负载生长因子壳聚糖微球的DBM支架修复关节软骨材料转让专利
申请号 : CN201410311370.7
文献号 : CN104056304B
文献日 : 2015-09-02
发明人 : 李彦林 , 韩睿 , 王慧建 , 王国梁 , 何川 , 王鑫
申请人 : 昆明医科大学第一附属医院
摘要 :
本发明是一种负载生长因子壳聚糖微球的DBM支架修复关节软骨材料。按以下方法制备而得：1）DBM的制备:采用猪新鲜肩胛骨，剔除骨膜、软骨及软组织，取其松质骨，制备成圆饼形状，反复流水搅拌冲洗清除骨髓、血污及表面油脂，自来水冲洗后，置-80℃保存3d后进行适当处理,2）制备壳聚糖缓释微球，3）包裹生长因子微球制备、包封率与载药量计算；4）制备DBM载生长因子-壳聚糖缓释微球复合体；通过红外线法测定DBM支架和微球用EDC交联后酰胺键连接。本发明具有良好的细胞和生物相容性、可降解性，是一种很好的软骨组织工程支架材料。
权利要求 :
1.一种负载生长因子壳聚糖微球的DBM支架修复关节软骨材料，其特征在于按以下方法制备而得：
1 ）DBM的制备:采用猪新鲜肩胛骨，剔除骨膜、软骨及软组织，取其松质骨，制备成圆饼形状，反复流水搅拌冲洗清除骨髓、血污及表面油脂，自来水冲洗后，置-80℃保存3d,然后依次进行以下步骤：（1）无水乙醇脱水2h，风干；
（2）氯仿/甲醇1:1，体积分数，脱脂4h,风干；
（3）0.6mol/L盐酸分别脱钙6h，盐酸/松质骨：20ml/g，风干；
（4）无水乙醇脱水2h，风干；
（5）氯仿/甲醇1:1，体积分数，脱脂4h,风干；
（6）10%PBS,pH=7.4,37℃浸泡3d，中间换液2次，风干；
（7）75%医用酒精消毒，4℃保存备用；
（8）肉眼及扫描电镜下观察；
2 ）壳聚糖缓释微球的制备：分子量100K、脱乙酰度95%的壳聚糖120mg，加入4ml 2% v/v 醋酸，全部溶解后，滴加到120ml含4% v/v 司盘80的正辛醇，1500rpm搅拌30min，加入10ml 10% w/v TPP溶液，再1500rpm搅拌30min后，4000rpm离心收集微球，分3层，由上而下是正辛醇，水和微球，在抽滤装置中，用异丙醇和水各洗3次，冷冻干燥，肉眼观察及扫描电镜；
3 ）包裹生长因子微球制备、包封率与载药量计算：（1）lmg壳聚糖微球与 20ng/ml生长因子15μL，ph=7.4时在4℃充分侵润、膨胀24h；
（2）收集离心上清液，上清液以PBS定容100ml,取10μL另加90μLPBS液作为待测样品，微球冷冻干燥备用；
（3）按生长因子ELISA试剂盒说明书，酶标仪于495nm测定吸光度，按标准曲线计算载药量与包封率；
4）DBM载生长因子-壳聚糖缓释微球复合体的制备：(1)先将DBM称重后装入EP管，再装入包裹生长因子聚糖微球；
(2)将装满微球及DBM的EP管置超声波清洗器内，震荡2小时；
(3)超声完毕，去掉DBM表面的微球，然后称重，计算DBM所载微球的量，并且调整每个DBM含微球量相等；
(4) 称取2gEDC（Carbodiimide，碳化二亚胺）,溶于100ml双蒸水中，配置成0.02% 浓度的EDC溶液，取一块六孔板，取一孔放入适量的配置好的EDC溶液，把制备好的DBM/微球支架浸润在里面；
(5)放置在4℃冰箱内反应24h，取出后，用PBS液洗涤3次，自然风干；
(6)将上述DBM/微球支架大体观察并电镜扫描，观察形貌；
(7)通过红外线法测定DBM支架和微球用EDC交联后酰胺键连接。
说明书 :
负载生长因子壳聚糖微球的DBM支架修复关节软骨材料
技术领域
[0001] 本发明涉及组织工程技术领域，是一种用于关节软骨损伤修复的负载生长因子壳聚糖微球的DBM支架修复关节软骨材料。
背景技术
