一种调控小黑杨抗锈菌侵染基因表达的miRNA

摘要

一种调控小黑杨抗锈菌侵染基因表达的miRNA，涉及一种调控抗锈菌侵染基因表达的miRNA。本发明提供一种调控小黑杨抗锈菌侵染基因表达的miRNA，通过对该miRNA及其靶基因的研究，在杨树抗病育种中具有重要的生物学意义和潜在的应用价值。调控小黑杨抗锈菌侵染基因表达的miRNA核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。其前体序列如SEQ ID NO：2所示。本发明调控小黑杨抗锈菌侵染基因表达的miRNA可提高小黑杨对锈病的抗性，用于抗病育种。通过基因工程手段对该miRNA的研究可为深入研究调控杨树抗锈病侵染机理和提高小黑杨对锈病的抗性奠定基础。

权利要求

1.一种调控小黑杨抗锈菌侵染基因表达的miRNA，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的调控小黑杨抗锈菌侵染基因表达的miRNA的前体序列，其特征在于其序列如SEQ ID NO：2所示。

说明书

一种调控小黑杨抗锈菌侵染基因表达的miRNA

技术领域

[0001] 本发明涉及一种调控抗锈菌侵染基因表达的miRNA。

背景技术

[0002] MicroRNAs(miRNAs)是具有调控基因表达作用的内源非编码小RNA(smallRNAs)，它们主要是通过结合靶基因mRNA或靶基因mRNA的3’非翻译区(3’-untranslated region，3’-UTR)来降解该基因mRNA或者阻碍其翻译，从而在转录后水平控制基因表达。最早发现的miRNA是在线虫中观察到的与靶基因转录物的3’-UTR互补的长18-22nt的RNA分子，包括lin-4和let-7基因，线虫的发育由这些RNA基因所调控。随后miRNA被发现在包括从线虫到果蝇以及人的多种组织中存在，对植物miRNA的报导始于2002年。随着现代生物技术和分子生物学的发展，植物miRNA的发现数量呈指数增长。目前，miRNA数据库miRBase中已登记了1160多条植物miRNA序列及相关信息。植物miRNA的发现及其在植物生长发育和胁迫应答中的作用是植物分子生物学研究领域的一大热点。大量研究发现，植物miRNAs主要依靠与靶基因之间完全或近乎完全的互补配对切割靶基因或翻译抑制实现其调控功能，在调节植物生长发育、细胞增殖、生物及非生物胁迫响应中发挥重要作用。

[0003] 杨树是重要的用材林树种，具有较大的经济效益和生态效益。由落叶松-杨栅锈菌(Melampsora larici-populina)引起的杨锈病是杨树的主要病害之一。近年来，其为害日趋严重。利用基因工程技术培育抗锈病杨树品种是重要的防病手段。利用基因工程改良杨树抗病性依赖于对杨树抗病相关基因及其调控元件的认识。植物抗病反应是多种生理过程相互调控的综合反应。目前有关杨树抗锈菌侵染的分子研究主要集中在一些直接参与杨树抗真菌侵染抗性效应的功能基因和蛋白质中，而忽略了导致诸多基因差异表达的幕后操纵者，即这些防卫反应相关基因的上游调控网络是研究中的盲点。近年来发现植物microRNA在植物生长发育和胁迫应答中具有重要的调控作用。如果逆向探寻上游的调节分子，找到处于杨树抗锈菌分子网络中的“始作俑者”-microRNA，并对杨树抗锈菌基因与其对应的microRNA调控过程进行深入研究，或可揭示锈菌侵染过程中杨树基因表达调控的完整过程并为杨树抗锈菌研究应用于生产实践开辟新的道路。

发明内容

[0004] 本发明提供一种调控小黑杨抗锈菌侵染基因表达的miRNA及其应用。

[0005] 本发明调控小黑杨抗锈菌侵染基因表达的miRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

[0006] 上述调控小黑杨抗锈菌侵染基因表达的miRNA前体序列如SEQ ID NO：2所示。

[0007] 上述调控小黑杨抗锈菌侵染基因表达的miRNA可调控小黑杨对锈病的抗性，用于抗病育种。

[0008] 本发明构建落叶松-杨栅锈菌(Melampsora larici-populina)侵染前后的小黑杨(Populus simonii×P.nigra)小RNA文库，采用Illumina测序技术测序，获得一条新miRNA，命名为Pn-5p-310376_3，该miRNA在锈菌接种后表达上调(log2＝12.64)。通过构建降解组，发现其靶基因为NB-ARC(nucleotide binding in APAF-1，plant disease resistance gene products and CED-4)抗性蛋白基因(Potri.014G002000.1)，剪切位点为752nt。

[0009] 在锈菌侵染后表达量上调，表明该miRNA在小黑杨抗锈菌侵染过程中起作用。鉴于该miRNA调控的靶基因为NB-ARC抗性蛋白基因(NB-ARC抗性蛋白基因编码含有核苷酸结合位点的植物抗病蛋白)，更进一步说明该miRNA在杨树抗病过程中起到关键作用。通过对该miRNA及其靶基因的研究，在杨树抗病育种中具有重要的生物学意义和潜在的应用价值。

