一种灵芝多糖及其制备方法

摘要

本发明公开了一种灵芝多糖及其制备方法，该灵芝多糖的制备方法包括：灵芝子实体进行水提，得到提取残渣；提取残渣进行超微粉碎，得到超细粉；超细粉经过水提醇沉，收集到的沉淀即为灵芝多糖。本发明制备得到的灵芝多糖β-葡聚糖含量达到50％以上，具有明显的激活巨噬细胞的活性。

权利要求

1.一种灵芝多糖的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

提取残渣：将灵芝子实体粉碎成粗粒，加入10-15倍重量的水，常温浸泡30-60分钟，加热至沸腾，保持60-120分钟，过滤；

超细粉碎：将提取残渣干燥后，用超微粉碎震动磨机粉碎30-40分钟，过200目筛，收集超细粉；

水提醇沉：将超细粉，加入15-20倍重量的蒸馏水，常温浸泡30-60分钟，加热至沸腾，保持60-120分钟，离心；将提取液，减压浓缩至料液比为1:1－1:2，质量/体积，单位：千克/升，加入无水乙醇，至乙醇重量百分比含量达到40％－60％，室温静置3－5小时，离心去除醇沉上清液，收集沉淀，冷冻干燥后即为所需的灵芝多糖。

2.一种灵芝多糖，其是由权利要求1所述方法制备得到的。

说明书

一种灵芝多糖及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及药用真菌深加工领域，具体地说涉及一种灵芝多糖及其制备方法。

背景技术

[0002] 灵芝(Ganoderma lucidum)是我国最著名的药用真菌，因其具有抗肿瘤、提高免疫、延缓衰老等作用，已作为功能食品和药品得到广泛应用。灵芝多糖是灵芝的主要活性成分之一，药理活性多样，尤其在提高机体免疫功能、抗肿瘤等方面效果显著。随着灵芝提取物在保健品和医药领域的应用不断扩大，灵芝子实体的提取量剧增，导致剩余大量的提取残渣，废弃不用将对环境产生污染，并且造成很大的资源浪费。

[0003] β-葡聚糖是真菌细胞壁上的主要成分之一，其结构主链以β-(1,3)糖苷键连接为主，被认为是主要的活性多糖。大量研究证明该类多糖能够激活免疫细胞、调节细胞因子分泌，参与宿主特异性免疫与非特异性免疫，从而提高机体免疫功能。近些年灵芝中分离获得的杂多糖较多，对其β-葡聚糖的研究较少。且β-1,3-葡聚糖的提取多以碱提为主，后续处理工艺复杂。

发明内容

[0004] 本发明首先提供了一种灵芝多糖的制备方法，该方法包括如下步骤：

[0005] 灵芝子实体进行水提，得到提取残渣；

[0006] 提取残渣进行超微粉碎，得到超细粉；

[0007] 超细粉经过水提醇沉，收集到的沉淀即为灵芝多糖。

[0008] 具体的说，本发明的一种灵芝多糖的制备方法，包括如下步骤：

[0009] 提取残渣：将灵芝子实体粉碎成颗粒，加入10-15倍重量的水，常温浸泡30-60分钟，加热至沸腾，保持60-120分钟，过滤；

[0010] 超细粉碎：将提取残渣干燥后，用超微粉碎震动磨机粉碎30-40分钟，过200目筛，收集超细粉；

[0011] 水提醇沉：将超细粉，加入15-20倍重量的蒸馏水，常温浸泡30-60分钟，加热至沸腾，保持60-120分钟，离心；将提取液，减压浓缩至料液比为1:1－1:2(质量/体积，单位：千克/升)，加入无水乙醇，至乙醇重量百分比含量达到40％－60％，室温静置3－5小时，离心去除醇沉上清，收集沉淀，冷冻干燥后即为所需的灵芝多糖。