[0002] 临床因创伤或其它原因引起的关节软骨损伤十分常见，软骨自身很难再生修复。当关节软骨损伤时，由于关节软骨缺乏直接的血液供应、淋巴循环以及神经支配，成熟的软骨细胞在损伤后不能再生，其自身修复的能力十分有限，并且关节软骨缺损后修复过程极为缓慢，再生组织与正常组织在结构和功能等方面均存在着明显的差异，关节软骨退变常难以避免，迄今为止尚无一种完全有效的治疗方法。如何修复关节软骨缺损一直是骨科领域研究的重要问题之一。传统用于修复关节软骨损伤的方法如关节研磨成形术、软骨下钻孔或微骨折术等通过将血液和骨髓中的各种祖细胞迁移至关节软骨缺损区，产生纤维软骨修复。虽然纤维软骨在结构和功能上与透明软骨均有很大差别，但这种治疗方法可有效地缓解患者疼痛，改善关节功能，仍是目前临床治疗局限性软骨缺损的一线治疗方法。骨膜、软骨膜、骨软骨移植是临床上治疗软骨缺损的另一种选择，虽然它可以产生一定程度的透明软骨，改善患者关节功能，但仍然缺乏长期疗效的临床证据，而且由于供体有限，常常限制了其临床应用。自体软骨细胞移植（autologous chondrocyte transplantation,ACT）可以产生一定程度的透明软骨，是近年来应用于临床的一种治疗方法，欧美已有大量的患者接受此种治疗，短期临床研究报告显示其有较好的疗效，但仍然存在细胞分布不均、易漏出、软骨退变、层离、纤维化导致移植失败等问题。为了解决这些问题，很多学者进行了以细胞和三维支架材料为基础的组织工程方法修复软骨缺损的实验研究，并取得良好的结果。
[0003] 在以组织工程方法修复软骨缺损的过程中，修复组织和正常组织的整合尤为重要，其与多种因素相关，包括种子细胞、支架材料以及细胞因子，而支架材料的选择是影响修复质量的一个重要因素，用于组织工程软骨的支架材料主要分为人工合成材料（如PLA、PGA、PLGA等）和生物衍生支架材料（如透明质酸、胶原、藻酸、壳聚糖及脱细胞基质等）。生物衍生支架材料不仅具有良好的生物相容性及良好的生物降解性，而且含有可以促进种子细胞粘附、增殖及分化的生物活性分子，具有人工合成支架材料无可比拟的优势。
[0004] 脱钙骨基质(Demineralized bone matrix, DBM)是生物衍生支架材料中的一种，其主要是利用同种或异种器官/组织，经过脱细胞、去除抗原处理得到脱细胞基质材料。该材料具有细胞外基质成分，含有Ⅰ型胶原，胶原是细胞黏附和生长的良好支架， DBM又具有三维天然孔隙结构系统，故有良好的组织亲和性和相容性，有利于细胞的黏附、增殖和分化，具有人工合成支架材料无可比拟的优势。Kasten等对人工合成的羟基磷灰石(CDHA)、磷酸三钙及脱钙骨基质(DBM)从种子细胞的粘附率、长入支架内部的数量、增殖和分化效率等方面作过比较，结果证明DBM为三者中最优。van Osch等研究发现脱钙骨基质（DBM）复合软骨膜在兔动物模型上具有可靠的成软骨能力。Zhou等发现脱钙骨基质粉（DBP）可以诱导体外三维培养的人骨髓基质干细胞（hMSCs）向软骨细胞分化。Gao等将DBM和骨髓基质干细胞（BMSCs）复合培养后修复兔膝关节负重区软骨缺损，结果软骨缺损深度的95%得到修复。但现有技术中由于DBM的脱钙强度和时间各异，导致修复骨与软骨的作用不一致。
[0005] 本申请的发明人研究后发现，适量脱钙后的骨基质有利于软骨形成、而过量的脱钙骨基质其成软骨能力降低，其原因可能是适量的脱钙可使骨基质中含有的骨形态发生蛋白（BMP）、转化生长因子β（TGF-β）等生物活性因子成分暴露，而过量的脱钙则影响了脱钙骨基质的活性，从而使脱钙骨基质修复软骨的能力受到影响。此外单纯基质支架植入体内如能捕获自身的信号分子和干细胞，在体内原位诱导并促其细胞分化成软骨，且并长期维持其形成的软骨细胞的活性。这种利用体内自身细胞归巢、原位增殖和分化修复软骨缺损的方法似乎更切实际。此外，国内外目前主要采用牛骨、兔骨、羊骨等作原材料，而这些异种骨材料结构与人相差甚远，而同种异体人骨材料来源有限，且易传播肝炎、爱滋病等。如何克服上述不足，让脱钙骨基质这种新型支架材料更好地为患者服务，就成为现有技术中亟待解决的问题。