附图说明

[0010] 图1为调控小黑杨抗锈菌侵染基因表达的miRNA前体序列的茎环结构图；图2为实施例1中小黑杨叶片总RNA的电泳图。

具体实施方式

[0011] 以下的实施例便于更好的理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料及设备，如无特殊说明，均通过市场购买直接获得。

[0012] 本发明提供的调控小黑杨抗锈菌侵染基因表达的miRNA来源于小黑杨，命名为Pn-5p-310376_3，其长度为21nt，其前体序列和折叠成一种稳定的茎环结构，如图1所示，属于miRNA前体典型的二级结构。

[0013] 实施例1：调控小黑杨抗锈菌侵染基因表达的miRNA的获得，miRNA靶基因的鉴定及miRNA功能验证。

[0014] (一)小黑杨RNA抽提及质量鉴定：

[0015] 将落叶松-杨栅锈菌接种于小黑杨叶片，分别取接种落叶松-杨栅锈菌2hpi、6hpi、12hpi、24hpi、3dpi、5dpi和7dpi共七组小黑杨叶片，分割成小块，每组取100mg植物组织置于经DEPC处理的1.5ml离心管中，并迅速置于液氮中冷冻备用。参照miRNeasy Kit(购买自QIAGEN公司)操作手册提取各组小黑杨叶片总RNA，并将每组的RNA等比混合。按照同样的方法提取没有接种落叶松-杨栅锈菌的小黑杨叶片总RNA。1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，结果如图2所示，图2中Rust+表示接种锈菌后的小黑杨叶片总RNA，Rust-表示未接种锈菌的小黑杨叶片总RNA，电泳条带清晰，无拖尾模糊现象，28S条带亮度大于18S，其比值接近2:1。分别取1μl RNA样品用Eppendorf分光光度计测定OD280、OD260和OD230值，OD 260/280比值分别在1.8-2.0，OD 260/230比值分别﹥1.8。说明所提取RNA质量较好。

[0016] 所述的落叶松-杨栅锈菌(Melampsora larici-populina)于2003年 在《Quantitative inoculations of poplars with Melampsora larici-populina.European Journal of Plant Pathology》(M.H.Pei,C.Ruiz,J.Harris,T.Hunter.,2003,109:269-276.)中公开，由文章的作者M.H.Pei惠赠。

[0017] (二)小RNA文库构建及高通量测序：

[0018] 使用Illumina Truseq Small RNA Preparation kit试剂盒(购买自Illumina公司，货号为RS-200-0012)并参照其说明书分别构建接种锈菌前后杨树的小RNA文库，构建好的文库用Illumina GAIIX测序仪进行高通量深度测序。

[0019] (三)降解组测序：

[0020] 提取接种锈菌前后杨树的mRMA(含有polyA末端)，连接含有3’MmeI位点的RNA接头，应用反转录酶反转录为cDNA(反转录酶购买自Promegra公司，货号A3801)，合成双链cDNA，MmeI酶切(MmeI酶购买自NEB公司，货号R0637S)，连接dsDNA接头，凝胶电泳纯化，PCR扩增，从而完成整个文库制备工作，构建好的文库用Illumina GAIIX测序仪进行高通量深度测序。

[0021] (四)miRNA生物信息学分析

[0022] 采用ACGT101-miR v4.2分析软件对小RNA文库测序结果进行分析，应用Blast技术分析筛选出miRNA。

[0023] 小RNA文库测序结果表明，接种锈菌的文库共测得9,736,262条raw序列，未接种锈菌的文库共测得8,840,983条raw序列。去除冗余序列后，接种锈菌的文库共测得4,070条unique序列，未接种锈菌的文库共测得3,820条unique序列。侵染前后的两个文库共得到5,135条unique miRNA。

[0024] 采用CleaveLand程序分析降解组数据，结合上一步筛选出的miRNA数据，进行靶基因预测。应用Oligomap短阅读框校准器找出与降解组序列相匹配的mRNAs。对降解组序列有价值的标准序列以NRPM(每百万阅读)在数据库中进行比较除去冗余。再次应用Oligomap提取每个准确配对降解组序列的mRNA的配对位点上游13个序列和下游13个序列，组成一个26nt的mRNA，应用EMBOSS包中的Needle程序得出与提供的小RNA库中序列相匹配的所有序列，然后根据植物miRNA/靶标配对标准，对列阵进行评分。

[0025] 对所降解组进行分析表明，总共获得8,409,874raw序列，其中5,077,704unique reads可以在杨树mRNA数据库中找到相应序列。进一步结合miRNA数据数据分析，1,475miRNAs可以找到其对应的靶基因。分别对这些靶基因进行BLAST分析，结果发现：miRNA Pn-5p-310376_3的靶基因为NB-ARC(nucleotide binding in APAF-1，plant disease resistance gene products and CED-4)抗性蛋白基因(Potri.014G002000.1)，剪切位点为752nt。

[0026] 比较接种前后的小RNA文库测序结果可知，该miRNA Pn-5p-310376_3在锈菌接种后(reads＝6)比接种前(reads＝0)表达量显著上调(log2＝12.64)。