一种关白附二萜类总生物碱及其制备方法

摘要

本发明提供了一种关白附二萜类总生物碱及其制备方法，具体来说公开了一种从关白附中制备二萜类总生物碱的方法。该方法采用CO2超临界萃取法提取关白附，再进行加酸-碱化-萃取处理，萃取物再以碱水洗涤。具体来说该方法包括如下步骤：步骤1：取关白附药材以CO2为溶剂进行超临界萃取；步骤2：将步骤1得到的萃取物以酸水溶解，将酸水液进行碱化处理后以有机溶剂萃取；以及步骤3：将步骤2得到的有机溶剂萃取物以碱水洗涤，回收有机溶剂。其总生物碱含量高达到50%以上，且大大降低了毒性成分关附辛素的含量。

权利要求

1.一种制备关白附二萜类总生物碱的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：步骤1：取关白附药材以CO2为溶剂进行超临界萃取；

步骤2：将步骤1得到的萃取物以酸水溶解，将酸水液进行碱化处理后以有机溶剂萃取；

以及

步骤3：将步骤2得到的有机溶剂萃取物以碱水洗涤，回收有机溶剂；

其中，步骤1超临界萃取过程中加入夹带剂，所述夹带剂选自甲醇、乙醇、丙酮中的一种或几种；

步骤2加酸水至pH为1-3；步骤2酸水液碱化至pH为8-11；

步骤3所述碱水的pH为8-12。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述夹带剂为乙醇和丙酮按1:1组成的混合溶液。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述夹带剂加入量为按质量比计，夹带剂：关白附药材＝1:(1.5-20)。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3所述碱水选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、氨水或碳酸钠溶液中的任意一种。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2所述酸水选自1-5％的盐酸、硫酸或醋酸溶液中的任意一种。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2碱化所用的碱溶液选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、浓氨水或碳酸钠溶液中的任意一种。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2所述萃取用有机溶剂选自乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、正丁醇、甲醇、乙醇、乙醚、丙酮和醋酸甲酯中的一种或者其中几种的混合物。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1超临界萃取条件为：萃取压力为15-

50MPa，萃取温度为30-70℃，超临界CO2流量为10-45kg/h,萃取时间为1-6小时，解析压力为

4-11MPa，解析温度为45-60℃。

说明书

一种关白附二萜类总生物碱及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及从中草药中制备得到关白附二萜类总生物碱的方法，尤其是从毛茛科植物黄花乌头Aconitum coreanum(Lévl.)Rapaics的块根（关白附）中提取、萃取、分离得到关白附二萜类总生物碱的方法。

背景技术

[0002] 中药毛茛科黄花乌头Aconitum coreanum(Lévl.)Rapaics是主产于我国北方的药用植物，其块根称为关白附，为常用中药之一，主治心痛血痹，具有祛风、燥湿、化痰、止痛的作用，民间用药疗效好。其化学成分主要由关附庚素（Guanfu base G,GFG）、关附甲素（Guanfu base A，GFA）、关附壬素（Guanfu base I，GFI）、关附辰素、关附己素、关附Z素等，为一系列母核为赫替（Hetisine）新型C20二萜类生物碱。其中关附甲素为首次发现的全新结构类型的安全、有效的广谱抗心率失常一类新药。然而现有技术中，提取关附甲素工艺复杂、有效成分损失大，提取得率较低，导致盐酸关附甲素成本较高，而且很大程度上浪费了中药材资源（关白附药材中，关附甲素的含量仅为0.2%-0.5%左右）。

[0003] 研究发现，关白附总碱中其他活性成分（如关附己素、关附Z素、关附庚素以及关附壬素等）也具有较强的抗心率失常活性，其中关附庚素活性较盐酸关附甲素强，对治疗房颤具有较好作用。而关附辛素（atisinium chloride），也是关白附中的主要生物碱类成分之一，为一种水溶性生物碱，能抑制骨骼肌系统和呼吸系统，对小鼠的LD50为9.0mg/kg,为高毒性成分，应加以控制。

[0004] 现有技术中关白附总生物碱的制备工艺，主要以有机溶剂提取后进行加酸-碱化-萃取的方法，并进一步包括常规精制工艺如过大孔树脂净化（如CN1709892A）或以亲脂性有机溶剂除杂（如CN1039198C）。上述工艺提取效率低，萃取步骤乳化严重，而且酸性条件下萃取，生物碱损失严重，大孔树脂吸附时，生物碱也会较大损失，也导致总生物碱得率比较低。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种从关白附中制备二萜类总生物碱的方法，该方法制备的总生物碱含量高，且毒性成分关附辛素含量低。