[0006] 因此，我们在大量研究的基础上，找到DBM支架及细胞因子复合的软骨修复材料，采用体内原位诱导软骨再生以修复软骨缺损。脱钙骨基质 ( DBM) 具有良好细胞组织相容性 ,又有天然孔隙结构 , 并且具有可塑性和一定的机械强度。当前的研究表明BMP-2生长因子是骨软骨修复的基本物质，其能选择地参与低度成熟软骨细胞的成熟过程的调节功能，TGF-β3生长因子能促进骨髓基质干细胞向软骨方向增殖、分化。但是研究表明细胞因子局部使用很快被稀释和代谢，故需反复大剂量使用，而且其价格非常昂贵，故建立完善的缓释系统，可使生长因子更有效地作用于靶细胞，可增强软骨工程化组织。壳聚糖为一种聚合多糖，且表面带有正电荷，易吸引负电荷的蛋白等，被广泛应用与药物缓释载体，因此，制备并应用壳聚糖缓释系统控制生长因子在组织中的持续缓慢释放在组织工程修复软骨损伤的研究具有重要的意义。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，为了克服生长因子生物利用效率防止生长因子缓释过快并安全载递生长因子并持续发挥其在软骨修复过程对细胞的调节作用，该材料不仅能较好地解决了生长因子局部使用很快被稀释和代谢的缺点，可在较长时期内持续缓慢释放生长因子，而且能更容易与宿主的软骨组织粘附和整合，也能容易塑造出与关节匹配的轮廓，从而更好的修复软骨缺损。
[0008] 本发明的负载生长因子壳聚糖微球的DBM支架修复关节软骨材料的制备方法如下：
[0009] 1 ）DBM的制备:采用猪新鲜肩胛骨，剔除骨膜、软骨及软组织，取其松质骨，制备成圆饼形状，反复流水搅拌冲洗清除骨髓、血污及表面油脂，自来水冲洗后，置-80℃保存3d,然后依次进行以下步骤：
[0010] （1）无水乙醇脱水2h，风干；
[0011] （2）氯仿/甲醇（1:1，体积分数）脱脂4h,风干；
[0012] （3）0.6mol/L盐酸分别脱钙6h（盐酸/松质骨：20ml/g），风干；
[0013] （4）无水乙醇脱水2h，风干；
[0014] （5）氯仿/甲醇（1:1，体积分数）脱脂4h,风干；
[0015] （6）10%PBS,pH=7.4,37℃浸泡3d，中间换液2次，风干；
[0016] （7）75%医用酒精消毒，4℃保存备用；
[0017] （8）肉眼及扫描电镜下观察。
[0018] 2 ）壳聚糖缓释微球的制备：120mg 壳聚糖（分子量100K，脱乙酰度95%），加入4ml2% v/v 醋酸，全部溶解后，滴加到120ml 正辛醇（含4% v/v 司盘80），1500rpm/min搅拌
30min，加入10ml 10% w/v TPP溶液，再1500rpm/min搅拌30min后，4000rpm离心收集微球（分3层，由上而下是正辛醇，水和微球），在抽滤装置中，用异丙醇和水各洗3次，冷冻干燥，肉眼观察及扫描电镜；
30min，加入10ml 10% w/v TPP溶液，再1500rpm/min搅拌30min后，4000rpm离心收集微球（分3层，由上而下是正辛醇，水和微球），在抽滤装置中，用异丙醇和水各洗3次，冷冻干燥，肉眼观察及扫描电镜；
[0019] 3 ）包裹生长因子微球制备、包封率与载药量计算：
[0020] （1）lmg壳聚糖微球与 20ng/ml生长因子15μL，ph=7.4时在4℃充分侵润、膨胀24h。
[0021] （2）收集离心上清液，上清液以PBS定容100ml,取10μL另加90μLPBS液作为待测样品，微球冷冻干燥备用。
[0022] （3）按生长因子ELISA试剂盒说明书，酶标仪于495nm测定吸光度，按标准曲线计算载药量与包封率。
[0023] 4）DBM载生长因子-壳聚糖缓释微球复合体的制备：
[0024] (1)先将DBM称重后装入EP管，再装入包裹生长因子聚糖微球；
[0025] (2)将装满微球及DBM的EP管置超声波清洗器内，震荡2小时；
[0026] (3)超声完毕，去掉DBM表面的微球，然后称重，计算DBM所载微球的量，并且调整每个DBM含微球量相等；
[0027] (4) 称取2gEDC（Carbodiimide，碳化二亚胺）,溶于100ml双蒸水中，配置成0.02% 浓度的EDC溶液，取一块六孔板，取一孔放入适量的配置好的EDC溶液，把制备好的DBM/微球支架浸润在里面；
[0028] (5)放置在4℃冰箱内反应24h，取出后，用PBS液洗涤3次，自然风干；
[0029] (6)将上述DBM/微球支架大体观察并电镜扫描，观察形貌；
[0030] (7)通过红外线法测定DBM支架和微球用EDC交联后酰胺键连接。
