一种增强多糖蛋白结合物免疫原性的方法转让专利
申请号 : CN201410198533.5
文献号 : CN104069504B
文献日 : 2019-09-24
发明人 : 李建平
申请人 : 江苏康泰生物医学技术有限公司
摘要 :
本发明公开了一种增强多糖蛋白结合物免疫原性的方法，通过在蛋白载体中加入万能表位肽，并采用基因重组工程菌来生产含有万能表位肽的蛋白载体；然后将多糖通过共价键连接至所述含有万能表位肽的蛋白载体上形成多糖蛋白结合物；采用这种方法获得的多糖蛋白结合物与不含有万能表位肽的对应蛋白载体获得的多糖蛋白结合物相比较，其免疫原性比对照提高了3‑5倍。
权利要求 :
1.一种增强多糖蛋白结合物免疫原性的方法，其特征在于：
a)在蛋白载体中加入万能表位肽，通过基因重组工程菌来生产含有万能表位肽的蛋白载体；
b)多糖通过共价键连接至所述含有万能表位肽的蛋白载体上形成多糖蛋白结合物，在所述含有万能表位肽的蛋白载体中含有X个万能表位肽，X大于等于1，小于等于3，在含有万能表位肽的蛋白载体中，万能表位肽是连结在蛋白载体的N-末端或C-末端，或者同时连接在N-末端和C-末端，所述万能表位肽与指定蛋白载体的N-末端、或C-末端的之间是通过GSGSG氨基酸序列进行连接；所述万能表位肽为QYIKANSKFIGITEL或FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE，或ISQAVHAAHAEINEAGR，或者是这三种万能表位肽的组合，所述蛋白载体为白喉毒素变异体CRM197蛋白的A链，或轮状病毒表面蛋白核VP8，或白喉毒素变异体H21G蛋白的A链，所述基因重组工程菌是通过基因重组方法构建的大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的增强多糖蛋白结合物免疫原性的方法，其特征在于：所述多糖是通过培养肺炎球菌、流行性嗜血杆菌b型或流行性脑膜炎球菌而获得的荚膜多糖。
3.根据权利要求1所述的增强多糖蛋白结合物免疫原性的方法，其特征在于：所述多糖通过共价键连接至含有万能表位肽的蛋白载体的连接方法是还原胺法、己二酰二肼法或1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐法。
说明书 :
一种增强多糖蛋白结合物免疫原性的方法
技术领域：
[0001] 本发明涉及一种能够增强多糖蛋白结合物免疫原性的方法。背景技术：
[0002] 当多糖以共价键连接至蛋白载体上时，能将半抗原的多糖转变成全抗原，使得多糖的免疫原性得到增强。以此方法合成的多糖‐蛋白结合疫苗已被广泛地应用于小儿，成功地预防了包括肺炎球菌，流行性脑膜炎球菌以及流行性嗜血杆菌b型等细菌的感染。
[0003] 用于合成多糖蛋白结合物的蛋白载体有多种，如破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉毒素变异体CRM197，以及基因重组技术生产的流行性嗜血杆菌表面蛋白D等；但是，由于不同蛋白的免疫特性，以不同蛋白载体合成的多糖蛋白结合物的免疫原性有差异，动物体免疫后，对于由不同蛋白载体与同一种多糖合成形成的多糖蛋白结合物，所显现的多糖免疫原性也不同。由此可见，采用不同技术生产的蛋白载体，合成出来的多糖蛋白结合疫苗的免疫原性有差异。
[0004] 进入动物机体内后，抗原经抗原处理细胞(Antigen Process Cell，APC)处理后产生表位肽(epitope)[1]，在和主要组织相容性复合物(Major Histocompatibility Complex，MHC)分子结合后，进而呈现在APC细胞表面，能够被T淋巴细胞识别，这是免疫学通过实验已经得出的结论。现在知道，一个已知表位肽的免疫原性取决于三个因素：
[0005] 第一、适当表位肽的产生；
[0006] 第二、和表位肽结合的主要组织相容性复合物分子的呈现；
[0007] 第三、识别表位肽与主要组织相容性复合物形成的结合物的T细胞的呈现。
[0008] 其中，任何一个环节的缺少都将导致免疫应答缺失。
[0009] 用小鼠进行的试验表明，缺乏适当的表位肽与主要组织相容性复合物形成的结合物分子是最常导致动物体免疫响应缺失的原因。主要组织相容性复合物具有高度的多形态性，已知的表位肽仅通过一个或者几个等位基因(Alleles)就可结合至主要组织相容性复合物，而不是全部表位肽片段。另外，有实验结果显示，由于抗原处理不适当，或者T细胞耐受性空缺，也会导致免疫响应的缺失。
[0010] 有实验表明，破伤风毒素的三个表位肽中的两个，即QYIKANSKFIGITEL表位肽(称为P2)和FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE表位肽(称为P30)，以及ISQAVHAAHAEINEAGR表位肽(称为OVAp)[2]，可和大量不同的主要组织相容性复合物Class II结合，显示其能够被T细胞识别，具有万能免疫原性的特性，被称之万能表位肽。
[0011] 万能免疫原性表位肽具有和多个人类主要组织相容性抗原复合物Class II分子的同型和异型体结合。这种万能表位肽和人类主要组织相容性抗原复合物Class II分子随机的结合可用于开发合成疫苗，因为其能够激活人群中的大部分个体的获得性免疫系统的应答。
[0012] 研究表明 ，P2表位肽由破伤风毒素的830‐844氨基酸序列组成(QYIKANSKFIGITEL)，P30表位肽由破伤风毒素的947‐967氨基酸序列组成
(FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE)，OVAp表位肽是由卵清蛋白的323‐339氨基酸序列组成(ISQAVHAAHAEINEAGR)。在含有这些表位肽的蛋白进入机体后，蛋白将被摄入至APC细胞内，被消化降解，但是这些表位肽将保存完整，在和主要组织相容性复合物结合后，被呈现在APC细胞表面，并被T细胞识别，这表明万能表位肽以相同的方式和多种DR分子作用。
(FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE)，OVAp表位肽是由卵清蛋白的323‐339氨基酸序列组成(ISQAVHAAHAEINEAGR)。在含有这些表位肽的蛋白进入机体后，蛋白将被摄入至APC细胞内，被消化降解，但是这些表位肽将保存完整，在和主要组织相容性复合物结合后，被呈现在APC细胞表面，并被T细胞识别，这表明万能表位肽以相同的方式和多种DR分子作用。
[0013] MHC分子是加工后抗原的杂性受体，其功能是在胸腺中的免疫耐受诱导和周边免疫响应外来抗原的过程中，来呈现其抗原中的表位肽。因此，MHC分子必须在呈现大量的表位肽(容许更好的抗原识别，但更多的消耗T细胞储备)，和少许表位肽(大量的T细胞储备，但是少许有效地呈现外来抗原)中达到平衡。也就是说，如果抗原中含有在APC细胞处理后能够保存完整性、并具有代表性的少量表位肽，在和MHC结合后，就能够刺激一定量的T细胞，来建立免疫记忆效应，而这一过程不会消耗过量的T细胞造成免疫耐受，含有这种表位肽的抗原具有更强的免疫原性，这也就解释了为什么破伤风类毒素具有很强的免疫原性的原因。
[0014] 现发现的大部分T细胞的刺激表位肽对于不同MHC Class II单体(haplotype)作用有限，不同动物保存和呈现不同的抗原多肽区域(epitopes)来刺激其T细胞。这种T细胞刺激活性的基因限制严重地阻碍了以合成方法来开发疫苗，而这种方法对于基因上不同的人群的应用，应该是非常有效的方法。那些被发现具有刺激多重小鼠个体和/或与大多数人体MHC Class II分子相关联的T细胞刺激表位肽，提供了一个设计万能活化T细胞的有效途径。在普通的蛋白抗原中加入万能表位肽(也称为万能T细胞抗原簇)，如P2、P30或OVAp等，能够被大多数动物的MHC Class II分子识别。这种T细胞抗原簇能够用于直接诱导T细胞，或提供帮助B细胞生产针对于弱免疫原的抗体，增强获得性免疫应答的效应。
[0015] 致病性细菌通常能够表达高分子量、包裹在细菌表面的荚膜多糖，简称多糖。对于成人来说，荚膜多糖是具有很好的免疫原性抗原，可用于制备疫苗；但是，对于小儿，即2岁以下的婴幼儿，荚膜多糖被认为是非依赖于T细胞抗原。实验显示，当用作抗原时，荚膜多糖可诱导野株或者T细胞缺失小鼠生产多糖特异性IgM抗体的响应；但是，并不诱导IgM抗体向IgG抗体的转化。人体实验也显示，作为疫苗，多糖可以诱导成人生产保护性抗体，但无法诱导婴幼儿的免疫应答；也就是说，在小儿重复免疫荚膜多糖抗原后，无第二次抗体增强响应，也无法诱导持续的T细胞记忆。
[0016] 现代免疫学实验证实，多糖蛋白结合疫苗和纯多糖疫苗比较的优势在于，前者能够诱导免疫响应。当非依赖T细胞的荚膜多糖共价键地连接至载体蛋白而产生的多糖蛋白结合物，在免疫了哺乳动物后，可诱导T细胞来帮助B细胞产生针对于结合物中的多糖部分的IgG抗体。因此，多糖蛋白结合物诱导多糖特异性抗体IgM转化为IgG，记忆B细胞的分化，以及长期存在的T细胞记忆。
[0017] 多糖结合疫苗在预防严重的传染病中，比如，流行性嗜血杆菌b型，肺炎球菌，以及流行性脑膜炎球菌，发挥了巨大的作用。不过，这些多糖蛋白结合疫苗的免疫原性变异性较大，这种变异性除了是由于特定多糖结构的差异性的结果外，不同免疫原性蛋白载体的使用，也是导致多糖蛋白结合物的免疫原差异主要原因。在某些高危人群中，比如小儿、老年人或免疫功能低下人，低免疫原性的多糖蛋白质结合疫苗的免疫效果不佳，保护性受到限制。因此，开发出免疫原性更强的多糖蛋白结合疫苗，仍然是该领域努力的方向。
[0018] 本发明用基因重组技术生产的含有万能表位肽蛋白载体，在多糖蛋白质结合物中引入万能表位肽。在这种结合物进入动物体后，经过抗原呈递细胞(APC)吞噬消化降解后，其万能表位肽和部分多糖重复单位，和主要组织相容性复合物Class II结合，可有效地刺激T细胞，进而增强结合物中多糖的免疫原性，导致针对细菌荚膜多糖的抗体浓度增加。
发明内容
[0019] 本发明的目的是提供一种增强多糖蛋白结合物免疫原性的方法，通过在蛋白载体中加入万能表位肽，采用基因重组工程菌来生产含有万能表位肽的蛋白载体；然后将多糖通过共价键连接至所述含有万能表位肽的蛋白载体上形成多糖蛋白结合物；这种多糖蛋白结合物与不含有万能表位肽的对应蛋白载体形成的多糖蛋白结合物相比较，其免疫原性比对照提高了3‐5倍。
[0020] 本发明采取的技术方案如下：
[0021] 一种增强多糖蛋白结合物免疫原性的方法，其特征在于：
[0022] a)在蛋白载体中加入万能表位肽，通过基因重组工程菌来生产含有万能表位肽的蛋白载体；
[0023] b)多糖通过共价键连接至所述含有万能表位肽的蛋白载体上形成多糖蛋白结合物；
[0024] 进一步，在所述含有万能表位肽的蛋白载体中含有X个万能表位肽，X大于等于1。
[0025] 进一步，在含有万能表位肽的蛋白载体中，万能表位肽是连接在蛋白的N‐末端或C‐末端，或者同时连接在N‐末端和C‐末端。
[0026] 进一步，所述万能表位肽与指定蛋白的N‐末端或C‐末端之间通过GSGSG氨基酸序列进行连接。
[0027] 进一步，所述万能表位肽为QYIKANSKFIGITEL(简称P2)或FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(简称P30)，或ISQAVHAAHAEINEAGR(简称OVAp)，或者是这三种万能表位肽的组合。
[0028] 进一步，所述蛋白载体为白喉毒素变异体CRM197的A链(简称CRM197A)，或轮状病毒表面蛋白核VP8(简称CoreVP8)，或白喉毒素变异体H21G的A链(简称H21G)。
[0029] 进一步，所述基因重组工程菌是通过基因重组方法构建的大肠杆菌。
[0030] 进一步，所述多糖是通过培养肺炎球菌、流行性嗜血杆菌b型或流行性脑膜炎球菌而获得的荚膜多糖。
[0031] 进一步，所述多糖通过共价键连接至含有万能表位肽的蛋白载体的连接方法是还原胺法、己二酰二肼法(ADH法)或1‐(3‐二甲基氨基丙基)‐3‐乙基碳化二亚胺盐酸盐法(CDAP法)。
具体实施方式
[0032] 下面举例说明本发明的具体实施方法，但不仅局限于以下实例。
[0033] 实施例1：含有万能表位肽的CRM197A蛋白载体结合物的合成及免疫原性的评估[0034] 一、CRM197A蛋白载体和含有万能表位肽的CRM197A蛋白载体氨基酸序列的设计[0035] 1、CRM197A蛋白载体氨基酸序列的设计
[0036] 白喉毒素是由带有白喉毒素基因的β噬菌体在白喉杆菌内表达，在细菌胞浆中存在形式为多肽，由560个氨基酸组成，分子量为62,000道尔顿。其氨基酸序列如下：
[0037] MSRKLFASILIGALLGIGAPPSAHAGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS
[0038] 当分泌至细菌体外前，多肽N‐末端的25个引导氨基酸序列被切除掉，变成了由535个氨基酸组成，分子量为58kD的单链多肽而分泌至细菌体外，其氨基酸序列如下：
[0039] GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS
[0040] 分泌至细菌体外的白喉毒素被酶切为A链和B链，其间由一个二硫键连接而形成一个蛋白分子。这两个多肽链具有不同的功能，A链为白喉毒素蛋白分子的N‐末端片段，分子量为21kD，由193个氨基酸组成。是白喉毒素的毒性功能部分，它在真核生物细胞浆内通过将二磷酸三腺苷核糖(ADP‐Ribosyl)的异柠檬酸脱氢酶(NAD+)部分转移至延伸因子2(Elongation Factor‐2，EF‐2)上，从而抑制细胞中的蛋白质合成，进而抑制细胞生长，造成细胞伤亡。B链为白喉毒素蛋白分子的C‐末端片段，分子量大约为37kD，由342个氨基酸组成。B链的功能是识别敏感细胞表面的特异性受体，将白喉毒素吸附在敏感细胞上，帮助A链进入细胞内。
[0041] 白喉毒素的A链具有良好的水溶性，其氨基酸序列如下：
[0042] GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
[0043] 研究发现[3]，由于β噬菌体上的毒素基因tox的突变，对于噬菌体的复制没有影响；但是，合成出来的毒素的毒性可能消失，或大大地降低，而形成白喉毒素突变体(Cross Reacting Material，CRM)，而白喉毒素突变体的血清学免疫原性仍然和毒素相关联。白喉毒素突变体CRM197无白喉毒素的毒性，从氨基酸序列分析来看是由于A链中的第52位氨基酸，由甘氨酸(Gly)突变成谷氨酸(Glu)，其氨基酸序列如下：
[0044] GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
[0045] 试验研究表明，与其它现在市场上用于肺炎球菌结合疫苗合成的蛋白载体比较，白喉毒素变异体CRM197蛋白A链多肽具备以下优势：其免疫原性和白喉毒素及白喉内毒素相关联，分子量小，水溶性高，易于生产和进行大分子合成反应。长期的白喉类毒素疫苗的临床使用，已经证明其安全性和有效性。
[0046] 将基因重组表达的CRM197A蛋白作为多糖蛋白结合物合成用的蛋白载体，将其以共价键形式连接至肺炎球菌荚膜多糖、或流行性嗜血杆菌b型荚膜多糖、或流行性脑膜炎球菌荚膜多糖上，制备出肺炎球菌多糖CRM197A蛋白结合物、流行性嗜血杆菌多糖CRM197A蛋白结合物以及流行性脑膜炎荚膜多糖CRM197A蛋白结合物，并制备成疫苗制剂，用作对照样品，与带有万能表位肽的CRM197A蛋白载体合成的相应多糖蛋白结合物进行免疫原性比较。
[0047] 2、带有万能表位肽的CRM197A蛋白载体氨基酸序列的设计
[0048] 将万能表位肽连接至CRM197A蛋白载体上，构建出一种新的用于合成多糖蛋白质结合物的蛋白载体。所用的万能表位肽P2、或P30、或OVAp可分别连接至CRM197A蛋白载体的N‐末端或C‐末端；也可将两个不同的万能表位肽分别连接至CRM197A蛋白载体的N‐末端或C‐末端；另一种方式是将两个万能表位肽自身连接，然后再连接至CRM197A蛋白载体N‐末端或者C‐末端；还有一种方式是将一个万能表位肽连接至C‐末端或者N‐末端，两个自身连接的万能表位肽连接至另一端。
[0049] 2‐1、含有万能表位肽P2的CRM197A蛋白载体氨基酸序列的设计
[0050] 2‐1‐1、P2‐N‐末端CRM197A蛋白载体(称为P2CRM197A)氨基酸序列的设计[0051] 通过将P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL加入至CRM197A蛋白载体的N‐末端，形成一个新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0052] QYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