[0006] 本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

[0007] 一种制备关白附二萜类总生物碱的方法，该方法包括如下步骤：

[0008] 步骤1：取关白附药材以CO2为溶剂进行超临界萃取；

[0009] 步骤2：将步骤1得到的萃取物以酸水溶解，将酸水液进行碱化后以有机溶剂萃取；

[0010] 步骤3：将步骤2得到的有机溶剂萃取物以碱水洗涤，回收有机溶剂。

[0011] 进一步，步骤1关白附药材进行超临界萃取前进行粉碎，过60-100目筛。

[0012] 进一步，步骤1超临界萃取条件为：萃取压力为15-50MPa，萃取温度为30-70℃，超临界CO2流量为10-45kg/h,萃取时间为1-6小时，解析压力为4-11MPa，解析温度为45-60℃。

[0013] 进一步，步骤1超临界萃取过程中加入夹带剂，所述夹带剂选自甲醇、乙醇、丙酮中的一种或几种；更进一步的，所述夹带剂为甲醇、乙醇、丙酮中的任意两种组成的混合溶液；更进一步的，所述夹带剂为乙醇和丙酮组成的混合溶液。进一步的，所述夹带剂加入量为按质量比夹带剂：关白附药材=1:（1.5-20）；更进一步的，所述夹带剂加入量为按质量比夹带剂：关白附药材=1:（5-15）。

[0014] 进一步，步骤2加酸水至pH为1-3，所述酸水选自1-5%的盐酸、硫酸或醋酸溶液中的任意一种。

[0015] 进一步，步骤2酸水液碱化至pH为8-11，碱化所用的碱溶液选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、浓氨水或碳酸钠溶液中的任意一种。

[0016] 进一步，步骤2所述有机溶剂选自乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、正丁醇、甲醇、乙醇、乙醚、丙酮和醋酸甲酯中的一种或者其中几种的混合物。

[0017] 进一步，步骤3所述碱水pH为8-12，碱水选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、氨水或碳酸钠溶液中的任意一种。优选，步骤3所述碱水pH为9-12；更优选，步骤3所述碱水pH为10-12。

[0018] 进一步，步骤3回收有机溶剂后，干燥处理后即得关白附二萜类总生物碱[0019] 另外，本发明还提供了一种通过上述方法制备得到的关白附二萜类总生物碱。

[0020] 与现有技术相比，本发明采用CO2超临界萃取法对药材进行提取，提取物杂质少，溶液粘度低，再进行加酸-碱化-萃取处理，避免了萃取时乳化严重的问题，总生物碱含量高（达到50%以上）；另外，本发明萃取及洗涤过程可以将水溶性成分去除，尤其是毒性成分关附辛素，纯化后提取物中其含量小于1‰。

[0021] 效果实验例

[0022] 实验例1 CO2超临界萃取对提取物得率和总生物碱含量的影响

[0023] 1 实验方法

[0024] 1.1 样品制备

[0025] 实验组：取5kg关白附药材，按本发明实施例1方法制备总生物碱，得产物262g。

[0026] 对照组：取5kg关白附药材，粉碎，95%乙醇回流提取2次，回收溶剂，得到浸膏，以少量1%盐酸溶解，以浓氨水碱化pH为10，以氯仿萃取，回收溶剂，于80℃减压干燥，得关白附总生物碱185g。

[0027] 1.2 总生物碱含量测定

[0028] 1.2.1 对照品溶液制备：

[0029] 取盐酸关附甲素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.50mg的溶液，摇匀，即得。

[0030] 1.2.2 供试品溶液制备：

[0031] 取实验组总生物碱、对照组总生物碱细粉各20mg，精密称定，分别置10ml量瓶中，加甲醇超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

[0032] 1.2.3 测定方法：

[0033] 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，采用内标法进行测定，即得。

[0034] 2 实验结果

[0035] 结果见表1。

[0036] 表1 不同方法制备总生物碱得率和含量比较

[0037]  实验组 对照组
总生物碱得率 5.24% 3.70%
总生物碱含量 52% 39%

[0038] 结果表明，本发明采用CO2超临界提取关白附，相比于现有技术常规的有机溶剂提取，取得了显著的效果，产物得率为5.24%，总生物碱含量达到52%。

[0039] 实验例2 CO2超临界萃取过程夹带剂的选择

[0040] 1 实验方法

[0041] 取关白附药材3份，分别进行超临界二氧化碳萃取，萃取压力为16MPa，萃取温度为35℃，超临界CO2流量为40kg/h,萃取时间为5小时，解析压力为10MPa，解析温度为60℃，萃取过程中分别按表2加入夹带剂，夹带剂与萃取料比例为1:5，对照组不加入夹带剂。萃取后回收溶剂，得到浸膏，以少量1%盐酸溶解，以浓氨水碱化pH为10，以氯仿萃取，氯仿液以pH11的氨水洗涤，回收氯仿，于80℃减压干燥，得关白附总生物碱。