[0031] 碳化二亚胺（EDC）作为连接剂，将壳聚糖微球表面的羧基与DBM中胶原蛋白的氨基结合，形成稳定牢固的共价键结合，通过红外线可以看到单纯DBM组可以吸收特征频率为3427.15cm，单纯微球组可以吸收特征频率为3429.73cm，EDC交联组可以吸收特征频率为3439.08cm，通过红外线可见可吸收特征频率EDC组和单纯DBM、壳聚糖微球之间有明显区别、指纹区之间也有明显区别，说明通过EDC可以把微球和DBM通过共价键结合起来。
[0032] 与现有技术比较，本发明具有以下有益效果
[0033] 1、本发明的脱钙松质骨基质（DBM）具有制备方法相对简便，并可大量获取的特点，低温下能长期保存，经济廉价；可按修复缺损的形状制成不同的形状和大小，应用方便；DBM既保留了猪松质骨的天然网状空隙结构系统，又具有良好的细胞和生物相容性、可降解性，是一种很好的软骨组织工程支架材料。
[0034] 2、选用适宜移植的猪松质骨为原材料,而国外多采用牛骨为原材料。由于猪的解剖生理与人类相近,猪与人MHC-DR基因在同源性高的区域有约60%的相同性,是器官移植供体动物中较能接受的对象，研究发现，新鲜猪骨和正常人骨的无机成份含量比较接近，因此采用猪骨为原材料进行理化加工处理，更易制备出类似人体骨组织天然结构和性能的材料。
[0035] 3、猪松质骨在经过脱脂、脱钙、脱蛋白等一系列理化处理后，其主要成分是胶原纤维，外观为多孔的海绵样结构，孔隙相互交通，可提供宽大的内表面积和空间，有利于种子细胞的黏附、增殖和分化、生长的空间，有细胞外基质的分泌，气体和养分的交换，同时具有良好的生物相容性。
[0036] 4、该产品具有极低的免疫原性，动物实验证实，DBM移植后免疫排斥反应低，DBM具有良好的细胞及组织相容性的同时，还具有消毒后保持其软骨诱导能力的特性，其保存了具有诱导成软骨能力的骨形态形成蛋白（BMP）是骨组织中的一种蛋白分子，主要诱导血管周围游离的和未分化的间充质干细胞和纤维细胞转化为不可逆的骨系细胞，也可在骨骼以外部位产生软骨和骨组织，最终成骨，是一种典型的软骨成骨过程。
附图说明
[0037] 图1 是本发明的DBM支架材料大体观；肉眼观DBM支架材料外观均呈白色海绵状，吸水时用镊子夹持弹性好可挤出水分并能复原，具有一定的韧性，干燥时维持原有形态并有一定的强度，表面见有疏松的多孔结构，表面空隙与深层空隙相连通，空隙大小不等。
[0038] 图2是本发明的DBM扫描电镜形貌特征；SEM观察DBM布满大小不等的孔隙呈天然的网架结构，各孔隙相互交通。
[0039] 图3 是本发明的壳聚糖微球制作离心收集微球（分3层，由上而下是正辛醇，水和微球）。图4 是本发明的壳聚糖微球大体观；壳聚糖微球肉眼观察呈黄色粉末。
[0040] 图5 是本发明的壳聚糖微球扫描电镜形貌特征；SEM观察壳聚糖微球观察球形良好，球体表面光滑，粒径分布较集中。
[0041] 图6是本发明的超声波下壳聚糖微球灌注于DBM支架材料内。
[0042] 图7是本发明的超声波下壳聚糖微球灌注与DBM支架材料内大体观；经过超声波灌注肉眼观可见DBM支架间隙内充满黄色微球。
[0043] 图8是本发明的超声波下壳聚糖微球灌注与DBM支架材料内扫描电镜形貌特征；扫描电镜观察DBM微球复合支架,可见微球均匀分布于DBM间隙内。
[0044] 图9 是本发明的壳聚糖微球灌注与DBM支架材料内的红外线谱的单纯DBM红外线谱。
[0045] 图10单纯壳聚糖微球红外线谱。
[0046] 图11 DBM和壳聚糖微球通过EDC交联谱。
[0047] 碳二亚胺（EDC）作为连接剂，将壳聚糖微球表面的羧基与DBM中胶原蛋白的氨基结合，形成稳定牢固的共价键结合，通过红外线普可以看到单纯DBM组可以吸收特征频率为3427.15cm，单纯微球组可以吸收特征频率为3429.73cm，EDC交联组可以吸收特征频率为3439.08cm，通过红外线谱可见可吸收特征频率EDC组和单纯DBM、壳聚糖微球之间有明显区别、指纹区之间也有明显区别，说明通过EDC可以把微球和DBM通过共价键结合起来。