[0053] 在P2氨基酸序列和CRM197A蛋白载体的N‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P2CRM197A蛋白载体。
[0054] 2‐1‐2、CRM197A C‐末端‐P2蛋白载体(称为CRM197AP2)氨基酸序列的设计[0055] 通过将P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL加入至CRM197A蛋白载体的C‐末端，形成另一种新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0056] MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKANSKFIGITEL
[0057] 在P2氨基酸序列和CRM197A蛋白载体的C‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为CRM197AP2蛋白载体。
[0058] 2‐1‐3、P2‐N‐末端CRM197A C‐末端‐P2蛋白载体(称为P2CRM197AP2)氨基酸序列的设计
[0059] 通过将两个P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL分别加入至CRM197A蛋白载体的N‐末端和C‐末端，形成一种新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0060] QYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKANSKFIGITEL
[0061] 在P2氨基酸序列和CRM197A蛋白载体的N‐末端和C‐末端之间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P2CRM197AP2蛋白载体。
[0062] 2‐1‐4、P2P2‐N‐末端CRM197A蛋白载体(称为P2P2CRM197A)氨基酸序列的设计[0063] 通过将两个P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL自身连接，然后再加入至CRM197A蛋白载体的N‐末端，形成一种新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0064] QYIKANSKFIGITELGSGSGQYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
[0065] 在两个自身连接的P2氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白载体的N‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P2P2CRM197A蛋白载体。
[0066] 2‐1‐5、CRM197A C‐末端‐P2P2蛋白载体(称为CRM197AP2P2)氨基酸序列的设计[0067] 通过将两个P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL自身连接，然后再加入至CRM197A蛋白载体的C‐末端，形成一种新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0068] GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKANSKFIGITELGSGSGQYIKANSKFIGITEL
[0069] 在两个自身连接P2氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白载体的C‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为CRM197AP2P2蛋白载体。
[0070] 2‐1‐6、P2P2‐N‐末端CRM197A C‐末端‐P2蛋白载体(称为P2P2CRM197AP2)氨基酸序列的设计
[0071] 通过将两个P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL自身连接，然后再加入至CRM197A蛋白载体的N‐末端；另外，将一个P2加入至CRM197A蛋白载体的C‐末端，形成另一种新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0072] QYIKANSKFIGITELGSGSGQYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKANSKFIGITEL
[0073] 在两个自身连接P2氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白的C‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P2P2CRM197AP2蛋白载体。
[0074] 2‐1‐7、P2‐N‐末端CRM197A C‐末端‐P2P2蛋白载体(称为P2CRM197AP2P2)氨基酸序列的设计
[0075] 通过将一个P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL连接至CRM197A蛋白载体的N‐末端；另外，将两个P2进行自身连接，然后再加入至CRM197A蛋白载体的C‐末端，形成另一种新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0076] QYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKANSKFIGITELGSGSGQYIKANSKFIGITEL
[0077] 在两个自身连接P2氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白载体的C‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P2CRM197AP2P2蛋白载体。
[0078] 2‐2、含有万能表位肽P30的CRM197A蛋白载体氨基酸序列的设计
[0079] 2‐2‐1、P30‐N‐末端CRM197A蛋白载体(称为P30CRM197A)氨基酸序列的设计[0080] 通过将P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE加入至CRM197A蛋白载体N‐末端，形成一个新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0081] FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR[0082] 在P30氨基酸序列和CRM197A蛋白载体的N‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P30CRM197A蛋白载体。
[0083] 2‐2‐2、CRM197A C‐末端‐P30蛋白载体(称为CRM197AP30)氨基酸序列的设计[0084] 通过将P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE加入至CRM197A蛋白的C‐末端，形成另一种新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0085] MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE[0086] 在P30氨基酸序列和CRM197A蛋白载体的C‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为CRM197AP30蛋白载体。
[0087] 2‐2‐3、P30‐N‐末端CRM197A C‐末端‐P30蛋白载体(称为P30CRM197AP30)氨基酸序列的设计
[0088] 通过将两个P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE分别连接至CRM197A蛋白载体的N‐末端和C‐末端，形成另一种新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0089] FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
[0090] 在两个P30氨基酸序列和CRM197A蛋白载体的N‐末端和C‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P30CRM197AP30蛋白载体。
[0091] 2‐2‐4、P30P30‐N‐末端CRM197A蛋白载体(称为P30P30CRM197A)氨基酸序列的设计[0092] 通过将两个P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE自身连接，然后再加入至CRM197A蛋白载体的N‐末端，形成一种新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0093] FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
[0094] 在两个自身连接P30氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白载体的N‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P30P30CRM197A蛋白载体。
[0095] 2‐2‐5、CRM197A C‐末端‐P30P30蛋白载体(称为CRM197AP30P30)氨基酸序列的设计
[0096] 通过将两个P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE自身连接，然后再加入至CRM197A蛋白载体的C‐末端，形成一种新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0097] GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
[0098] 在两个自身连接P30氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白载体的C‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为CRM197AP30P30蛋白载体。
[0099] 2‐2‐6、P30P30‐N‐末端CRM197A C‐末端‐P30蛋白载体(称为P30P30CRM197AP30)氨基酸序列的设计
[0100] 通过将两个P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE自身连接，然后再加入至CRM197A蛋白载体的N‐末端；另外，将一个P30加入至CRM197A蛋白载体的C‐末端，形成另一种新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0101] FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
[0102] 在两个自身连接P30氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白载体的C‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P30P30CRM197AP30蛋白载体。
[0103] 2‐2‐7、P30‐N‐末端CRM197A C‐末端‐P30P30蛋白载体(称为P30CRM197A P30P30)氨基酸序列的设计
[0104] 通过将一个P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE连接至CRM197A蛋白载体的N‐末端；另外，将两个P30进行自身连接，然后再加入至CRM197A蛋白载体的C‐末端，形成另一种新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0105] FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
[0106] 在两个自身连接P30氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白载体的C‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P30CRM197AP30P30蛋白载体。
[0107] 2‐3、含有万能表位肽OVAp的CRM197A蛋白载体氨基酸序列的设计
[0108] 2‐3‐1、OVAp‐N‐末端CRM197A蛋白载体(称为OVApCRM197A)氨基酸序列的设计[0109] 通过将OVAp氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR加入至CRM197A蛋白载体N‐末端，形成一个新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0110] ISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR[0111] 在OVAp氨基酸序列和CRM197A蛋白载体的N‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为OVApCRM197A蛋白载体。
[0112] 2‐3‐2、CRM197A C‐末端‐OVAp蛋白载体(称为CRM197AOVAp)氨基酸序列的设计[0113] 通过将OVAp氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR加入至CRM197A蛋白载体的C‐末端，形成另一种新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0114] MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGR[0115] 在OVAp氨基酸序列和CRM197A蛋白载体的C‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为CRM197AOVAp蛋白载体。
[0116] 2‐3‐3、OVAp‐N‐末端CRM197A C‐末端‐OVAp蛋白载体(称为OVApCRM197AOVAp)氨基酸序列的设计
[0117] 通过将两个OVAp氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR分别连接至CRM197A蛋白载体的N‐末端和C‐末端，形成另一种新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0118] ISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGR
[0119] 在两个OVAp氨基酸序列和CRM197A蛋白载体的C‐末端之间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为OVApCRM197AOVAp蛋白载体。
[0120] 2‐3‐4、OVApOVAp‐N‐末端CRM197A蛋白载体(称为OVApOVApCRM197A)氨基酸序列的设计
[0121] 通过将两个OVAp氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR自身连接，然后再加入至CRM197A蛋白载体的N‐末端，形成一种新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0122] ISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
[0123] 在两个自身连接OVAp氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白载体的N‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为OVApOVApCRM197A蛋白载体。
[0124] 2‐3‐5、CRM197A C‐末端‐OVApOVAp蛋白载体(称为CRM197AOVApOVAp)氨基酸序列的设计