[0012] 本发明还提供了一种灵芝多糖，其是利用上述灵芝多糖的制备方法制备得到的。

[0013] 本发明得到的灵芝多糖，分子量为18万-240万道尔顿，β-葡聚糖含量达到50％以上，具有明显的激活巨噬细胞的活性。

[0014] 本发明的灵芝多糖的制备方法是一种简便、高效、无污染、多糖含量高的适合规模化生产的方法，通过上述制备方法可获得质量稳定的灵芝多糖，得率达到0.9％，多糖含量超过80％，其中β-葡聚糖含量达50％以上。

[0015] 说明书附图

[0016] 图1灵芝多糖体外刺激巨噬细胞释放NO的活性测定结果

[0017] 图2HPLC分析灵芝多糖的分子量分布图谱具体实施方式：

[0018] 赤灵芝子实体：浙江龙泉基地栽培获得的沪农灵芝1号子实体

[0019] 超微粉碎震动磨机：山东三清不锈钢设备有限公司SQW系列

[0020] 实施例1：

[0021] 1、灵芝提取残渣的获得：以赤灵芝子实体为原料，粉碎成粗粒，称取200g，加入3L水，常温浸泡30分钟，加热至沸腾，保持120分钟，过滤。滤渣重复上述步骤，再提取1次，过滤后，所得残渣在60℃鼓风干燥器中烘干。

[0022] 2、灵芝残渣的超微粉碎：将干燥后的灵芝提取残渣采用超微粉碎震动磨机粉碎30min，过200目筛，收集超细粉。

[0023] 3、灵芝多糖的提取分离：称取上述灵芝残渣超细粉150g，加入2L蒸馏水，常温60分钟，加热至沸腾，保持微沸60分钟，离心。沉淀重复提取1次，离心后，收集合并提取液，减压浓缩至料液比为1:1(质量/体积，单位：千克/升)，缓慢加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇含量达到50％，室温静置4小时，离心去除醇沉上清，收集沉淀。

[0024] 4、干燥：沉淀加水溶解，挥干乙醇后置于-20℃冰箱中冻存2h，然后再放到-80℃冰箱中冷冻3h，最后放入冷冻干燥机中冻干，即获得所需的灵芝多糖。

[0025] 多糖含量的检测：

[0026] 用苯酚－硫酸法测定，精密称取本品10mg置100ml容量瓶中，加水约80ml，加热助溶后冷却至室温，在100ml容量瓶中定容。精密吸取样品1.0m1，置15ml试管中，分别加入苯酚、硫酸试剂，充分反应后在490nm处测定吸光度值，以葡聚糖为标准品计算样品的糖含量。

[0027] β-葡聚糖含量测定：参照Megazyme公司的酵母和蘑菇β-葡聚糖检测试剂盒中的方法对多糖样品中β-葡聚糖含量进行测定。

[0028] 制备所得灵芝多糖的得率为0.91％，多糖含量为82.52％，β-葡聚糖含量为53.21％。实施例2：

[0029] 1、灵芝提取残渣的获得：以赤灵芝子实体为原料，粉碎成粗粒，称取500g，加入6L水，常温浸泡40分钟，加热至沸腾，保持微沸120分钟，过滤。滤渣重复上述步骤，再提取2次，过滤后，所得残渣在60℃鼓风干燥器中烘干。

[0030] 2、灵芝残渣的超微粉碎：将干燥后的灵芝提取残渣采用超微粉碎震动磨机粉碎40min，过200目筛，收集超细粉。

[0031] 3、灵芝多糖的提取分离：称取上述灵芝残渣超细粉400g，加入6L蒸馏水，常温60分钟，加热至沸腾，保持微沸120分钟，离心。沉淀重复提取2次，离心后，收集合并提取液，减压浓缩至料液比为1:1.5(质量/体积，单位：千克/升)，缓慢加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇含量达到40％，室温静置4小时，离心去除醇沉上清，收集沉淀。