[0048] 图12是本发明的DBM以Adobe Photoshop CS4软件直方图功能计算孔隙率。
[0049] 图13是本发明的DBM以 Image J软件测量孔径大小。
[0050] 图14、15、16 是本发明的TGF-β3、BMP-2壳聚糖微球体外诱导BMSCs分别2d、14d、21d倒置相差显微镜下观察。
[0051] 图17是本发明的TGF-β3、BMP-2壳聚糖微球体外诱导BMSCsⅡ型胶原免疫组化染色。
[0052] 图18是本发明的TGF-β3、BMP-2壳聚糖微球体外诱导BMSCsⅡ型胶原Western-blot检测。
[0053] 图19是本发明的TGF-β3、BMP-2壳聚糖微球体外诱导BMSCs生长曲线绘制。
[0054] 图20 是本发明本发明的TGF-β3、BMP-2壳聚糖微球体外诱导BMSCs联合培养8天时的扫描电镜特征。
[0055] 图21是本发明的双因子壳聚糖微球/DBM材料植入膝关节软骨缺损动物模型情况。
[0056] 图22是本发明的双因子壳聚糖微球/DBM材料植入膝关节软骨缺损2周时的大体观察。
[0057] 图23是本发明的双因子壳聚糖微球/DBM材料植入膝关节软骨缺损4周时的大体观察。
[0058] 图24 是本发明的双因子壳聚糖微球/DBM材料植入膝关节软骨缺损8周时的大体观察。
[0059] 图25 是本发明的双因子壳聚糖微球/DBM材料植入膝关节软骨缺损12周时的大体观察。
[0060] 图26 是本发明的双因子壳聚糖微球/DBM材料植入膝关节软骨缺损12周时HE染色的组织学表现。
[0061] 图27 是本发明的双因子壳聚糖微球/DBM材料植入膝关节软骨缺损12周时番红O染色的组织学表现。
具体实施方式
[0062] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但它们并不是对本发明的限定。
[0063] 实验例1：
[0064] 1、DBM的制备
[0065] （1）采用猪新鲜肩胛骨，剔除骨膜、软骨及软组织，取其松质骨，制备成直径为7.0mm厚为3.0mm的圆饼形状，反复流水搅拌冲洗清除骨髓、血污及表面油脂，自来水冲洗后，置-80℃保存3d，在依次行；
[0066] （2）无水乙醇脱水2h，风干；
[0067] （3）氯仿/甲醇（1:1，体积分数）脱脂4h,风干；
[0068] （4）0.6mol/L盐酸分别脱钙6h（盐酸/松质骨：20ml/g），风干；
[0069] （5）无水乙醇脱水2h，风干；
[0070] （6）氯仿/甲醇（1:1，体积分数）脱脂4h,风干；
[0071] （7）10%PBS（pH=7.4）37℃浸泡3d，中间换液2次，风干；
[0072] （8）75%医用酒精消毒，4℃保存备用。
[0073] （９）肉眼及扫描电镜下观察（图1、2）
[0074] 2 、壳聚糖缓释微球的制备：
[0075] 120mg 壳聚糖（分子量100K，脱乙酰度95%），加入4ml 2% v/v 醋酸，全部溶解后，滴加到120ml 正辛醇（含4% v/v 司盘80），1500rpm/min搅拌30min，加入10ml 10% w/v TPP溶液，再1500rpm/min搅拌30min后，4000rpm离心收集微球（分3层，由上而下是正辛醇，水和微球）（图3），在抽滤装置中，用异丙醇和水各洗3次，冷冻干燥，肉眼观察及扫描电镜（图4、5）。
[0076] 3 、包裹生长因子微球制备、包封率与载药量计算：
[0077] ①lmg壳聚糖微球与 20ng/ml生长因子15μL，ph=7.4时在4℃充分侵润、膨胀24h。
[0078] ②收集离心上清液，上清液以PBS定容100ml,取10μL另加90μLPBS液作为待测样品，微球冷冻干燥备用。
[0079] ③按生长因子ELISA试剂盒说明书，酶标仪于495nm测定吸光度，按标准曲线计算载药量与包封率。
[0080] 4 、DBM载生长因子-壳聚糖缓释微球复合体的制备：
[0081] (1)先将DBM称重后装入EP管，再装如包裹生长因子聚糖微球。
[0082] (2)将装满微球及DBM的EP管置超声波清洗器内，震荡2小时（图6）。