[0125] 通过将两个OVAp氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR自身连接，然后再加入至CRM197A蛋白载体的C‐末端，形成一种新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0126] GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGR
[0127] 在两个自身连接OVAp氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白载体的C‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为CRM197AOVApOVAp蛋白载体。
[0128] 2‐3‐6、OVApOVAp‐N‐末端CRM197A C‐末端‐OVAp蛋白载体(称为OVApOVApCRM197AOVAp)氨基酸序列的设计
[0129] 通过将两个OVAp氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR自身连接，然后再加入至CRM197A蛋白载体的N‐末端；另外，将一个OVAp加入至CRM197A蛋白载体的C‐末端，形成另一种新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0130] ISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGR
[0131] 在两个自身连接OVAp氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白载体的C‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为OVApOVApCRM197AOVAp蛋白载体。
[0132] 2‐3‐7、OVAp‐N‐末端CRM197A C‐末端‐OVApOVAp蛋白载体(称为OVApCRM197AOVApOVAp)氨基酸序列的设计
[0133] 通过将一个OVAp氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR连接至CRM197A蛋白的N‐末端；另外，将两个OVAp进行自身连接，然后再加入至CRM197A蛋白载体的C‐末端，形成另一种新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0134] ISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGR
[0135] 在两个自身连接OVAp氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白的C‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为OVApCRM197AOVApOVAp蛋白载体。
[0136] 2‐4、含有两个以上不同万能表位肽的CRM197A蛋白载体氨基酸序列的设计[0137] 将三种万能表位肽P2，P30和OVAp分别连接至CRM197A蛋白载体中，设计出一种新的蛋白载体。
[0138] 2‐4‐1、P2‐N‐末端CRM197A C‐末端‐P30蛋白载体(称为P2CRM197AP30)氨基酸序列的设计
[0139] 通过将P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL和P30氨基酸序列
[0140] FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE分别加入至CRM197A蛋白N‐末端和C‐末端，形成一个新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0141] QYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
[0142] 在P2和P30氨基酸序列和CRM197A蛋白的N‐末端和C‐末端间分别插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P2CRM197AP30蛋白载体。
[0143] 2‐4‐2、P30‐N‐末端CRM197A C‐末端‐P2蛋白载体(称为P30CRM197AP2)氨基酸序列的设计
[0144] 通过将P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE和P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL分别加入至CRM197A蛋白载体N‐末端和C‐末端，形成一个新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0145] FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKANSKFIGITEL
[0146] 在P30和P2氨基酸序列和CRM197A蛋白的N‐末端和C‐末端间分别插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P30CRM197AP2蛋白载体。
[0147] 2‐4‐3、P2P30‐N‐末端CRM197A C‐末端‐P2蛋白载体(称为P2P30CRM197AP2)氨基酸序列的设计
[0148] 通过将P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL和P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE连接，然后加入至CRM197A蛋白载体的N‐末端；将P2加入至CRM197A蛋白载体C‐末端，形成一个新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0149] QYIKANSKFIGITELGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKANSKFIGITEL
[0150] 在P2和P30氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白载体的N‐末端和C‐末端间分别插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P2P30CRM197AP2蛋白载体。
[0151] 2‐4‐4、P2P30‐N‐末端CRM197A C‐末端‐OVAp蛋白载体(称为P2P30CRM197AOVAp)氨基酸序列的设计
[0152] 通过将P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL和P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE连接，然后加入至CRM197A蛋白的N‐末端；将OVAp氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR加入至CRM197A蛋白C‐末端，形成一个新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0153] QYIKANSKFIGITELGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGR
[0154] 在P2和P30氨基酸序列之间，CRM197A蛋白载体的N‐末端和C‐末端间，以及OVAp和CRM197A蛋白载体的N‐末端之间分别插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P2P30CRM197AOVAp蛋白载体。
[0155] 二、CRM197A蛋白载体和含有万能表位肽的CRM197A蛋白载体表达质粒的构建[0156] 1、CRM197A蛋白载体表达质粒的构建
[0157] 从GenBank获取CRM197蛋白完整氨基酸序列PRF:224021，确定CRM197蛋白的A链片段，CRM197的氨基酸1‐193为CRM197的A链片段。以此为依据，对该片段的氨基酸的核酸序列进行优化，以便在大肠杆菌表达系统中高效表达。采用自制的表达质粒，用Nde I酶识别质粒位点CATATG，Bam HI酶识别位点GGATCC。对CRM197A的基因序列进行分析，在序列内，无Nde I及Bam HI酶切位点。CRM197A蛋白基因合成序列如下：
[0158] CATATG
[0159] GGTGCGGACG ACGTTGTGGA CTCCTCAAAA TCGTTTGTCA TGGAAAACTT CAGCTCTTAT[0160] CATGGCACCA AACCGGGTTA CGTGGACTCC ATTCAGAAGG GCATCCAAAA ACCGAAGTCA[0161] GGCACCCAGG GTAACTACGA TGACGATTGG AAGGAATTCT ACAGCACGGA CAATAAGTAT[0162] GATGCGGCCG GCTACTCTGT TGACAACGAA AATCCGCTGA GTGGTAAAGC AGGCGGTGTG[0163] GTTAAGGTCA CCTATCCGGG TCTGACGAAA GTTCTGGCGC TGAAGGTCGA TAACGCCGAA[0164] ACCATTAAAA AGGAACTGGG CCTGTCTCTG ACCGAACCGC TGATGGAACA AGTGGGTACG[0165] GAAGAATTTA TCAAACGTTT CGGCGATGGT GCATCGCGTG TCGTGCTGAG CCTGCCGTTT[0166] GCTGAAGGCA GTTCCTCAGT GGAATACATT AACAATTGGG AACAAGCAAA AGCTCTGTCA[0167] GTTGAACTGG AAATCAATTT CGAAACGCGT GGCAAACGCG GTCAAGATGC TATGTATGAA[0168] TATATGGCTC AGGCGTGTGC GGGCAATCGC GTCCGTCGCT AA
[0169] GGATCC
[0170] 将空白质粒和合成的CRM197A蛋白基因的PCR产物中，分别加入Nde I酶和Bam HI酶进行双酶切反应；纯化后，在连接体系中加入T4连接酶进行连接，完成后纯化表达质粒，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化至细胞内，筛选克隆。获得阳性表达工程菌后，建立种子库，包括主种子和工作种子。储存于‐20℃以下冰箱中。
[0171] 2、含有万能表位肽的CRM197A蛋白载体表达质粒的构建
[0172] 2‐1、P2CRM197A蛋白载体表达质粒的构建
[0173] 采用自制的空白表达质粒，用Nde I酶识别质粒位点CATATG，Bam HI酶识别位点GGATCC。经过P2CRM197A蛋白载体基因序列进行分析，在序列内，无Nde I及Bam HI酶切位点。P2CRM197A基因合成全序列如下：
[0174] CATATG
[0175] CAATACATCA AGGCGAACAG CAAATTCATC GGCATCACGG AACTGGGCTC GGGCTCTGGC[0176] GTGCGGACG ACGTTGTGGA CTCCTCAAAA TCGTTTGTCA TGGAAAACTT CAGCTCTTAT[0177] ATGGCACCA AACCGGGTTA CGTGGACTCC ATTCAGAAGG GCATCCAAAA ACCGAAGTCA[0178] GGCACCCAGG GTAACTACGA TGACGATTGG AAGGAATTCT ACAGCACGGA CAATAAGTAT[0179] GATGCGGCCG GCTACTCTGT TGACAACGAA AATCCGCTGA GTGGTAAAGC AGGCGGTGTG[0180] GTTAAGGTCA CCTATCCGGG TCTGACGAAA GTTCTGGCGC TGAAGGTCGA TAACGCCGAA[0181] ACCATTAAAA AGGAACTGGG CCTGTCTCTG ACCGAACCGC TGATGGAACA AGTGGGTACG[0182] GAAGAATTTA TCAAACGTTT CGGCGATGGT GCATCGCGTG TCGTGCTGAG CCTGCCGTTT[0183] GCTGAAGGCA GTTCCTCAGT GGAATACATT AACAATTGGG AACAAGCAAA AGCTCTGTCA[0184] GTTGAACTGG AAATCAATTT CGAAACGCGT GGCAAACGCG GTCAAGATGC TATGTATGAA[0185] TATATGGCTC AGGCGTGTGC GGGCAATCGC GTCCGTCGCT AA
[0186] GGATCC
[0187] 将空白质粒和合成的P2CRM197A蛋白基因的PCR产物中，分别加入Nde I酶和Bam HI酶进行双酶切反应；纯化后，在连接体系中加入T4连接酶进行连接，完成后纯化表达质粒，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化至细胞内，筛选克隆，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。获得阳性表达工程菌后，建立种子库，包括主种子和工作种子。储存于‐20℃以下冰箱中。
[0188] 2‐2、P2CRM197AP2蛋白载体表达质粒的构建
[0189] 采用自制的表达质粒，用Nde I酶识别质粒位点CATATG，Bam HI酶识别位点GGATCC。经过P2CRM197AP2蛋白基因序列进行分析，在序列内，无Nde I及Bam HI酶切位点。P2CRM197AP2基因合成全序列如下：
[0190] CATATG
[0191] CAATACATCA AGGCGAACAG CAAATTCATC GGCATCACGG AACTGGGCTC GGGCTCTGGC[0192] GTGCGGACG ACGTTGTGGA CTCCTCAAAA TCGTTTGTCA TGGAAAACTT CAGCTCTTAT[0193] ATGGCACCA AACCGGGTTA CGTGGACTCC ATTCAGAAGG GCATCCAAAA ACCGAAGTCA[0194] GGCACCCAGG GTAACTACGA TGACGATTGG AAGGAATTCT ACAGCACGGA CAATAAGTAT[0195] GATGCGGCCG GCTACTCTGT TGACAACGAA AATCCGCTGA GTGGTAAAGC AGGCGGTGTG[0196] GTTAAGGTCA CCTATCCGGG TCTGACGAAA GTTCTGGCGC TGAAGGTCGA TAACGCCGAA[0197] ACCATTAAAA AGGAACTGGG CCTGTCTCTG ACCGAACCGC TGATGGAACA AGTGGGTACG[0198] GAAGAATTTA TCAAACGTTT CGGCGATGGT GCATCGCGTG TCGTGCTGAG CCTGCCGTTT[0199] GCTGAAGGCA GTTCCTCAGT GGAATACATT AACAATTGGG AACAAGCAAA AGCTCTGTCA[0200] GTTGAACTGG AAATCAATTT CGAAACGCGT GGCAAACGCG GTCAAGATGC TATGTATGAA[0201] TATATGGCTC AGGCGTGTGC GGGCAATCGC GTCCGTCGCT AAGGCTCGGG CTCTGGCCAA[0202] TACATCAAGG CGAACAGCAA ATTCATCGGC ATCACGGAAC TG
[0203] GGATCC
[0204] 将空白质粒和合成的P2CRM197AP2基因的PCR产物中，分别加入Nde I酶和Bam HI酶进行双酶切反应；纯化后，在连接体系中加入T4连接酶进行连接，完成后纯化表达质粒，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化至细胞内，筛选克隆，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。获得阳性表达工程菌后，建立种子库，包括主种子和工作种子。储存于‐20℃以下冰箱中。
[0205] 2‐3、CRM197AP2、P2P2CRM197A、CRM197AP2P2、P2P2CRM197AP2、以及P2CRM197AP2P2蛋白载体表达质粒的构建
[0206] 方法和上节“2‐1、P2CRM197A蛋白载体表达质粒的构建”相同。