[0042] 计算各组总生物碱产率并按实验例1“2总生物碱含量测定”方法测定各组总生物碱含量。

[0043] 2 实验结果

[0044] 结果见表2。

[0045] 表2 不同夹带剂对总生物碱产率和含量的影响

[0046]夹带剂种类 总生物碱产率 总生物碱含量
无夹带剂 3.94% 41%
乙醇 5.46% 50%
乙醇+丙酮（1:1） 6.4% 60%

[0047] 结果表明，加入夹带剂能增加生物碱的溶解性，有效提高总生物碱产率和含量；另外，夹带剂种类也会对总生物碱产率产生影响，选择丙酮和乙醇混合作为夹带剂相比于单独使用乙醇，其总生物碱产率和含量更高。

[0048] 实验例3 碱水洗涤对关附辛素含量的影响

[0049] 1 实验方法

[0050] 1.1 样品制备

[0051] 实验组：取5kg关白附药材，按本发明实施例1方法制备关白附总生物碱。

[0052] 对照组：取5kg关白附药材，同实验组方法制备总生物碱，区别在于氯仿萃取后不经过氨水洗涤的步骤。

[0053] 1.2关附辛素含量测定

[0054] 1.2.1对照品溶液的制备：

[0055] 取关附辛素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.10mg的溶液，摇匀，即得。

[0056] 1.2.2供试品溶液的制备：

[0057] 分取实验组总生物碱1g、对照组总生物碱细粉0.01g，精密称定，分别置10ml量瓶中，加甲醇超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

[0058] 1.2.3色谱条件：

[0059] 采用Agela Durashell C18色谱柱，流动相为乙腈-水（含0.2%二乙胺）=55：45，流速0.8ml/min，柱温：30℃，检测波长：205nm

[0060] 2 实验结果

[0061] 结果见表3。

[0062] 表3 关附辛素含量比较

[0063]  实验组 对照组
关附辛素含量 0.069% 5.3%

[0064] 结果表明，本发明方法制备的总生物碱中毒性成分关附辛素含量大幅降低。

具体实施方式

[0065] 实施例1

[0066] 5kg关白附药材，粉碎，以超临界二氧化碳萃取，加入与药材比为1:10的甲醇作为夹带剂，萃取压力为16MPa，萃取温度为35℃，超临界CO2流量为40kg/h,萃取时间为5小时，解析压力为10MPa，解析温度为60℃。回收溶剂，得到浸膏，以10L1%盐酸溶解，以浓氨水碱化pH为10，以氯仿萃取4次，每次6L，合并氯仿层，以5L pH11的氨水洗涤6次,回收氯仿，于80℃减压干燥，得到关白附总生物碱262g，总生物碱（以关附甲素计）含量52%。

[0067] 实施例2

[0068] 称取3kg关白附药材，粉碎，置于萃取釜中，二氧化碳超临界萃取，加入与药材比为1:1.5的丙酮作为夹带剂，萃取压力为50MPa，萃取温度为30℃，超临界CO2流量为30kg/h,萃取时间为4小时，解析压力为8MPa，解析温度为50℃。回收溶剂，得到浸膏，以6L1%盐酸溶解，以碳酸钠碱化pH为10，以3L乙酸乙酯萃取5次，合并乙酸乙酯层，以30L pH12的碳酸钠水溶液洗涤2次，回收乙酸乙酯，于80℃减压干燥，得到关白附总生物碱168g，总生物碱（以关附甲素计）含量57%。

[0069] 实施例3

[0070] 将6.5kg关白附药材粉碎，萃取釜内超临界二氧化碳萃取，加入与药材比为1:20的乙醇作为夹带剂，萃取压力为25MPa，萃取温度为70℃，超临界CO2流量为45kg/h,萃取时间为6小时，解析压力为11MPa，解析温度为45℃。回收溶剂，得到浸膏，以6.5L3%盐酸溶解，以氢氧化钠碱化pH为10，以13L二氯甲烷和甲醇（3:1）混合溶剂萃取3次，合并有机层，以8LpH9的氢氧化钠水溶液洗涤3次，回收有机层，于80℃减压干燥，得到关白附总生物碱355g，总生物碱（以关附甲素计）含量50%。

[0071] 实施例4

[0072] 将700g关白附药材粉碎，萃取釜内超临界二氧化碳萃取，加入与药材比为1:15的乙醇和丙酮（1:1）混合溶剂作为夹带剂，萃取压力为30MPa，萃取温度为60℃，超临界CO2流量为10kg/h,萃取时间为1小时，解析压力为4MPa，解析温度为45℃。回收溶剂，得到浸膏，以900ml1%盐酸溶解，以氢氧化钾碱化pH为10，以2L正丁醇萃取2次，合并有机层，以800mlpH9的氢氧化钠水溶液洗涤2次，回收有机层，于80℃减压干燥，得到关白附总生物碱45g，总生