[0083] (3)超声完毕，去掉DBM表面的微球，然后称重，计算DBM所载微球的量，并且调整每个DBM含微球量相等。
[0084] (4) 称取2gEDC（Carbodiimide，碳化二亚胺），溶于100ml双蒸水中，配置成0.02%溶液，取一块六孔板，取一孔放入适量的配置好的EDC溶液，把制备好的DBM/微球支架浸润在里面。
[0085] (5)放置在4℃冰箱内 反应24h，取出后，用PBS液洗涤3次，自然风干。
[0086] (6)将上述DBM/微球支架大体观察（图7）并电镜扫描，观察形貌（图8）。
[0087] (7)通过红外线法测定DBM支架和微球用EDC交联后酰胺键连接（图9、10、11）。
[0088] DBM的肉眼及SEM观察：
[0089] 肉眼观DBM支架材料外观均呈白色海绵状，吸水时用镊子夹持弹性好，可挤出水分并能复原，具有一定的韧性，干燥时维持原有形态并有一定的强度，表面见有疏松的多孔结构，表面孔隙与深层孔隙相连通，孔隙大小不等（图1）。取制得的DBM 10块，向黏附于载物台上，真空喷金后，上机观察。用扫描电镜观察DSBM的表面结构。SEM观察DBM布满大小不等的孔隙呈天然的网架结构，各孔隙相互交通（图2）。每个标本随机取10幅照片，计算平均孔径大小和孔隙率。孔径大小通过Image J软件的Measure功能计算（图13）；孔隙率通过Adobe Photoshop CS4软件的直方图(histogram)功能计算，以象素（pixel）代表孔隙面积（图12），孔隙率＝（整个照片的像素﹣骨小梁所占的像素）÷整个照片的像素。测得的DBM的平均孔径大小为74.25± 5.23μm及孔隙率71.05±4.25％ (见表1)。
[0090] 表1 DBM 扫描电镜图像测量平均孔隙率及平均孔径大小（n=10）
[0091]测量指标 平均孔隙率（％） 孔径大小（ ）μm
测量值 71.05±4.25 74.25± 5.23
测量值 71.05±4.25 74.25± 5.23
[0092] 壳聚糖缓释微球和微球/DBM复合支架的肉眼及SEM观察：
[0093] 肉眼观壳聚糖缓释微球冷冻干燥的壳聚糖微球大体观察为淡黄色粉末状（见图4）。取适量的壳聚糖缓释微球、壳聚糖缓释微球-DBM复合体分别定向粘附与载物台上，真空喷金后上机观察壳聚糖微球均呈球状，球形良好，球体表面光滑，粒径分布较集中（见图
5）。通过Image J软件测定壳聚糖缓释微球的平均直径大小53.38μm。扫描电镜观察微球在DBM内灌注效率高，微球均匀分布于DBM间隙内。电镜扫描外观形貌无损伤征象，全部粘附与DBM空隙内，所有空隙都可以满意填充（见图8）。
5）。通过Image J软件测定壳聚糖缓释微球的平均直径大小53.38μm。扫描电镜观察微球在DBM内灌注效率高，微球均匀分布于DBM间隙内。电镜扫描外观形貌无损伤征象，全部粘附与DBM空隙内，所有空隙都可以满意填充（见图8）。
[0094] 双因子壳聚糖缓释微球体外诱导BMSCs成软骨分化：
[0095] 取培养2代滇南小耳猪BMSCs细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化后调解细胞浓度5
1×10/mL，接种于6孔培养板，根据培养条件不同将实验分为2组：实验组A组（加入适量的双因子微球）；实验对照B组（未加入微球）放入37℃、5%CO2饱和湿度孵箱中培养，常规培养21天,每2天换液1次，并倒置相差显微镜下观察(见图14、15、16)。以上实验独立重复3次，每次每组3个样本。体外培养21天时提取细胞行Ⅱ型胶原免疫组化（见图17），Western-blot检测Ⅱ型胶表达（见图18）。根据Ⅱ型胶原免疫组化和Western-blotⅡ型胶表达情况可看到缓释微球可以缓慢释放TGF-β3、BMP-2双因子并促进BMSCs向软骨分化。