[0207] 2‐4、P30CRM197A蛋白载体表达质粒的构建
[0208] 采用自制的表达质粒，用Nde I酶识别质粒位点CATATG，Bam HI酶识别位点GGATCC。经过P30CRM197A蛋白基因序列进行分析，在序列内，无Nde I及Bam HI酶切位点。P30CRM197A基因合成全序列如下：
[0209] CATATG
[0210] TTCAATAATT TTACGGTGTC GTTTTGGCTG CGTGTCCCGA AAGTCTCTGC GAGTCATCTG[0211] GAAGGTTCTG GTAGCGGTGG TGCGGATGAC GTGGTTGATA GCTCTAAATC TTTCGTTATG[0212] GAAAACTTCA GTTCCTATCA TGGCACCAAA CCGGGTTACG TCGATTCGAT TCAGAAAGGC[0213] ATCCAAAAAC CGAAAAGCGG CACCCAGGGT AACTACGATG ACGATTGGAA AGAATTCTAC[0214] TCAACGGACA ACAAATACGA TGCGGCCGGC TACTCCGTGG ACAACGAAAA TCCGCTGAGC[0215] GGTAAAGCGG GCGGTGTCGT GAAAGTTACC TATCCGGGTC TGACGAAAGT GCTGGCTCTG[0216] AAAGTTGATA ATGCGGAAAC CATCAAAAAA GAACTGGGCC TGTCCCTGAC CGAACCGCTG[0217] ATGGAACAAG TGGGTACGGA AGAATTTATC AAACGTTTCG GCGACGGTGC CTCTCGCGTT[0218] GTCCTGAGTC TGCCGTTTGC AGAAGGCTCA TCGAGCGTCG AATACATTAA CAATTGGGAA[0219] CAAGCAAAAG CTCTGAGCGT GGAACTGGAA ATCAACTTCG AAACGCGTGG CAAACGCGGT[0220] CAGGATGCGA TGTATGAATA CATGGCGCAA GCCTGCGCAG GTAATCGTGT TCGTCGC[0221] GGATCC
[0222] 将空白质粒和合成的P30CRM197A基因的PCR产物中，分别加入Nde I酶和Bam HI酶进行双酶切反应；纯化后，在连接体系中加入T4连接酶进行连接，完成后纯化表达质粒，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化至细胞内，筛选克隆，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。获得阳性表达工程菌后，建立种子库，包括主种子和工作种子。储存于‐20℃以下冰箱中。
[0223] 2‐5、CRM197AP30、P30CRM197AP30、P30P30CRM197A、CRM197AP30P30、P30P30CRM197AP30、以及P30CRM197AP30P30蛋白表达质粒的构建
[0224] 方法和上节“2‐4、P30CRM197A蛋白表达质粒的构建”相同。
[0225] 2‐6、OVApCRM197A蛋白载体表达质粒的构建
[0226] 采用自制的表达质粒，用Nde I酶识别质粒位点CATATG，Bam HI酶识别位点GGATCC。经过OVApCRM197A蛋白基因序列进行分析，在序列内，无Nde I及Bam HI酶切位点。OVApCRM197A基因合成全序列如下：
[0227] CATATG
[0228] ATCAGCCAAG CGGTTCACGC AGCCCACGCC GAAATTAACG AAGCGGGTCG CGGTAGCGGT[0229] TCTGGCGGTG CAGACGATGT TGTTGACTCC AGCAAATCAT TCGTCATGGA AAACTTTAGC[0230] TCTTATCATG GCACCAAACC GGGTTACGTG GACTCCATTC AGAAAGGCAT CCAAAAACCG[0231] AAATCAGGCA CCCAGGGTAA CTATGATGAC GATTGGAAAG AATTCTACTC TACGGACAAC[0232] AAATACGATG CGGCCGGCTA CTCTGTTGAC AACGAAAATC CGCTGAGTGG TAAAGCAGGC[0233] GGTGTGGTTA AAGTCACCTA TCCGGGTCTG ACGAAAGTTC TGGCGCTGAA AGTCGATAAC[0234] GCCGAAACCA TCAAAAAAGA ACTGGGCCTG TCGCTGACCG AACCGCTGAT GGAACAAGTG[0235] GGTACGGAAG AATTTATCAA ACGTTTCGGC GATGGTGCAT CGCGTGTCGT GCTGAGCCTG[0236] CCGTTTGCTG AAGGCAGTTC CTCAGTGGAA TACATTAACA ATTGGGAACA AGCAAAAGCT[0237] CTGAGTGTTG AACTGGAAAT CAATTTCGAA ACGCGTGGTA AACGCGGTCA GGACGCAATG[0238] TATGAATATA TGGCCCAGGC TTGTGCAGGC AACCGTGTTC GCCGTTAA
[0239] GGATCC
[0240] 将空白质粒和合成的OVApCRM197A基因的PCR产物中，分别加入Nde I酶和Bam HI酶进行双酶切反应；纯化后，在连接体系中加入T4连接酶进行连接，完成后纯化表达质粒，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化至细胞内，筛选克隆，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。获得阳性表达工程菌后，建立种子库，包括主种子和工作种子。储存于‐20℃以下冰箱中。
[0241] 2‐7、CRM197AOVAp、OVApCRM197OVAp、OVApOVApCRM197A、CRM197AOVApOVAp、OVApOVApCRM197AOVAp、以及OVApCRM197AOVApOVAp蛋白表达质粒的构建：
[0242] 方法和上节“2‐6、OVApCRM197A蛋白载体表达质粒的构建”相同。
[0243] 2‐8、P30CRM197AP2蛋白载体表达质粒的构建
[0244] 采用自制的表达质粒，用Nde I酶识别质粒位点CATATG，Bam HI酶识别位点GGATCC。经过P30CRM197AP2蛋白基因序列进行分析，在序列内，无Nde I及Bam HI酶切位点。P30CRM197AP2基因合成全序列如下：
[0245] CATATG
[0246] TTCAACAATT TTACGGTCTC GTTTTGGCTG CGTGTCCCGA AAGTGTCTGC CTCACATCTG[0247] GAAGGTAGCG GTTCAGGTGG TGCGGATGAC GTGGTTGATA GCTCTAAATC CTTTGTTATG[0248] GAAAACTTCA GTTCCTATCA TGGTACCAAA CCGGGCTACG TCGATTCTAT TCAGAAAGGT[0249] ATCCAAAAAC CGAAAAGTGG TACCCAGGGC AACTATGATG ACGATTGGAA AGAATTCTAC[0250] TCTACGGACA ACAAATACGA TGCGGCCGGT TACTCGGTGG ACAACGAAAA TCCGCTGAGC[0251] GGTAAAGCCG GCGGTGTCGT GAAAGTTACC TATCCGGGCC TGACGAAAGT GCTGGCTCTG[0252] AAAGTTGATA ACGCGGAAAC CATCAAAAAA GAACTGGGTC TGAGCCTGAC CGAACCGCTG[0253] ATGGAACAAG TGGGCACGGA AGAATTTATC AAACGTTTCG GTGACGGTGC ATCCCGTGTT[0254] GTCCTGTCAC TGCCGTTTGC AGAAGGTTCA TCGAGCGTCG AATACATCAA CAACTGGGAA[0255] CAAGCAAAAG CTCTGAGCGT GGAACTGGAA ATCAATTTCG AAACCCGTGG TAAACGCGGC[0256] CAGGATGCTA TGTATGAATA CATGGCGCAA GCCTGCGCAG GTAACCGTGT TCGTCGCGGC[0257] TCTGGTAGTG GCCAGTACAT CAAAGCGAAC AGTAAATTCA TCGGCATCAC GGAACTG[0258] GGATCC
[0259] 将空白质粒和合成的P30CRM197AP2基因的PCR产物中，分别加入Nde I酶和Bam HI酶进行双酶切反应；纯化后，在连接体系中加入T4连接酶进行连接，完成后纯化表达质粒，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化至细胞内，筛选克隆，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。获得阳性表达工程菌后，建立种子库，包括主种子和工作种子。储存于‐20℃以下冰箱中。
[0260] 2‐9、P2CRM197AP30、P2P30CRM197AP2、以及P2P30CRM197AOVAp蛋白载体表达质粒的构建
[0261] 方法和上节“2‐8、P30CRM197AP2蛋白表达质粒的构建”相同。
[0262] 三、含有万能表位肽CRM197A蛋白载体和CRM197A蛋白载体的制备
[0263] 实验结果表明，CRM197A蛋白载体和含有万能表位肽的CRM197A蛋白载体的特性相似；因此，这些蛋白载体的纯化方法相似，以下以含有万能表位肽的CRM197A蛋白载体为例说明方法。
[0264] 1、表达含有万能表位肽的CRM197A蛋白载体工程菌的制备
[0265] 用分子生物学标准方法将各个表达蛋白载体的质粒转入至感受态细胞内，并进行表达检定。筛选出蛋白表达量高，并且通过用抗血清检定合格的克隆，建立主种子库和工作种子库。
[0266] 2、含有万能表位肽的CRM197A蛋白载体表达工程菌的发酵
[0267] 从低温冰箱保存的大肠杆菌工程菌工作种子库中，取出一支表达含有特定万能表位肽的CRM197A蛋白载体的工作种子管，在室温下解冻；将种子管中的菌液无菌转移至50毫升的培养基中，在37℃，摇速为180rpm的摇床中培养至OD600＝1.0左右；将菌液无菌接种至1升的培养基中，在37℃，摇速为180rpm的摇床中培养至OD600＝1.0左右；接种种子液至50‐升发酵罐中的20升培养基中，在37℃下，240rpm条件下进行发酵，当OD600至7‐8时，加入IPTG诱导重组蛋白在细菌中合成；发酵至14小时后，停止发酵，离心，收集菌体待用。
[0268] 3、含有万能表位肽的CRM197A蛋白载体的纯化
[0269] 由于构建含有不同万能表位肽的蛋白载体都是以CRM197A为主体，实验表明，尽管加入了万能表位肽，但对蛋白纯化的参数影响不大，只需要在纯化CRM197A蛋白载体的工艺参数上进行一些修饰，就可建立起其他含有万能表位肽的CRM197A蛋白载体的纯化方法。
[0270] 称重50g湿菌体于2升离心杯中，加入300ml1xPBS pH7.0缓冲液混悬菌体，在磁力搅拌器上搅拌混匀30min；在4℃下，4000rpm，离心20min，弃上清，收集菌体；重复该步骤两次；加入300ml1xPBS pH7.0至菌体离心管，在均质机上进行破碎；在4℃下，10000rpm，离心20min；收集沉淀，弃上清液；加入300ml1xPBS pH7.0缓冲液，在磁力搅拌器上搅拌30min；在
4℃下，4000rpm，离心20min；弃上清液，收集包涵体，加入900ml变性缓冲液至洗涤后的包涵体，在25℃下，10000rpm离心30min，收集上清液，弃沉淀；将离心上清液转移至6‐8KD透析袋中，封闭透析袋；置透析袋于10升复性缓冲液1中，室温下，在磁力搅拌器上搅拌透析过夜；
次日将透析袋转入10升复性缓冲液2中，室温搅拌透析8‐10小时；将透析袋转入10升复性缓冲液3中，室温搅拌透析过夜；次日将透析袋转入10升复性缓冲液4中，室温搅拌透析8‐10小时；将透析袋转入10升复性缓冲液5中，室温搅拌透析过夜；次日将透析袋转入2升储备缓冲液中，室温搅拌透析8‐10小时；更换储备缓冲液二次，室温透析过夜；取1ml透析液，室温
12000rpm离心10min，收集上清，测蛋白质浓度；将蛋白溶液上样至预先平衡的DEAE胶柱，用等梯度洗脱，并收集目的蛋白峰；然后上样至Phenyl疏水柱进一步纯化，收集洗脱峰；最后上样SP胶柱，收集洗脱峰；将收集获得的纯化目的蛋白转至透析袋中，在0.15M的氯化钠中透析，完成后转移至4℃下储存待用。
4℃下，4000rpm，离心20min；弃上清液，收集包涵体，加入900ml变性缓冲液至洗涤后的包涵体，在25℃下，10000rpm离心30min，收集上清液，弃沉淀；将离心上清液转移至6‐8KD透析袋中，封闭透析袋；置透析袋于10升复性缓冲液1中，室温下，在磁力搅拌器上搅拌透析过夜；
次日将透析袋转入10升复性缓冲液2中，室温搅拌透析8‐10小时；将透析袋转入10升复性缓冲液3中，室温搅拌透析过夜；次日将透析袋转入10升复性缓冲液4中，室温搅拌透析8‐10小时；将透析袋转入10升复性缓冲液5中，室温搅拌透析过夜；次日将透析袋转入2升储备缓冲液中，室温搅拌透析8‐10小时；更换储备缓冲液二次，室温透析过夜；取1ml透析液，室温
12000rpm离心10min，收集上清，测蛋白质浓度；将蛋白溶液上样至预先平衡的DEAE胶柱，用等梯度洗脱，并收集目的蛋白峰；然后上样至Phenyl疏水柱进一步纯化，收集洗脱峰；最后上样SP胶柱，收集洗脱峰；将收集获得的纯化目的蛋白转至透析袋中，在0.15M的氯化钠中透析，完成后转移至4℃下储存待用。
[0271] 四、细菌荚膜多糖的制备
[0272] 对三种细菌的荚膜多糖，包括肺炎球菌的13个血清型，流行性嗜血杆菌b型，以及流行性脑膜炎球菌的A、C、Y、和W135群，进行纯化，以便用于结合疫苗的合成，其质量达到WHO合成多糖蛋白结合疫苗的多糖质量标准。
[0273] 1、肺炎球菌荚膜多糖制备
[0274] 1‐1、种子库的建立
[0275] 从ATCC购买的13个血清型肺炎球菌，包括1(货号：9163)、3(货号：10813)、4(货号：BAA‐334)、5(货号：BAA‐341)、6A(货号：BAA‐659)、6B(货号：700675)、7F(货号：10351)、9V(货号：700671)、14(货号：6314)、18C(货号：10356)、19A(700673)、19F(700905)、和23F(700669)。取出ATCC购买的菌种(原始种子批)，加入0.5ml的肺炎球菌AHC液体培养基将菌种混匀，取0.25ml菌液于5％羊血AHC培养液中。接种后的5％羊血AHC培养液管置于36℃±1℃的培养摇床上，摇速120rpm，培养12‐20小时。待OD600至1.0时，用接种环将5％羊血AHC培养液接种至AHC琼脂培养基平皿上，置于36℃±1℃的培养箱内培养12‐20小时。用接种环将AHC琼脂平皿上的1至数个菌落接种于10ml的AHC培养液中，置于36℃±1℃，在培养摇床上培养12小时，摇速150‐200rpm。培养液中细菌OD600长到1.0，取出5ml细菌AHC培养液接种到
200ml的新鲜AHC培养液中，置于36℃±1℃的培养摇床上培养12小时左右，摇速150‐
200rpm。OD600至1.0时，将细菌培养液以1ml分装于200个小试管中，离心(4000rpm，10min)，去除上清培养液，然后加入0.5ml的新鲜AHC培养液和0.5ml的无菌脱脂牛奶，混匀，在乙醇干冰上快速冷冻。真空冻干，编号，作为主种子批保存于4℃冰箱内。取出主种子批建立，按照主种子建立方法，将细菌培养液接种到另一个200ml的新鲜AHC培养液中，置于36℃±1℃的培养摇床上培养12小时，内培养12小时左右，摇速150‐200rpm。待OD600至1.0时，将细菌培养液以1ml分装于200个小试管中，离心(4000rpm，10min)，去除上清培养液，然后加入0.6ml的新鲜AHC培养液和0.4ml的40％甘油溶液，混匀。速冻于干冰上，作为工作种子保存于‐70℃低温冰箱中。
200ml的新鲜AHC培养液中，置于36℃±1℃的培养摇床上培养12小时左右，摇速150‐
200rpm。OD600至1.0时，将细菌培养液以1ml分装于200个小试管中，离心(4000rpm，10min)，去除上清培养液，然后加入0.5ml的新鲜AHC培养液和0.5ml的无菌脱脂牛奶，混匀，在乙醇干冰上快速冷冻。真空冻干，编号，作为主种子批保存于4℃冰箱内。取出主种子批建立，按照主种子建立方法，将细菌培养液接种到另一个200ml的新鲜AHC培养液中，置于36℃±1℃的培养摇床上培养12小时，内培养12小时左右，摇速150‐200rpm。待OD600至1.0时，将细菌培养液以1ml分装于200个小试管中，离心(4000rpm，10min)，去除上清培养液，然后加入0.6ml的新鲜AHC培养液和0.4ml的40％甘油溶液，混匀。速冻于干冰上，作为工作种子保存于‐70℃低温冰箱中。