[0032] 4、干燥：沉淀加水溶解，挥干乙醇后置于-20℃冰箱中冻存2h，然后再放到-80℃冰箱中冷冻3h，最后放入冷冻干燥机中冻干，即获得所需的灵芝多糖。

[0033] 制备所得灵芝多糖的得率为0.94％，多糖含量为85.31％，β-葡聚糖含量为54.51％。实施例3：

[0034] 灵芝多糖体外刺激巨噬细胞释放NO的活性测定：

[0035] 1、样品准备：精确称取实施例1和实施例2制备得到的灵芝多糖于灭过菌的eppendorf管中，用无菌的PBS配制成浓度5mg/mL的样品液。充分溶解后以15000r/min离心30min，无菌条件下将上清转移至新的无菌eppendorf管中，将样品稀释成2mg/mL、0.5mg/mL、0.1mg/mL待用。

[0036] 2、细胞培养：取对数生长期的RAW264.7巨噬细胞株，用DMEM完全培养基在37℃、含5％CO2条件下传代培养，用0.05％胰酶或5％EDTA溶液消化，混悬液1000rpm/min离心3min后收集细胞，计数备用。

[0037] 3、试剂配制及标准曲线绘制

[0038] Griess试剂：在烧杯中加入6.25ml H3PO3，加入蒸馏水250ml，分别加入2.5g的sulfanilamide和0.25g的naphthylethyylene-diamine dihydrochloride用磁力搅拌器至全部溶解，棕色试剂瓶4℃冰箱保存。

[0039] 标准曲线绘制：配成不同浓度的亚硝酸钠溶液，浓度梯度为0、5、10、15、20、25、30、35、40μM共九个；取 于96孔板孔，加入50μL Griess试剂,测定543nm吸光值，标准曲线每个浓度3个重复，根据吸光值绘制标准曲线。

[0040] 4、样品刺激巨噬细胞释放NO量的测定：收集RAW264.7细胞，用无色5
RPMI1640(10％胎牛血清+1％抗生素液体)培养基将细胞稀释至5×10/mL，加入96孔板，每孔加入180μL，然后再加入 待测样品，阳性对照为LPS(1μg/mL)，37℃培养48小时。取 上清于96孔板孔，加入50μl Griess试剂，室温孵浴10分钟，测定543nm吸光值。根据标准曲线计算细胞NO的释放量。

[0041] 结果见附图1，由此结果可以看出，实施例1和实施例2所得的灵芝多糖对RAW264.7巨噬细胞株释放NO有明显的促进作用，可明显增强巨噬细胞的吞噬杀伤能力，从而增强机体的抗肿瘤能力。

[0042] 实施例4：

[0043] 灵芝多糖的分子量分析

[0044] 1、试验方法：高效液相色谱联用多角度激光散射仪分析法(HPSEC-MALLS)[0045] 2、样品前处理：精密称取实施例1的多糖5mg，加入1mL磷酸盐缓冲液，使其充分溶解，样品液12000rpm离心20min，取上清液，进样分析。

[0046] 3、分析条件：美国Waters HPLC高效液相色谱仪(Waters2695)；色谱柱为TSK-GEL系列G6000PWXL凝胶柱，规格为7.8mm×300mm(TOSOH，日本)；柱温：35℃；流动相：0.15mol/L NaNO3和0.05mol/L NaH2PO4，(pH＝7，0.02％叠氮钠)；流速：0.5mL/min；进样量：100μL；检测器：2414示差折光检测器，8角度激光散射仪(Wyatt，HELEOS8)，激光检测器光源波长选用623.8nm。多糖在溶液中的折光指数增量(dn/dc)按照0.146mL/g计算。

[0047] 4、数据处理：使用Astra(version6.1.1,Wyatt Technology,Santa Barbara,CA)数据分析软件对光散射数据进行采集和分析，计算分子量。

[0048] 分子量分析结果见图2，通过计算得知该多糖的主要分子量分布范围在18万到240万道尔顿。