1×10/mL，接种于6孔培养板，根据培养条件不同将实验分为2组：实验组A组（加入适量的双因子微球）；实验对照B组（未加入微球）放入37℃、5%CO2饱和湿度孵箱中培养，常规培养21天,每2天换液1次，并倒置相差显微镜下观察(见图14、15、16)。以上实验独立重复3次，每次每组3个样本。体外培养21天时提取细胞行Ⅱ型胶原免疫组化（见图17），Western-blot检测Ⅱ型胶表达（见图18）。根据Ⅱ型胶原免疫组化和Western-blotⅡ型胶表达情况可看到缓释微球可以缓慢释放TGF-β3、BMP-2双因子并促进BMSCs向软骨分化。
[0096] BMSCs在双因子微球/DBM支架上的生长曲线绘制：
[0097] 根据支架材料不同将实验分为3组：实验组A组（双因子微球/DBM复合支架组）；实验对照B组（空白微球/DBM支架组）；空白对照组C组（单纯DBM组），按照分组每组随机抽取各组各30块，分成3组，每组为15块，再取6块96孔培养板，在每块板的A1至A5为A组；B1至B5为B组；C1至C5为C组；按以上相应分组将支架放入96孔板中，培养24小
5
时，未发现细菌污染后，吸去培养基后，按以上相应分组将密度为1×10/mL的BMSCs 40μL接种于相应的预湿材料上，5%CO2培养箱中培养3小时后，再分别加0.8mL含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基继续培养，每2天换液一次 。分别在第2、4、6、8、10、12天时取出一块板加MTT 20μL，4小时后加DMSO 150μL，12小时后用酶标检测仪在490nm双波长下测定各孔光密度（OD）值。于第2、4、6、8、10、12天测OD值，绘制增殖曲线，采用方差分析的统计学方法比较各组最大OD值。结果发现OD值分别在第8天、6天、6天达到峰值（见表2），从增殖曲线（见图19）可见各组BMSCs在支架上的生长曲线形态基本相同，呈“S”形。第2～4天为潜伏期，第4～6天进入对数生长期，第6天B组、C组组达到高峰，而A组在第8天时达到高峰之后OD值逐渐下降进入平台期。潜伏期表示细胞与支架材料复合后还有部分逐渐死亡，对数生长期细胞开始在支架材料上大量增殖，进入平台期表示细胞活力逐渐降低。
采用方差分析的统计学方法比较各组最大的OD值（见表3），组间两两比较，得到除B、C两组间没有统计学差异（p＞0.05），其余各组间两两比较均有统计学差异（p<0.05）。表明A组双因子微球/DBM复合支架组更容易促进细胞生长。
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时，未发现细菌污染后，吸去培养基后，按以上相应分组将密度为1×10/mL的BMSCs 40μL接种于相应的预湿材料上，5%CO2培养箱中培养3小时后，再分别加0.8mL含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基继续培养，每2天换液一次 。分别在第2、4、6、8、10、12天时取出一块板加MTT 20μL，4小时后加DMSO 150μL，12小时后用酶标检测仪在490nm双波长下测定各孔光密度（OD）值。于第2、4、6、8、10、12天测OD值，绘制增殖曲线，采用方差分析的统计学方法比较各组最大OD值。结果发现OD值分别在第8天、6天、6天达到峰值（见表2），从增殖曲线（见图19）可见各组BMSCs在支架上的生长曲线形态基本相同，呈“S”形。第2～4天为潜伏期，第4～6天进入对数生长期，第6天B组、C组组达到高峰，而A组在第8天时达到高峰之后OD值逐渐下降进入平台期。潜伏期表示细胞与支架材料复合后还有部分逐渐死亡，对数生长期细胞开始在支架材料上大量增殖，进入平台期表示细胞活力逐渐降低。
采用方差分析的统计学方法比较各组最大的OD值（见表3），组间两两比较，得到除B、C两组间没有统计学差异（p＞0.05），其余各组间两两比较均有统计学差异（p<0.05）。表明A组双因子微球/DBM复合支架组更容易促进细胞生长。
[0098] BMSCs在双因子微球/DBM支架上培养的SEM观察：
[0099] 表2 BMSCs在不同支架上的增殖情况
[0100]
[0101] ▲同一时间点与B组、C 组比较P值＜0.05，★同一时间点与C 组比较P值＞0.05[0102] 表3 各组最大的OD值比较结果