[0276] 1‐2、肺炎球菌的发酵
[0277] 从种子库中取出冻干工作种子管，加入1ml AHC富集培养液溶解冻干细菌。将溶解的菌液接种于5ml AHC富集培养液试管中，在CO2培养箱中静置培养过夜。观察有细菌生长时，将菌液接种于100ml的AHC富集培养液三角瓶中。置培养瓶于摇床中，36℃下，200rpm/min培养至OD600为1.0。将100ml细菌培养液分别接种于2个装有1‐升的AHC富集培养液瓶中。置培养瓶于摇床中，36℃下，200rpm/min培养至OD600为1.0。将35升的无菌过滤AHC富集培养液注入50升发酵罐中。接种2升OD为1的菌液至发酵罐中。当细菌生长到达平台期，杀菌，收获培养上清液。
[0278] 1‐3、荚膜多糖的纯化
[0279] 用深层滤膜过滤，进一步去除残存细菌及碎片。将无菌的上清培养液用100Kd超滤膜超滤浓缩十倍(约600ml)。以6升25mM醋酸钠溶液进行超滤清洗。加入HB储存液使得最终浓度为1％(w/v)，混匀，将溶液放置于冷库过夜。离心，4000rpm，1小时，收集多糖/HB沉淀，摈弃离心液。加入25mM的sodium acetate+1％HB至多糖/HB沉淀容器中，搅拌悬浮沉淀，离心，4000rpm，1小时，收集多糖/HB沉淀，弃离心液。重复3次该步骤。用600ml的0.25M氯化钠溶液溶解沉淀。离心，4000rpm，1小时，丢弃不溶的核酸污染物。加入10％碘化钾溶液入多糖+HB混合溶液中，混匀，碘化钾最终浓度为0.5％，将溶液置于冷库中过夜。用深层过滤器过滤溶液，除去溶液中的HB/I沉淀，并用0.25M氯化钠/0.5％碘化钾溶液清洗深层过滤器上的沉淀，收集过滤液，弃去沉淀。将粗制的多糖溶液通入活性炭深层过滤器进行循环过滤30分钟(4％活性炭/0.5mg/ml多糖粗制溶液)。加入磷酸钠缓冲液pH6.8，最终浓度25mM加入到多糖溶液中。将以上溶液过HA柱(50‐100ml)，循环30分钟。用相同磷酸盐溶液洗柱4‐5个柱体积。用30Kd膜超滤浓缩多糖溶液5‐倍，用无热源水超滤清洗多糖溶液。用0.22μm膜过滤，冻干。
[0280] 2、流行性嗜血杆菌b型荚膜多糖的制备
[0281] 2‐1、种子库的建立
[0282] 由赠送获得的流行性嗜血杆菌b型菌株作为原始种子株建立主种子库和工作种子，建立方法见肺炎球菌种子库节。
[0283] 2‐2、流行性嗜血杆菌b型细菌的发酵
[0284] 将流行性嗜血杆菌b型(Hib)工作种子接种到平皿培养基上，在36.5℃培养箱过夜。取一个Hib菌斑，接种到5毫升的新鲜基本培养液中，在36.5℃和300rpm细菌培养摇床培养。当接种的培养液达到了指数生长中期，OD为0.6‐1.0；将接种的培养液转接到250毫升培养瓶中，其中有45毫升的新鲜基本培养液，在36.5℃和300rpm细菌培养摇床培养。当接种的培养液达到了指数生长中期，OD为0.6‐1.0；将接种的培养液转接到4升培养瓶中，其中有1升的新鲜基本培养液，在36.5℃和300rpm细菌培养摇床培养。当接种的培养液达到了指数生长中期(约16‐18小时)，OD为0.6‐1.0；将接种的培养液转接到发酵罐中，其中有20升的新鲜基本培养液。当Hib细菌达到指数生长中期时，加入新鲜基本培养液和补充培养液，最终培养液中的糖浓度为23g/L，所加入的新鲜补充培养液的总体积为25升。培养14.5小时后停止发酵。
[0285] 2‐3、荚膜多糖的纯化
[0286] 将Hib培养液离心沉淀的Hib菌体，悬浮在2升的蒸馏水中，用磁力搅拌器混匀。加入200ml的12％Deoxycholate sodium溶液入细菌悬浮液中，搅拌混匀30分钟，然后转入到10℃±3℃冷柜中搅拌8–24小时，保证菌体完成裂解、多糖释放出来。用50％的醋酸调节细菌裂解液的pH值到6.4–6.8，温度为20℃±5℃，停止搅拌，静止12–24小时。以10,000rpm离心1小时，收集上清液，丢弃沉淀物。用0.05M的磷酸盐pH7.0透析多糖上清液。加入等体积的
0.2％HB溶液，用磁力搅拌器混匀30分钟，然后，转入到4℃冷柜中静至过夜。以10,000rpm离心30min，收集沉淀，丢弃上清液。加入100ml的0.5M氯化钠溶液溶解沉淀。加入680ml无水乙醇，混匀，然后，转入到4℃冷柜中静至过夜。以10,000rpm离心30min，收集上清液，丢弃沉淀。加入5.2升无水乙醇，混匀，然后，转入到4℃冷柜中静置过夜。以10,000rpm离心30min，收集沉淀，丢弃上清液。加入500ml的蒸馏水溶解沉淀，透析。冻干。
0.2％HB溶液，用磁力搅拌器混匀30分钟，然后，转入到4℃冷柜中静至过夜。以10,000rpm离心30min，收集沉淀，丢弃上清液。加入100ml的0.5M氯化钠溶液溶解沉淀。加入680ml无水乙醇，混匀，然后，转入到4℃冷柜中静至过夜。以10,000rpm离心30min，收集上清液，丢弃沉淀。加入5.2升无水乙醇，混匀，然后，转入到4℃冷柜中静置过夜。以10,000rpm离心30min，收集沉淀，丢弃上清液。加入500ml的蒸馏水溶解沉淀，透析。冻干。
[0287] 3、流行性脑膜炎球菌荚膜多糖的制备
[0288] 3‐1、种子库的建立
[0289] 由赠送获得的流行性脑膜炎球菌A、C、Y、和W135群菌株作为原始种子株建立主种子库和工作种子，建立方法见肺炎球菌种子库节。
[0290] 3‐2、流行性脑膜炎球菌细菌发酵和纯化
[0291] 见“2、流行性嗜血杆菌b型多糖纯化”节。
[0292] 五、多糖蛋白结合物的制备
[0293] 不同细菌多糖的化学结构中含有不同的基团，需要采用不同的合成方法将多糖共价键地连接至蛋白载体形成结合物，并且不同方法合成的结合物的产量和免疫原性有所不同。本发明根据实验结果，采用三种合成方法，即还原胺法，CDAP法(1‐(3‐二甲基氨基丙基)‐3‐乙基碳化二亚胺盐酸盐法)和ADH法(己二酰二肼法)，来合成特定的多糖蛋白结合物。本发明的多糖蛋白结合物包括13价肺炎球菌多糖结合物、流行性嗜血杆菌b型多糖结合物、以及4价流行性脑膜炎球菌多糖结合物。
[0294] 1、13价肺炎球菌多糖P2CRM197A蛋白结合物的制备
[0295] 设计并生产出共26种用CRM197A蛋白载体来合成的多糖蛋白结合物，由于蛋白质的结构相似，用于特定的多糖合成时，所采用的方法是还原胺法，ADH法或者CDAP法中的一种。在下面的示例中仅用P2CRM197A蛋白载体的合成过程来说明方法；而用其它蛋白载体合成时，采用方法相似，在此不一一列举具体方法。
[0296] 1‐1、肺炎球菌血清型1荚膜多糖‐P2CRM197A蛋白结合物合成
[0297] 称取5mg的Pn1降解多糖于反应瓶中，量取0.5ml的1mol/L NaCl加入反应瓶中；磁力搅拌使多糖完全溶解。记录多糖溶液的初始pH，分别量取适量的CDAP溶液，加入反应瓶中。室温下搅拌反应1.5min，30s时测定溶液的pH。1.5min后，用0.2mol/L NaOH调节溶液的pH至9.5，室温下搅拌反应3min(用0.2mol/L NaOH维持pH在9.5)。3min后立即向反应瓶中加入5mg的P2CRM197A蛋白，在室温下(25℃)搅拌反应1h。量取37.5μl2mol/L赖氨酸加入反应瓶中，用0.1N HCl调节溶液pH至9.0。室温下搅拌反应30min，将反应瓶转移到4℃下反应过夜。将反应混合物转移至透析袋(MWCO6‐8000)中，在4℃下，对0.85％NaCl溶液透析3次，6L/次。透析结束后将反应混合液10000rpm，离心10min后取上清液，采用Sepharose CL‐4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合物峰，取样送检。
[0298] 1‐2、肺炎球菌血清型3荚膜多糖‐P2CRM197A蛋白结合物合成
[0299] 称取20mg的Pn3降解多糖于反应瓶中，量取2ml的0.15M NaCl加入反应瓶中；磁力搅拌使多糖完全溶解。量取适量的CDAP溶液，加入反应瓶中。室温下搅拌反应1.5min，30s时测定溶液的pH。1.5min后，用0.2mol/L NaOH调节溶液的pH至9.5，室温下搅拌反应3min(用0.2mol/L NaOH维持pH在9.5)。加入最终浓度为0.8M的ADH至反应瓶中，搅拌混匀，室温下反应2小时。将衍化后的多糖转至10KD的透析袋中对0.15M NaCl溶液进行透析，换液三次。上样G‐50柱，用0.15M NaCl洗脱，收集外水体积峰。然后转移至透析袋中，对水透析，换液三次。称取5mg衍化后的Pn3多糖，溶解至0.5ml的0.15M NaCl溶液中，加入5mg的P2CRM197A蛋白，搅拌混匀后，加入30mM的EDC，在室温下反应4小时，转移到4℃下反应过夜。将反应混合物转移至透析袋(MWCO6‐8000)中，在4℃下，对0.85％NaCl溶液透析3次，6L/次。透析结束后将反应混合液10000rpm，离心10min后取上清液，采用Sepharose CL‐4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合物峰，取样送检。
[0300] 1‐3、肺炎球菌血清型4荚膜多糖‐P2CRM197A蛋白结合物合成
[0301] 称取5mg活化多糖至反应瓶中，量取100μl的0.5M磷酸钠缓冲液，加入反应瓶中，量取5mg的P2CRM197A蛋白至反应瓶中，磁力搅拌使多糖完全溶解；量取0.5ml纯水加入反应瓶中，磁力搅拌混匀；称取5.0mg的sodium cyanoborohydride，加入反应瓶中。将反应体系置于30℃的干浴器中反应12h。反应结束后，量取1.5ml的0.15M sodium chloride solution加入反应瓶中。称取2.5mg的sodium borohydride，加入反应瓶中。反应体系置于22℃下反应5h；将反应混合物转移至透析袋(MWCO12‐14Kd)，在4℃下，对0.15M sodium chloride solution透析3次，每次透析液量6L。透析结束后将反应混合液10000rpm，离心10min后取上清液，采用Sepharose CL‐4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合物峰，取样送检。
[0302] 1‐4、肺炎球菌血清型5荚膜多糖‐P2CRM197A蛋白结合物合成
[0303] 称取5.0mg活化多糖，加入至反应瓶中，向反应瓶中加入100μl的0.5M磷酸钠缓冲液；称取4.0mg的P2CRM197A蛋白，加入反应瓶中，量取0.5ml纯水加入反应瓶中，磁力搅拌使反应物溶解，测定反应体系的pH；称取5.0mg sodium cyanoborohydride，加入反应瓶中；将反应体系置于室温下反应48小时；称取2.5mg的sodium borohydride，溶解于10μl纯水中，用移液枪混匀溶解完全后，加入反应瓶中；将反应体系置于23℃下搅拌反应5小时；将反应混合物转移至透析袋(MWCO6‐8KD)中，在4℃下，对0.15M氯化钠溶液透析3次，每5小时换液一次。透析结束后将反应混合液10000rpm，离心10min后取上清液，采用Sepharose CL‐4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合物峰，取样送检。
[0304] 1‐5、肺炎球菌血清型6A荚膜多糖‐P2CRM197A蛋白结合物合成
[0305] 称取6.0mg活化Pn6A多糖加入至反应瓶中，向反应瓶中加入1mL纯化水，搅拌至完全溶解后测初始pH值；用0.1M NaOH调节反应液pH值至7.0；向反应体系中加入4mg的P2CRM197A蛋白，搅拌混匀；称取5.0mg的sodium cyanoborohydride，加入上述反应瓶中，在室温反应18小时；反应结束后取样送检；称取2.7mg的Sodium borohydride，加入上述反应瓶中，在室温反应5小时；反应结束后取样送检；将反应混合物转移至透析袋，在4℃下，对0.15M氯化钠溶液透析5次，6L/次。透析结束后将反应混合液10000rpm，离心10min后取上清液，采用Sepharose CL‐4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合物峰，取样送检。
[0306] 1‐6、肺炎球菌血清型6B荚膜多糖‐P2CRM197A蛋白结合物合成
[0307] 称取5.0mg的Pn6B多糖加入至反应瓶中，向反应瓶中加入1mL纯化水，搅拌至完全溶解后测初始pH值；用0.1M NaOH调节反应液pH值至7.0；向反应体系中加入2.5mg的P2CRM197A蛋白，搅拌混匀；称取5.0mg的sodium cyanoborohydride，加入上述反应瓶中，在室温反应20小时；称取2.5mg的Sodium borohydride，加入上述反应瓶中，在室温反应6小时；将反应混合物转移至透析袋，在4℃下，对0.15M NaCl溶液透析5次，6L/次。透析结束后将反应混合液10000rpm，离心10min后取上清液，采用Sepharose CL‐4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合物峰，取样送检。
[0308] 1‐7、肺炎球菌血清型7F荚膜多糖‐P2CRM197A蛋白结合物合成
[0309] 称取10.0mg的Pn7F多糖加入至反应瓶中，向反应瓶中加入1mL纯化水，搅拌至完全溶解；分别滴加0.1M NaOH溶液至多糖溶液中，调节pH至7.0；向反应体系中加入3.5mg的P2CRM197A蛋白，搅拌混匀；称取5.0mg的sodium cyanoborohydride，加入上述反应瓶中，在室温反应20小时；往反应瓶中加入990μl纯水，搅拌混匀；称取2.5mg的Sodium borohydride，加入上述反应瓶中，在室温反应6小时；将反应混合物转移至透析袋(MWCO6000‐8000)，在4℃下，对5mM succinate/0.9％氯化钠缓冲液透析5次，6L/次。透析结束后将反应混合液10000rpm，离心10min后取上清液，采用Sepharose CL‐4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合物峰，取样送检。
[0310] 1‐8、肺炎球菌血清型9V荚膜多糖‐P2CRM197A蛋白结合物合成
[0311] 称取10mg的Pn9V活化多糖加入至反应瓶中，向反应瓶中加入125μl的磷酸钠缓冲液，量取125μl纯水加入反应瓶中，磁力搅拌使多糖完全溶解；量取15mg的P2CRM197A蛋白至加入反应瓶中，搅拌溶解完全；称取10mg的NaBH3(CN)，加入反应瓶中；将反应体系置于22℃下反应48小时；称取2.5mg的NaBH4，加入反应瓶中，22℃下反应5小时；将反应混合液10000rpm，离心10min后取上清液，采用Sepharose CL‐4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合物峰，取样送检。
[0312] 1‐9、肺炎球菌血清型14荚膜多糖‐P2CRM197A蛋白结合物合成
[0313] 称取5mg的Pn14活化多糖加入至反应瓶中，向反应瓶中加入1ml3.9mg的P2CRM197A蛋白，加入反应瓶中 ，磁力搅拌使多糖完全溶解；加入弱还原剂sodium cyanoborohydride5mg后，在22℃下反应48小时；加入强还原剂sodium borohydride2.5mg，室温下反应4小时；将反应混合液转移至透析袋(MWCO12‐14KD)中，用2ml的透析液润洗反应瓶；在4℃下，对0.15M氯化钠溶液透析3次，6L/次，每5小时换液一次。透析结束以后收集透析液，10000rpm，离心10min后取上清，采用Sepharose CL‐4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合物峰，取样送检。
[0314] 1‐10、肺炎球菌血清型18C荚膜多糖‐P2CRM197A蛋白结合物合成
[0315] 称取5mg的Pn18C降解多糖加入至反应瓶中，向反应瓶中加入1mL1M氯化钠溶液溶解；溶解完全后测其初始pH值；加入适量的CDAP溶液，室温下搅拌1.5min，加入0.2M NaOH溶液调节溶液的pH至9.0。之后于室温反应3min；加入10mg的P2CRM197A蛋白，于25℃下反应45min；反应结束后，加入37.5μl2M赖氨酸溶液；25℃下反应30min后置于4℃反应过夜；将反应混合液转至透析袋(MWCO6000‐8000)中，在4℃下，对0.85％氯化钠溶液透析，换液3次。
