粗酶液中缓慢加入硫酸铵粉末并使硫酸铵的最终饱和度达到85％，在冰浴中充分搅拌过夜后进行离心，离心条件为4℃，12000r/min，20min，离心后弃上清留沉淀。按照每1mg沉淀用3mL浓度为50mmol/L、pH值为7.5的Tris-HCl缓冲液的比例复溶沉淀，将沉淀复溶后得到的溶液用浓度为50mmol/L、pH值为7.5的Tris-HCl缓冲液在4℃条件下透析48h，期间Tris-HCl缓冲液每12h更换一次，最终得到的透析后的溶液即为浓缩酶液。

[0090] 电泳：将上述浓缩酶液按照体积比为5:1的比例与5×上样缓冲液混合，煮沸10min后按照常规方法进行SDS-PAGE凝胶电泳及凝胶处理。具体方法为：分离胶浓度为10％，浓缩胶浓度为5％，电泳条件为110V90min，电泳结束后将该凝胶用考马斯亮蓝染色液进行染色，并用脱色液对考马斯亮蓝液染过的胶进行脱色。结果如图2所示，蛋白Marker的95kDa分子量处有两条明显的蛋白条带，这两条蛋白条带的分子量与图1胶原酶谱中的两条负染条带的分子量均非常接近，表明这两个条带所对应的蛋白可能为目标胶原酶。

[0091] 为了对考马斯亮蓝染色后的蛋白条带进行鉴定，用手术刀片分别切下两条蛋白条带，并将切下来的条带送上海博苑生物科技有限公司进行串联质谱分析(MALDI-TOF-TOF)。其中，分子量约为116kDa(蛋白Ⅰ)的蛋白与蛋白质数据库中的全长为965个氨基酸的胶原酶(NCBI数据库序列编号KDB42252)具有较高的同源性，质谱分析结果如表4所示,在所检测的
25个肽段中有22个肽段与蜡样芽孢杆菌胶原蛋白(NCBI数据库序列编号KDB42252)相匹配，该结果表明利用胶原酶谱法筛选出来的蛋白确为胶原酶，证实了本发明的方法的可行性和准确性。而且，另一条分子量约为95kDa(蛋白Ⅱ)的质谱分析结果也表明，蛋白Ⅱ也属于胶原酶，质谱结果如表5所示，在所检测的25个肽段中，有14个肽段与蜡样芽孢杆菌的胶原酶(NCBI数据库序列编号KDB42252)具有高同源性，进一步验证了胶原酶谱法的准确性和可行性。

[0092] 表4:分子量为116kDa的蛋白质的串联质谱分析(MALDI-TOF-TOF)结果[0093]

[0094] 表5分子量为95kDa的蛋白质的串联质谱分析(MALDI-TOF-TOF)结果

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