[0103]
[0104] 取上述DBM、双因子缓释微球/DBM各 6块，培养24h后用无菌脱脂棉球吸去培养基后，置于2块6孔培养板中并作好标记，按1×105/mL浓度接种细胞，置培养皿中培养，在培养第6天分别各取出材料，于4℃下2%的戊二醛固定24小时，0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液漂洗后，以1%四氧化锇固定2小时。再以0.1 mol/L二甲砷酸钠缓冲液漂洗，乙醇逐级脱水，醋酸异戊脂保存过夜，二氧化碳临界点干燥，定向黏附于载物台上，真空喷金后，上机观察细胞在材料上黏附、增殖情况。经SEM观察可见培养第8天的载体上细胞明显增多，细胞呈长梭形，附于材料表面及深面生长，细胞表面有多个细长突起，细胞突起相互交叉重叠呈网片状（图20）。
[0105] 双因子缓释微球/DBM复合BMSCs修复关节软骨缺损的研究：
[0106] 成年滇南小耳猪8头，雌雄不限，体重约12-15㎏，由昆明医科大学实验动物中心提供，实验动物合格证号：SYXK（滇）2012-0008，共建立16个全层软骨缺损。动物实验分组右膝股骨外髁负重面为实验组A组(双因子缓释微球DBM／BMSCs)，右膝股骨内髁负重面为实验对照组 B组(空白微球DBM/BMSCs)。将滇南小耳猪经耳缘静脉，给予3%戊巴比妥l ml/kg麻醉，根据术中麻醉情况适当增加麻醉剂量。动物麻醉后，仰卧位固定于动物手术操作台上，于右膝关节手术区备皮、碘伏消毒、铺无菌巾。沿髌骨内侧做纵切口5-7cm，切开内侧关节囊和部分股内侧肌，进入关节腔，将髌骨向外侧脱位，暴露股骨髁和股骨滑车。检查膝关节腔无积液或粘连，关节软骨平坦、色泽正常后，用直径7mm的钻头在股骨内外髁关节负重面，钻一直径7mm，深约3-4mm的骨软骨缺损，用手术刀剥离软骨至软骨下骨表面，压迫止血。生理盐水冲洗关节腔，根据分组情况将体外复合培养8天的复合物填充于关节软骨缺损处(图21)，逐层闭合关节囊和皮肤切口，每只动物术毕时肌注青霉素160万IU，术后肌肉注射青霉素，160万IU/只，每日1次，连用5天。动物肢体不固定，任其自由活动。于术后2周、4周、8周、12周分别处死2头滇南小耳猪，暴露双膝关节腔，取材时肉眼观察关节内有无粘连，有无感染，有无游离体形成，观察缺损处充填、修复组织色泽、平整、与周围正常软骨界线的整合情况。并对标本以10%中性甲醛固定，15% EDTA脱钙后，常规乙醇逐级脱水，石腊包埋，切片，采用HE及番红O染色，光镜下观察，并进行组织学评分。
[0107] ①术后一般情况观察
[0108] 术后当天不喜饮食或饮食较少，以后进食逐渐增多，3天后饮食基本正常。术后5天后活动逐渐增加， 2周左右活动自如，在棚中随意活动。全部术膝切口愈合良好，无感染。
[0109] ②术后标本大体观察
[0110] 2周时各组的大体观察，修复组织色泽暗红，表面粗糙不平，与周围软骨分界清楚（图22）； 4周时A组软骨缺损区由半透明或白色新生类软骨组织充填，B组修复组织色泽暗红，表面粗糙不平，与周围软骨分界清楚，质较软（图23）；8周时 A、B组修复组织与周围软骨色相近，表面欠平整，与周围软骨界限明显，A组修复速度略快，高于周围软骨平面，支架材料已完全吸收（图24）； 12周时 A、B组修复组织与周围软骨色相近，A组修复组织与周围软骨基本融合在一起，界限模糊不清，B组稍模糊（图25）。
[0111] ③组织学切片观察：
[0112] 对标本以10%中性甲醛固定，15% EDTA脱钙后，常规乙醇逐级脱水，石腊包埋，切片，采用HE，光镜下观察，并进行组织学评分，12周行HE及番红O染色。
[0113] 12周时各组HE染色观察A组以透明软骨细胞为主，细胞数目多且胞体较大与周围软骨整合紧密、厚度相近，修复面平整，与周围分界难以辨别，软骨下骨修复完整，B组透明样软骨，细胞数目较多，修复组织表面光滑，与周围软骨边界尚清楚（图26）。
[0114] 12周时各组番红O染色观察A、B组番红O染色阳性A组染色均匀，与正常软骨染色相似，修复面平整，与周围分界难以辨别，B组修复面平整，与周围分界尚清楚（图27）。