6L/次，每5小时换液一次。透析结束后将反应混合液10000rpm，离心10min后取上清液，采用Sepharose CL‐4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合物峰，取样送检。
6L/次，每5小时换液一次。透析结束后将反应混合液10000rpm，离心10min后取上清液，采用Sepharose CL‐4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合物峰，取样送检。
[0316] 1‐11、肺炎球菌血清型19A荚膜多糖‐P2CRM197A蛋白结合物合成
[0317] 称取10.0mg氧化Pn19A多糖加入至反应瓶中，向反应瓶中加入0.5mL缓冲液中，置磁棒于反应瓶中，搅拌至多糖完全溶解；加入10mg的P2CRM197A蛋白；搅拌混匀，称取5.0mg的sodium cyanoborohydride，加入至反应瓶中，在室温下反应20小时；称取2.5mg的sodium borohydride，加入反应瓶中，在室温下反应5小时；将反应混合液转至透析袋(MWCO6000‐8000)中，在4℃下，对0.85％氯化钠溶液透析，换液3次。6L/次，每5小时换液一次。透析结束后将反应混合液10000rpm，离心10min后取上清液，采用Sepharose CL‐4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合物峰，取样送检。
[0318] 1‐12、肺炎球菌血清型19F荚膜多糖‐P2CRM197A蛋白结合物合成
[0319] 称取5.2mg氧化Pn19F多糖加入至反应瓶中，向反应瓶中加入1ml纯水，置磁棒于反应瓶中，在磁力搅拌器上室温下搅拌至多糖完全溶解；加入3.0mg的P2CRM197A蛋白；搅拌混匀后，称取4.9mg的sodium cyanoborohydride，加入置反应瓶中，在磁力搅拌器上一直保持搅拌；在室温18℃下反应24小时；称取2.5mg的sodium borohydride，加入至反应瓶；在恒温箱18℃下反应5小时；将反应混合物转移至透析袋(MWCO12‐14000)，在4℃下，对缓冲液透析5次，每次透析液量6L，每5小时换液一次。透析结束后将反应混合液10000rpm，离心10min后取上清液，采用Sepharose CL‐4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合物峰，取样送检。
[0320] 1‐13、肺炎球菌血清型23F荚膜多糖‐P2CRM197A蛋白结合物合成
[0321] 称取4.9mg氧化Pn23F多糖加入至反应瓶中，向反应瓶中加入1ml纯水，置磁棒于反应瓶中，在磁力搅拌器上室温下搅拌至多糖完全溶解；加入5.0mg的P2CRM197A蛋白；称取5.1mg的sodium cyanoborohydride，加入置反应瓶中，在磁力搅拌器上一直保持搅拌；在恒温箱18℃下反应17小时；称取2.5mg的sodium borohydride，加入至反应瓶；在恒温箱18℃下反应5小时；将反应混合物转移至透析袋(MWCO12‐14000)，在4℃下，对0.15M氯化钠溶液透析，每次透析液量6L。每5小时换液一次，共5次。透析结束后将反应混合液10000rpm，离心
10min后取上清液，采用Sepharose CL‐4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合物峰，取样送检。
10min后取上清液，采用Sepharose CL‐4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合物峰，取样送检。
[0322] 2、流行性嗜血杆菌b型多糖P2CRM197A结合物(称为Hib‐P2CRM197A)的制备[0323] 在流行性嗜血杆菌b型结合疫苗合成举例中，采用了六种含有万能表位肽的蛋白载体以及CRM197A蛋白载体来进行合成Hib结合物，包括P2CRM197A、P2CRM197AP2、P30CRM197A、OVApCRM197A、P30CRM197AP2、以及P2P30CRM197AOVAp蛋白载体。由于不同蛋白载体合成Hib结合物的方法相似，本发明以P2CRM197A蛋白载体为例说明结合物合成的方法。
[0324] 采用ADH法来合成Hib结合物，该方法合成步骤分为Hib多糖的衍化和结合物的合成。
[0325] 2‐1、流行性嗜血杆菌b型多糖的衍化
[0326] 将5mg Hib多糖用1ml纯水溶解后，加入溴化氰进行活化。向反应液中加入2ml的ADH溶液，最终浓度为0.4M，在2～8℃混合反应过夜。将反应液在0.2mol/L氯化钠溶液中透析。将反应液上样G‐50柱，收集外水体积峰。将结合物溶液至于透析袋中，用纯水透析，冷冻真空干燥，得到固体的衍化多糖。多糖衍生物应保存在‐20℃或以下。
[0327] 2‐2、流行性嗜血杆菌b型多糖‐P2CRM197A结合物的合成
[0328] 称取10mg衍化Hib多糖至反应瓶中。加入0.5ml的0.15M NaCl至反应瓶中，搅拌溶解多糖，先在室温下，然后转至4℃下过夜，以保证多糖溶解完全，溶液中多糖浓度为20mg/ml。用0.45μm膜无菌过滤多糖溶液至反应瓶，用0.1M NaOH或者0.1N HCl调节pH值至5.5。加入相当于5mg的P2CRM197A溶液至反应瓶中，搅拌混匀。加入2.9mg的EDC至培养瓶中。在室温下搅拌反应4小时。转移反应混合液至透析袋(MWCO6‐8000)，对0.15M NaCl溶液，4℃下透析，换液三次。上样Sepharose CL‐4B纯化，收集外水体积峰。根据分析结果，合并结合物峰值管。无菌过滤，储存在4℃下待用。
[0329] 2‐3、其它流行性嗜血杆菌b型多糖CRM197A结合物的合成
[0330] 参照上节“3、流行性嗜血杆菌b型多糖P2CRM197A结合物的制备”方法，本发明本发明选择了其它六种含有万能表位肽蛋白载体，包括CRM197AP2、P2CRM197AP2、P30CRM197A、OVApCRM197A、P30CRM197AP2、P2P30CRM197AOVAp、以及对照样品合成用蛋白载体CRM197A蛋白，共合成了七种结合物，即Hib‐CRM197AP2、Hib‐P2CRM197AP2、Hib‐P30CRM197A、Hib‐OVApCRM197A、Hib‐P30CRM197AP2、Hib‐P2P30CRM197AOVAp以及Hib‐CRM197A。
[0331] 3、4价流行性脑膜炎球菌多糖P2CRM197A结合物的制备
[0332] 采用ADH法来合成流行性脑膜炎球菌多糖P2CRM197A结合物，该方法分两个步骤，即多糖的衍化和结合物合成。
[0333] 3‐1、流行性脑膜炎球菌A群多糖‐P2CRM197A结合物(称为MenA‐P2CRM197A)的合成[0334] 3‐1‐1、流行性脑膜炎球菌A群多糖衍化
[0335] 将20mg的MenA多糖用4ml纯水溶解后，加入溴化氰进行活化。向反应液中加入10ml的ADH溶液，最终浓度为0.4M，在2～8℃混合反应过夜。将反应液在0.2mol/L氯化钠溶液中透析。将反应液上样G‐50柱，收集外水体积峰。将结合物溶液至于透析袋中，用纯水透析，冷冻真空干燥，得到固体的衍化多糖。多糖衍生物应保存在‐20℃或以下。
[0336] 3‐1‐2、流行性脑膜炎球菌A群多糖‐P2CRM197A结合物的合成
[0337] 称取5mg衍化MenA多糖至反应瓶中。加入0.5ml的0.15M NaCl至反应瓶中，搅拌溶解多糖，先在室温下，然后转至4℃下过夜，以保证多糖溶解完全，溶液中多糖浓度为20mg/ml。用0.45μm膜无菌过滤多糖溶液至反应瓶，用0.1M NaOH或者0.1N HCl调节pH值至5.5。加入相当于5mg的P2CRM197A溶液至反应瓶中，搅拌混匀。加入2.9mg的EDC至培养瓶中。在室温下搅拌反应4小时。转移反应混合液至透析袋(MWCO6‐8000)，对0.15M NaCl溶液，4℃下透析，换液三次。上样Sepharose CL‐4B纯化，收集外水体积峰。根据分析结果，合并结合物峰值管。无菌过滤，储存在4℃下待用。
[0338] 5‐1‐3、其它单价流行性脑膜炎球菌多糖‐P2CRM197A结合物的合成
[0339] 参照上节“5‐1‐2、流行性脑膜炎球菌A群多糖‐P2CRM197A结合物的合成”方法来合成其它三种结合物，包括流行性脑膜炎球菌C群多糖‐P2CRM197A结合物(称为MenC‐P2CRM197A)、流行性脑膜炎球菌Y群多糖‐P2CRM197A结合物(称为MenY‐P2CRM197A)、以及流行性脑膜炎球菌W135群多糖‐P2CRM197A结合物(称为MenW135‐P2CRM197A)。
[0340] 3‐2、其它4价流行性脑膜炎多糖CRM197A结合物的合成
[0341] 参照上节“4价流行性脑膜炎球菌多糖P2CRM197A结合物的制备”方法，本发明选择了六种含有万能表位肽蛋白载体，包括CRM197AP2、P2CRM197AP2、P30CRM197A、OVApCRM197A、P30CRM197AP2、P2P30CRM197AOVAp、以及对照样品合成用蛋白载体CRM197A蛋白，共合成了其它七种结合物，即4Men‐CRM197AP2、4Men‐P2CRM197AP2、4Men‐P30CRM197A、4Men‐OVApCRM197A、4Men‐P30CRM197AP2、4Men‐P2P30CRM197AOVAp、以及对照样品4‐Men‐CRM197A。
[0342] 六、多糖蛋白结合物免疫原性的评估
[0343] 用制备获得的多糖蛋白结合物来配制相应的疫苗，对小白鼠进行注射，采血，用ELISA法检测血清中多糖抗体浓度以及调理吞噬试验，来评估不同结合物的免疫原性。
[0344] 1、13价肺炎球菌多糖蛋白结合物的免疫原性的评估
[0345] 1)13价肺炎球菌多糖P2CRM197A蛋白结合物的免疫原性的评估
[0346] 为评估含有万能表位肽的CRM197A蛋白载体合成的多糖蛋白结合物的免疫原性优于不含有万能表位肽的CRM197A蛋白载体合成的多糖蛋白结合物，本发明合成了13价肺炎球菌多糖‐CRM197A作为对照，进行免疫原性增强效果的评估。
[0347] 1‐1、13价肺炎球菌多糖‐P2CRM197A蛋白结合疫苗、13价肺炎球菌多糖‐CRM197A蛋白结合疫苗的制备
[0348] 用Millipore的Labscale超滤系统分别将1，3，4，5，6A，7F，9V，14，18C，19A，19F和23F肺炎球菌血清型荚膜多糖结合物溶液浓缩至多糖浓度大约为40μg/ml；6B血清型结合物溶液浓度浓缩至多糖浓度为80μg/ml；按照下列表格计算加入相应容量的单价血清型结合物溶液至制剂瓶中。
[0349]
[0350] 将结合物混合液用0.22μm膜除菌过滤；加入无菌磷酸铝胶，最终铝离子浓度为125mg/ml；用缓冲液定容至最终体积；灌装，0.5ml/瓶。
[0351] 1‐2、其它含有万能表位肽蛋白载体的13价肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗的制备[0352] 参照上节“13价肺炎球菌多糖‐P2CRM197AP2蛋白结合物的制备”以及“13价肺炎球菌多糖‐P2CRM197AP2蛋白结合疫苗的制备”方法，本发明合成了以下13价肺炎球菌多糖CRM197A蛋白结合物制备了相应的疫苗，并用于免疫原性的评估实验。
[0353] 以含有P2万能表位肽蛋白载体合成的13价肺炎球菌多糖结合疫苗：13Pn‐CRM197AP2、13Pn‐P2CRM197AP2、13Pn‐P2P2CRM197A、13Pn‐CRM197AP2P2、13Pn‐P2P2CRM197P2、以及13Pn‐P2CRM197AP2P2。
[0354] 以含有P30万能表位肽蛋白载体合成的13价肺炎球菌多糖结合疫苗：13Pn‐P30CRM197A、13Pn‐CRM197AP30、13Pn‐P30CRM197AP30、13Pn‐P30P30CRM197A、13Pn‐CRM197AP30P30、13Pn‐P30P30CRM197AP30、以及13‐P30CRM197AP30P30。
[0355] 以含有OVAp万能表位肽蛋白载体合成的13价肺炎球菌多糖结合疫苗：13Pn‐OVApCRM197A、13Pn‐CRM197AOVAp、13Pn‐OVApCRM197AOVAp、13Pn‐OVApOVApCRM197A、13Pn‐CRM197AOVApOVAp、13Pn‐OVApOVApCRM197AOVAp、以及13Pn‐OVApCRM197AOVApOVAp。
[0356] 以两种以上不同的万能表位肽蛋白载体合成的13价肺炎球菌多糖结合疫苗：13Pn‐P30CRM197AP2、13Pn‐P2CRM197AP30、13Pn‐P2P30CRM197AP2、以及13Pn‐P2P30CRM197AOVAp。
[0357] 1‐3、注射小白鼠免疫注射及采血
[0358] 取5‐6周的CM57系小鼠70只，每支小鼠注射制备的13价肺炎球菌多糖‐P2CRM197A蛋白结合疫苗，注射容量为0.1ml/小鼠/次。注射小鼠分为三组，一组注射本发明配制的13价肺炎球菌多糖‐P2CRM197A蛋白疫苗，另一组注射以CRM197蛋白A链作为载体蛋白合成的13价肺炎球菌多糖‐CRM197A结合疫苗作为对照。
[0359] 小鼠免疫时间表如下表：
[0360]
[0361] 采集小鼠血液至离心管，在室温下静止2小时，在10000rpm条件下离心10分钟，用移液枪小心吸取离心上清血清，储存于4℃冰箱中，待检。
[0362] 1‐4、ELISA法检测小鼠血清中多糖抗体浓度
[0363] 分别配制13种不同血清型肺炎球菌多糖储备液1mg/ml(1×PBS溶液中)，存储于4℃冰箱。稀释待检血清型肺炎球菌多糖存储液至包被缓冲液2‐4μg/ml，加100μl包被溶液到每一个孔中来包被ELISA板，在室温下孵育过夜。用洗板缓冲液洗4次，加入100μl封闭缓冲液，在室温下孵育2小时，用洗板缓冲液洗4次，可在4℃下保存一周。
[0364] 将小鼠注射结合疫苗及对照样品获得的相应待测血清1:10稀释成工作样品血清，稀释适当倍数，加入到ELISA板第一排孔内，总体积200μl，从第一排开始向下进行二倍系列梯度稀释，在室温下孵育2小时。用洗板缓冲液洗4次，加入100μl碱性磷酸酶标记羊抗鼠抗体(1:2000稀释)，在室温下孵育4小时。用洗板缓冲液洗4次，加入100μl磷酸‐4‐硝基苯酯二钠盐底物溶液，在波长405nm处读数。
[0365] 小鼠血清中的特异性肺炎球菌血清型多糖抗体滴度结果如下表：
[0366]
[0367] 结果显示，用含有万能表位肽蛋白载体合成的结合疫苗，即以P2CRM197A作为蛋白载体的13价肺炎球菌荚膜多糖P2CRM197A结合物的免疫原性要优于13价肺炎球菌荚膜多糖CRM197A结合物。注射三针后的小鼠血清中抗特异性肺炎球菌多糖的IgG抗体浓度显着高于注射一针和二针的血清中IgG抗体浓度；注射三针后的各个血清型抗体浓度高于注射一针的4倍以上，符合WHO对于结合疫苗浓度提高的标准。与13价肺炎球菌荚膜多糖‐CRM197A物比较，13价肺炎球菌荚膜多糖‐P2CRM197A结合物的各个血清型抗体的浓度，在注射三针后，小鼠抗血清浓度更好。
[0368] 1‐5、调理吞噬试验(Opsonophagocytic Assay，OPA)
[0369] 调理吞噬试验是评价肺炎球菌多糖结合疫苗杀菌效力方法，根据UAB‐MOPA的“肺炎链球菌荚膜多糖特异性抗体多型调理吞噬杀菌试验方法”对获得的小鼠免疫血清进行试验。OPA浓度结果如下表：
[0370]
[0371] 试验结果可见，注射三针后的13价肺炎球菌多糖‐P2CRM197A结合物组的合并小鼠免疫血清和13价肺炎球菌多糖‐CRM197A结合物组的合并小鼠免疫血清比较，其抗体的OPA浓度有明显提高。
[0372] 2)其它13价肺炎球菌多糖CRM197A结合物免疫原性的评估
[0373] 和“13价肺炎球菌多糖P2CRM197A蛋白结合物的免疫原性的评估”节的方法相似，其它含有万能表位肽蛋白载体合成的结合物制备的疫苗的抗多糖抗体IgG浓度结果如下表，本表只是列出注射三针后的抗多糖IgG浓度。
[0374]
[0375]
[0376]
[0377] 从以上结果可见，所有含有万能表位肽CRM197A蛋白载体合成的13价肺炎球菌多糖结合物的免疫原性，与不含有万能表位肽CRM197蛋白载体合成的13价肺炎球菌多糖结合物比较，有明显的增强。含有两个相同的万能表位肽的CRM197A蛋白载体合成的13价肺炎球菌多糖CRM197结合物的免疫原性要高于只含有一个万能表位肽CRM197A蛋白载体合成的13价肺炎球菌多糖CRM197A结合物。将蛋白载体中的同种万能表位肽数量增加至三个时，与含有两个万能表位肽的蛋白载体合成的13价肺炎球菌多糖CRM197A结合物的免疫原性比较无明显变化。将蛋白载体中的万能表位肽数量加至N‐末端和加至C‐末端的13价肺炎球菌多糖CRM197A结合物免疫原性没有差别。而含有二种以上不同的万能表位肽的蛋白载体合成的13价肺炎球菌多糖CRM197A结合物的免疫原性进一步增强。
[0378] 2、流行性嗜血杆菌b型多糖CRM197A结合疫苗免疫原性的评估
[0379] 2‐1、流行性嗜血杆菌多糖CRM197A蛋白结合疫苗的制备
[0380] 将制备的Hib多糖与不含万能表位肽的CRM197A蛋白载体合成的结合物，以及六种含有万能表位肽的CRM197A蛋白载体合成的结合物配制成相应的注射用疫苗，方法如下：
[0381] 用Millipore的Labscale超滤系统将多糖蛋白结合物溶液浓缩至多糖浓度大约为25μg/ml，用0.22μm膜除菌过滤，加入无菌磷酸铝佐剂，最终浓度为125mg/ml，搅拌混匀，置于2‐8℃冰箱中储存待用。
[0382] 2‐2、免疫及疫苗免疫原性的评估
[0383] 用“13价肺炎球菌多糖CRM197A结合物免疫原性的评估”相似的方法进行动物注射，采血，ELISA法检测血清中抗Hib多糖抗体浓度，结果如下表：
[0384]
[0385] 从以上Hib多糖抗体浓度可见，和流行性嗜血杆菌b型多糖CRM197A结合物的结果相似，和不含有万能表位肽蛋白载体合成的Hib‐CRM197A多糖结合物比较，其它六个含有万能表位肽的蛋白载体CRM197A合成的Hib多糖结合物，Hib‐P2CRM197A、Hib‐P2CRM197A P2、Hib‐P30CRM197A、Hib‐OVApCRM197A、Hib‐P30CRM197A P2、以及Hib‐P2P30CRM197AOVAp的抗体IgG浓度显着提高(第三针血清和第一针血清中抗体浓度比较，p＜0.05)。
[0386] 3、4价流行性脑膜炎球菌CRM197A结合物免疫原性的评估
[0387] 3‐1、4价流行性脑膜炎球菌多糖‐P2CRM197A结合疫苗(称为4Men‐P2CRM197A)的制备
[0388] 用Millipore的Labscale超滤系统将制备的MenA‐P2CRM197A、MenC‐P2CRM197A、MenY‐P2CRM197A、以及MenW135‐P2CRM197A结合物溶液浓缩至多糖浓度大约为1000μg/ml，然后用0.85％的NaCl溶液稀释并混合至每个群多糖浓度为100μg/ml的4Men‐P2CRM197A结合疫苗，用0.22μm膜除菌过滤，加入无菌磷酸铝佐剂，最终浓度为125mg/ml，置于2‐8℃冰箱中储存待用。
[0389] 3‐2、免疫及疫苗免疫原性的评估
[0390] 和与13价肺炎球菌多糖P2CRM197A结合疫苗相似的注射和采血程序获得免疫血清。每只小鼠注射0.1ml，多糖注射量为10μg/小鼠/次。用ELISA法检测血清中抗各群多糖的抗体浓度，结果如下表：
[0391]
[0392]
[0393]
[0394] 从以上各群流脑多糖抗体浓度可见，和13价肺炎球菌多糖结合物和流行性嗜血杆菌b型物的结果相似，和不含有万能表位肽蛋白载体合成的4价流行性脑膜炎多糖CRM197A结合物比较，含有万能表位肽的4价流行性脑膜炎多糖CRM197A结合物，多糖特异性抗体IgG浓度显着提高(第三针血清和第一针血清中抗体浓度比较，p＜0.05)。
[0395] 实施例2：含有万能表位肽的轮状病毒表面蛋白VP8(简称CoreVP8)蛋白载体结合物合成及免疫原性的评估
[0396] 一、CoreVP8蛋白载体和含有万能表位肽的CoreVP8蛋白载体氨基酸序列的设计[0397] 1、CoreVP8蛋白载体氨基酸序列的设计
[0398] 轮状病毒根据病毒抗原性的不同可分成不同的型，亚型和血清型。现已发现有7个血清型(A型‐G型)，大多数人类病原体属于A、B和C型。不同的轮状病毒表面壳蛋白VP7和VP4的中和抗原簇有所不同，能够独立地诱导各自的中和性抗体，病毒的血清型可由VP4和VP7抗原的特异性决定。A型轮状病毒根据VP7和VP4的不同可进一步分类成G血清型和P血清型。VP4是一种能够被胰蛋白酶切断成两个不同的病毒蛋白，即VP8和VP5病毒蛋白。研究表明，VP5是一种氨基酸序列比较稳定的蛋白，而VP8蛋白的氨基酸序列变异性大，是决定P血清型的蛋白；因此，通过用VP8表面蛋白作为抗原来免疫动物，将获得保护性更为广泛的抗体。本发明将采用VP8蛋白作为多糖‐蛋白结合物的载体蛋白，以结合物中的VP8载体蛋白部分产生的抗体来使得接种的人类免疫轮状病毒的感染。
[0399] 轮状病毒毒株Wa的P血清型属P1A[8]，占引发人类疾病的流行毒株中总数的90％。本发明以Wa的VP4的亚单位VP8蛋白基因为基础进行修饰，克隆，表达，纯化来制备结合疫苗的蛋白载体。
[0400] 人类轮状病毒株Wa的VP8蛋白由247个氨基酸组成，分子量为32,000道尔顿。其氨基酸序列如下：
[0401] MASLIYRQLLSNSYVTNISDEVNEIGTKKTTNVTVNPGPFAQTGYAPVDWGHGELPDSTLVQPTLDGPYQPTSLNLPVDYWMLIAPTREGKVAEGTNTTDRWFACVLVEPNVQNTQRQYVLDGRNVQLNVSNESRTSWKFILFIKLTPDGTYTQYSTLSTPHKLCAWMKRDNRVYWYQGATPNASESYYLTINNDNSNVSSDAEFYLIPQSQTAMCTQYINNGLPPIQNTRNIVPVNITSRQIKDIR
[0402] VP8病毒蛋白是轮状病毒的壳蛋白，属于结构蛋白，全长VP8蛋白在水溶液中的可溶性差。如果以此蛋白作为结合物合成用的载体蛋白，会使得纯化过程困难，结合物合成产量低。为了解决这一问题，可将全VP8蛋白基因进行选择性地剪切，克隆成不同长度的VP8片段，可以提高剪切后的VP8蛋白的水溶性；不过，这种剪切是以保存VP8蛋白的主要表位肽为前提。VP8的剪切点可以在蛋白的N‐末端，或C‐末端，也可以同时在两个末端进行剪切。本发明优先选择的是在N‐末端和C‐末端同时剪切，即在N‐末端的64位前，和C‐末端的223位后进行剪切。剪切后获得的VP8蛋白具有160个氨基酸，实验显示，这一多肽片段是轮状病毒吸附于宿主细胞受体的区域，宿主细胞表面唾液酸被认为是VP8蛋白吸附的受体成分，这一剪切后的VP8蛋白多肽片段被称作核VP8，其分子量为28KD，氨基酸序列如下：
[0403] LDGPYQPTSLNLPVDYWMLIAPTREGKVAEGTNTTDRWFACVLVEPNVQNTQRQYVLDGRNVQLNVSNESRTSWKFILFIKLTPDGTYTQYSTLSTPHKLCAWMKRDNRVYWYQGATPNASESYYLTINNDNSNVSSDAEFYLIPQSQTAMCTQYINNGL
[0404] 试验结果表明，核VP8蛋白多肽水溶性强，易于纯化，并且，作为结合物合成的蛋白载体合成的结合物产量高。
[0405] 2、带有万能表位肽的CoreVP8蛋白载体氨基酸序列的设计
[0406] 将万能表位肽连接至CoreVP8蛋白载体上，构建出一种新的多糖蛋白质结合物的蛋白载体。所用的万能表位肽可连接至CoreVP8蛋白载体的N‐末端或C‐末端；也可将两个不同的万能表位肽分别连接至CoreVP8蛋白载体的N‐末端或C‐末端；另一种方式是将两个万能表位肽自身连接，然后再连接至CoreVP8蛋白载体的N‐末端或者C‐末端。
[0407] 由于设计含有万能表位肽的蛋白载体和含有万能表位肽的CRM197A蛋白载体相同，本发明以几种代表性含有万能表位肽的CoreVP8蛋白载体进行设计加以说明。但不限于以下举例。
[0408] 2‐1、含有万能表位肽P2的CoreVP8蛋白载体氨基酸序列的设计
[0409] 2‐1‐1、P2‐N‐末端CoreVP8蛋白载体(称为P2CoreVP8)氨基酸序列的设计[0410] 通过将P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL加入至CoreVP8的N‐末端，形成一个新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0411] QYIKANSKFIGITELGSGSGLDGPYQPTSLNLPVDYWMLIAPTREGKVAEGTNTTDRWFACVLVEPNVQNTQRQYVLDGRNVQLNVSNESRTSWKFILFIKLTPDGTYTQYSTLSTPHKLCAWMKRDNRVYWYQGATPNASESYYLTINNDNSNVSSDAEFYLIPQSQTAMCTQYINNGL
[0412] 在P2氨基酸序列和CoreVP8蛋白载体的N‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P2CoreVP8蛋白载体。
[0413] 2‐1‐2、P2‐N‐末端CoreVP8C‐末端‐P2蛋白载体(称为P2CoreVP8P2)氨基酸序列的设计
[0414] 通过将两个P2表位肽分别连接至CoreVP8蛋白载体的N‐末端和C‐末端，形成了一种新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0415] QYIKANSKFIGITELGSGSGLDGPYQPTSLNLPVDYWMLIAPTREGKVAEGTNTTDRWFACVLVEPNVQNTQRQYVLDGRNVQLNVSNESRTSWKFILFIKLTPDGTYTQYSTLSTPHKLCAWMKRDNRVYWYQGATPNASESYYLTINNDNSNVSSDAEFYLIPQSQTAMCTQYINNGLGSGSGQYIKANSKFIGITEL
[0416] 在P2氨基酸序列和CoreVP8蛋白载体的N‐末端，及C‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P2CoreVP8P2蛋白载体。
[0417] 2‐2、含有万能表位肽P30的CoreVP8的氨基酸序列的设计
[0418] 2‐2‐1、P30‐N‐末端CoreVP8蛋白载体(称为P30CoreVP8)氨基酸序列的设计[0419] 通过将P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE加入至CoreVP8的N‐末端，形成一个新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0420] FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGLDGPYQPTSLNLPVDYWMLIAPTREGKVAEGTNTTDRWFACVLVEPNVQNTQRQYVLDGRNVQLNVSNESRTSWKFILFIKLTPDGTYTQYSTLSTPHKLCAWMKRDNRVYWYQGATPNASESYYLTINNDNSNVSSDAEFYLIPQSQTAMCTQYINNGL
[0421] 在P30氨基酸序列和CoreVP8蛋白载体的N‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P30CoreVP8蛋白载体。
[0422] 2‐3、含有万能表位肽OVAp的CoreVP8的氨基酸序列设计
[0423] 2‐3‐1、OVAp‐N‐末端CoreVP8蛋白载体(称为OVApCoreVP8)氨基酸序列的设计[0424] 通过将OVAp氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR加入至CoreVP8的N‐末端，形成一个新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0425] ISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGLDGPYQPTSLNLPVDYWMLIAPTREGKVAEGTNTTDRWFACVLVEPNVQNTQRQYVLDGRNVQLNVSNESRTSWKFILFIKLTPDGTYTQYSTLSTPHKLCAWMKRDNRVYWYQGATPNASESYYLTINNDNSNVSSDAEFYLIPQSQTAMCTQYINNGL
[0426] 在OVAp氨基酸序列和CoreVP8的N‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为OVApCoreVP8蛋白载体。
[0427] 2‐4、含有两个以上的万能表位肽的CoreVP8的氨基酸序列设计
[0428] 2‐4‐1、P30‐N‐末端CoreVP8C‐末端‐P2蛋白载体(称为P30CoreVP8P2)的氨基酸序列设计
[0429] 通过将P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE和P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL分别加入至CoreVP8蛋白载体的N‐末端和C‐末端，形成一个新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0430] FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGLDGPYQPTSLNLPVDYWMLIAPTREGKVAEGTNTTDRWFACVLVEPNVQNTQRQYVLDGRNVQLNVSNESRTSWKFILFIKLTPDGTYTQYSTLSTPHKLCAWMKRDNRVYWYQGATPNASESYYLTINNDNSNVSSDAEFYLIPQSQTAMCTQYINNGLGSGSGQYIKANSKFIGITEL
[0431] 在P30和P2氨基酸序列和CoreVP8蛋白的N‐末端和C‐末端间分别插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P30CoreVP8P2蛋白载体。
[0432] 2‐4‐2、P2P30‐N‐末端CoreVP8C‐末端‐OVAp蛋白载体(称为P2P30CoreVP8OVAp)的氨基酸序列设计
[0433] 通过将P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL和P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE连接，然后加入至CoreVP8蛋白载体的N‐末端；将OVAp氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR加入至CoreVP8蛋白载体C‐末端，形成一个新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0434] QYIKANSKFIGITELGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGLDGPYQPTSLNLPVDYWMLIAPTREGKVAEGTNTTDRWFACVLVEPNVQNTQRQYVLDGRNVQLNVSNESRTSWKFILFIKLTPDGTYTQYSTLSTPHKLCAWMKRDNRVYWYQGATPNASESYYLTINNDNSNVSSDAEFYLIPQSQTAMCTQYINNGLGSGSGISQAVHAAHAEINEAGR
[0435] 在P2和P30氨基酸序列之间，CoreVP8蛋白载体的N‐末端和C‐末端间，以及OVAp和CoreVP8蛋白载体的N‐末端之间分别插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P2P30CoreVP8OVAp蛋白载体。
[0436] 二、CoreVP8蛋白载体和含有万能表位肽的CoreVP8蛋白载体表达质粒的构建[0437] 1、CoreVP8蛋白载体表达质粒的构建
[0438] 从GenBank获取人类轮状病毒Wa株完整的氨基酸序列GenBank：AGI04377，确定CoreVP8蛋白片段。据此片段，将其N‐末端和C‐末端切除部分氨基酸序列，获得CoreVP8氨基酸序列。以此为依据，对该片段的氨基酸的核酸序列进行优化，以便在大肠杆菌表达系统中高效表达。
[0439] 采用自制的表达质粒，用Nde I酶识别质粒位点CATATG，Bam HI酶识别位点GGATCC。经过CoreVP8蛋白基因序列进行分析，在序列内，无Nde I及Bam HI酶切位点。CoreVP8蛋白基因合成序列如下：
[0440] CATATG
[0441] TGGATGGTCC GTATCAACCG ACGACGTTTA CCCCGCCGAA CGATTATTGG ATTCTGATCA ACTCAAATAC GAACGGCGTG GTTTACGAAA GTACCAACAA TTCCGATTTC TGGACGGCGG
[0442] TCGTGGCCAT CGAACCGCAT GTTAATCCGG CGACCGCCA GTATACCATT TTTGGTGAAA[0443] T GCAAACAATT CAATGTCAGC AACGACTCTA ATAAATGGAA GTTTCTGGAA ATGTTCCGTA[0444] GCTCTAGTCA GAACGAATTT TATAATCGTC GCACCCTGAC GTCTGATACC CGTCTGGTGG[0445] GCATCCTGAA GTACGGCGGT CGCGTTTGGA CCTTCCATGG TGAAACGCCG CGTGCAACCA[0446] CGGACTCCTC ATCGACCGCG AACCTGAACA ATATTTCAAT CACGATTCAC CACGATTCAC[0447] CACGATTCAC TCGGAATTTT ACATCATCCC GCGTAGCCAG GAAAGCAAAT GCAACGAATA[0448] CATCAATAAT GGTCTGTGAT AA
[0449] GGATCC
[0450] 将空白质粒和合成的CoreVP8蛋白基因的PCR产物中，分别加入Nde I酶和Bam HI酶进行双酶切反应；纯化后，在连接体系中加入T4连接酶进行连接，完成后纯化表达质粒，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化至细胞内，筛选克隆，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。获得阳性表达工程菌后，建立种子库，包括主种子和工作种子。储存于‐20℃以下冰箱中。
[0451] 2、含有万能表位肽的CoreVP8蛋白载体表达质粒的构建
[0452] 为了说明用含有万能表位肽的CoreVP8蛋白载体合成多糖蛋白结合物的免疫原性增强效果，设计了六种含有万能表位肽的CoreVP8蛋白载体为例。
[0453] 2‐1、P2CoreVP8蛋白载体表达质粒的构建
[0454] 采用自制的表达质粒，用Nde I酶识别质粒位点CATATG，Bam HI酶识别位点GGATCC。经过P2CoreVP8蛋白基因序列进行分析，在序列内，无Nde I及Bam HI酶切位点。P2CoreVP8基因合成全序列如下：
[0455] CATATG
[0456] CAGTACATTA AAGCAAACTC AAAATTCATT GGCATTACCG AACTGGGCTC AGGCTCAGGT[0457] TGGATGGTC CGTATCAACC GACGACGTTT ACCCCGCCGA ACGATTATTG GATTCTGATC[0458] ACTCAAATA CGAACGGCGT GGTTTACGAA AGTACCAACA ATTCCGATTT CTGGACGGCG[0459] GTCGTGGCCA TCGAACCGCA TGTTAATCCG GTCGACCGCC AGTATACCAT TTTTGGTGAA[0460] AGCAAACAAT TCAATGTCAG CAACGACTCT AATAAATGGA AGTTTCTGGA AATGTTCCGT[0461] AGCTCTAGTC AGAACGAATT TTATAATCGT CGCACCCTGA CGTCTGATAC CCGTCTGGTG[0462] GGCATCCTGA AGTACGGCGG TCGCGTTTGG ACCTTCCATG GTGAAACGCC GCGTGCAACC[0463] ACGGACTCCT CATCGACCGC GAACCTGAAC AATATTTCAA TCACGATTCA CTCGGAATTT[0464] TACATCATCC CGCGTAGCCA GGAAAGCAAA TGCAACGAAT ACATCAATAA TGGTCTGTGA[0465] GGATCC
[0466] 将空白质粒和合成的P2CoreVP8蛋白基因的PCR产物中，分别加入Nde I酶和Bam HI酶进行双酶切反应；纯化后，在连接体系中加入T4连接酶进行连接，完成后纯化表达质粒，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化至细胞内，筛选克隆，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。获得阳性表达工程菌后，建立种子库，包括主种子和工作种子。储存于‐20℃以下冰箱中。
[0467] 2‐2、P2CoreVP8P2蛋白载体表达质粒的构建
[0468] 方法和上节“2‐1、P2CoreVP8蛋白载体表达质粒的构建”节相同。
[0469] 2‐3、P30CoreVP8蛋白表达质粒的构建：
[0470] 采用自制的表达质粒，用Nde I酶识别质粒位点CATATG，Bam HI酶识别位点GGATCC。经过P30CoreVP8的基因序列进行分析，在序列内，无Nde I及Bam HI酶切位点。P30CoreVP8基因合成全序列如下：
[0471] CATATG
[0472] TTCAATAATT TTACGGTGTC GTTTTGGCTG CGTGTGCCGA AAGTGTCTGC CTCCCATCTG[0473] GAAGGTTCTG GTTCAGGTCT GGACGGTCCG TATCAGCCGA CCACGTTTAC CCCGCCGAAC[0474] GATTACTGGA TTCTGATCAA CAGCAATACG AACGGCGTGG TTTATGAATC AACCAACAAT[0475] TCGGATTTCT GGACGGCGGT CGTGGCCATC GAACCGCATG TTAATCCGGT CGACCGCCAG[0476] TACACCATCT TCGGTGAATC AAAACAATTC AACGTCAGCA ACGACTCTAA CAAATGGAAA[0477] TTCCTGGAAA TGTTCCGTAG CTCTAGTCAG AACGAATTTT ATAATCGTCG CACCCTGACG[0478] TCCGATACCC GTCTGGTGGG CATCCTGAAA TACGGCGGTC GCGTTTGGAC CTTCCATGGT[0479] GAAACGCCGC GTGCAACCAC GGACTCCTCA TCGACCGCGA ACCTGAACAA TATTAGCATC[0480] ACGATCCACT CTGAATTCTA CATCATCCCG CGCAGTCAAG AATCCAAATG CAACGAATAC[0481] ATCAACAATG GCCTGTAA
[0482] GGATCC
[0483] 将空白质粒和合成的P30CoreVP8蛋白基因的PCR产物中，分别加入Nde I酶和Bam HI酶进行双酶切反应；纯化后，在连接体系中加入T4连接酶进行连接，完成后纯化表达质粒，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化至细胞内，筛选克隆，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。获得阳性表达工程菌后，建立种子库，包括主种子和工作种子。储存于‐20℃以下冰箱中。
[0484] 2‐4、OVApCoreVP8蛋白表达质粒的构建：
[0485] 采用自制的表达质粒，用Nde I酶识别质粒位点CATATG，Bam HI酶识别位点GGATCC。经过OVApCoreVP8的基因序列进行分析，在序列内，无Nde I及Bam HI酶切位点。OVApCoreVP8基因合成全序列如下：
[0486] CATATG
[0487] ATCAGCCAAG CGGTTCACGC AGCCCACGCC GAAATTAACG AAGCGGGTCG CGGTAGCGGT[0488] TCTGGCCTGG ATGGTCCGTA TCAACCGACG ACGTTTACCC CGCCGAACGA TTATTGGATT[0489] CTGATCAACT CAAATACGAA CGGCGTGGTT TACGAAAGTA CCAACAATTC CGATTTCTGG[0490] ACGGCGGTCG TGGCCATCGA ACCGCATGTT AATCCGGTCG ACCGCCAGTA TACCATTTTT[0491] GGTGAAAGCA AACAATTCAA TGTCAGCAAC GACTCTAATA AATGGAAGTT TCTGGAAATG[0492] TTCCGTAGCT CTAGTCAGAA CGAATTTTAT AATCGTCGCA CCCTGACGTC TGATACCCGT[0493] CTGGTGGGCA TCCTGAAGTA CGGCGGTCGC GTTTGGACCT TCCATGGTGA AACGCCGCGT[0494] GCAACC ACG GACTCCTCAT CGACCGCGAA CCTGAACAAT ATTTCAATCA CGATTCACTC[0495] GGAATTTTAC ATCATCCCGC GTAGCCAGGA AAGCAAATGC AACGAATACA TCAATAATGG[0496] TCTGTGATAA
[0497] GGATCC
[0498] 将空白质粒和合成的OVApCoreVP8基因的PCR产物中，分别加入Nde I酶和Bam HI酶进行双酶切反应；纯化后，在连接体系中加入T4连接酶进行连接，完成后纯化表达质粒，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化至细胞内，筛选克隆，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。获得阳性表达工程菌后，建立种子库，包括主种子和工作种子。储存于‐20℃以下冰箱中。
[0499] 2‐5、P30CoreVP8P2蛋白表达质粒的构建
[0500] 采用自制的表达质粒，用Nde I酶识别质粒位点CATATG，Bam HI酶识别位点GGATCC。经过P30CoreVP8P2的基因序列进行分析，在序列内，无Nde I及Bam HI酶切位点。P30CoreVP8P2基因合成全序列如下：
[0501] CATATG
[0502] ATCAGCCAAG CGGTTCACGC AGCCCACGCC GAAATTAACG AAGCGGGTCG CGGTAGCGGT[0503] TCTGGCCTGG ATGGTCCGTA TCAACCGACG ACGTTTACCC CGCCGAACGA TTATTGGATT[0504] CTGATCAACT CAAATACGAA CGGCGTGGTT TACGAAAGTA CCAACAATTC CGATTTCTGG[0505] ACGGCGGTCG TGGCCATCGA ACCGCATGTT AATCCGGTCG ACCGCCAGTA TACCATTTTT[0506] GGTGAAAGCA AACAATTCAA TGTCAGCAAC GACTCTAATA AATGGAAGTT TCTGGAAATG[0507] TTCCGTAGCT CTAGTCAGAA CGAATTTTAT AATCGTCGCA CCCTGACGTC TGATACCCGT[0508] CTGGTGGGCA TCCTGAAGTA CGGCGGTCGC GTTTGGACCT TCCATGGTGA AACGCCGCGT[0509] GCAACC ACG GACTCCTCAT CGACCGCGAA CCTGAACAAT ATTTCAATCA CGATTCACTC[0510] GGAATTTTAC ATCATCCCGC GTAGCCAGGA AAGCAAATGC AACGAATACA TCAATAATGG[0511] TCTGTGATAA GGCTCAGGCT CAGGTCAGTA CATTAAAGCA AACTCAAAAT TCATTGGCAT[0512] TACCGAACTG
[0513] GGATCC
[0514] 将空白质粒和合成的P30CoreVP8P2蛋白基因的PCR产物中，分别加入NdeI酶和Bam HI酶进行双酶切反应；纯化后，在连接体系中加入T4连接酶进行连接，完成后纯化表达质粒，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化至细胞内，筛选克隆，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。获得阳性表达工程菌后，建立种子库，包括主种子和工作种子。储存于‐20℃以下冰箱中。
[0515] 2‐6、P2P30CoreVP8OVAp蛋白表达质粒的构建
[0516] 采用自制的表达质粒，用Nde I酶识别质粒位点CATATG，Bam HI酶识别位点GGATCC。经过P2P30CoreVP8OVAp的基因序列进行分析，在序列内，无NdeI及Bam HI酶切位点。P2P30CoreVP8OVAp基因合成全序列如下：
[0517] CATATG
[0518] CAGTACATTA AAGCAAACTC AAAAT TCAT TGGCATTACC GAACTGGGTA GCGGTTCTGG[0519] CATCAGCCAA GCGGTTCACG CAGCCCACGC CGAAATTAAC GAAGCGGGTC GCGGTAGCGG[0520] TTCTGGCCTG GATGGTCCGT ATCAACCGAC GACGTTTACC CCGCCGAACG ATTATTGGAT[0521] TCTGATCAAC TCAAATACGA ACGGCGTGGT TTACGAAAGT ACCAACAATT CCGATTTCTG[0522] GACGGCGGTC GTGGCCATCG AACCGCATGT TAATCCGGTC GACCGCCAGT ATACCATTTT[0523] TGGTGAAAGC AAACAATTCA ATGTCAGCAA CGACTCTAAT AAATGGAAGT TTCTGGAAAT[0524] GTTCCGTAGC TCTAGTCAGA ACGAATTTTA TAATCGTCGC ACCCTGACGT CTGATACCCG[0525] TCTGGTGGGC ATCCTGAAGT ACGGCGGTCG CGTTTGGACC TTCCATGGTG AAACGCCGCG[0526] TGCAACCACG GACTCCTCAT CGACCGCGAA CCTGAACAAT ATTTCAATCA CGATTCACTC[0527] GGAATTTTAC ATCATCCCGC GTAGCCAGGA AAGCAAATGC AACGAATACA TCAATAATGG[0528] TCTGTGATAA GGCTCAGGCT CAGGTATCAG CCAAGCGGTT CACGCAGCCC ACGCCGAAAT[0529] TAACGAAGCG GGTCGC
[0530] GGATCC
[0531] 将空白质粒和合成的P2P30CoreVP8OVAp基因的PCR产物中，分别加入Nde I酶和Bam HI酶进行双酶切反应；纯化后，在连接体系中加入T4连接酶进行连接，完成后纯化表达质粒，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化至细胞内，筛选克隆，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。获得阳性表达工程菌后，建立种子库，包括主种子和工作种子。储存于‐20℃以下冰箱中。
[0532] 三、含有万能表位肽CoreVP8蛋白载体和CoreVP8蛋白载体的制备
[0533] 实验结果表明，CoreVP8蛋白载体和含有万能表位肽的CoreVP8蛋白载体的特性相似；因此，这些蛋白载体的纯化方法相似，以下以含有万能表位肽的CoreVP8蛋白载体为例说明方法。
[0534] 1、表达含有万能表位肽的CoreVP8蛋白载体工程菌的制备
[0535] 用分子生物学标准方法将各个表达蛋白载体的质粒转入至感受态细胞内，并进行表达检定。筛选出蛋白表达量高，并且通过用抗血清检定合格的克隆，建立主种子库和工作种子库。
[0536] 2、含有万能表位肽的CoreVP8蛋白载体表达工程菌的发酵
[0537] 从大肠杆菌工程菌工作种子库低温冰箱中，取出一表达特定含有万能表位肽的CoreVP8蛋白载体的工作种子管，在室温下解冻；将种子管中的菌液无菌转移至50毫升的培养基中，在37℃，摇速为180rpm的摇床中培养至OD600＝1.0左右；将菌液无菌接种至1升的培养基中，在37℃，摇速为180rpm的摇床中培养至OD600＝1.0左右；接种种子液至50‐升发酵罐中的20升培养基中，在37℃下，240rpm条件下进行发酵，当OD600至7‐8时，加入IPTG诱导重组蛋白在细菌中合成；发酵至14小时后，停止发酵，离心，收集菌体待用。
[0538] 3、含有万能表位肽的CoreVP8蛋白载体的纯化
[0539] 由于构建含有不同万能表位肽的蛋白载体都是以CoreVP8为主体，实验表明，尽管加入了万能表位肽，但对CoreVP8蛋白纯化的参数影响不大，只需要在纯化CoreVP8蛋白载体的工艺参数上进行一些修饰，就可建立起其他含有万能表位肽的CoreVP8蛋白载体的纯化方法。
[0540] 称重50g湿菌体于2‐升离心杯中，加入300ml1xPBS pH7.0缓冲液混悬菌体，在磁力搅拌器上搅拌混匀30min；在4℃下，4000rpm，离心20min，弃上清，收集菌体；重复该步骤两次；加入300ml1xPBS pH7.0至菌体离心管，在均质机上进行破碎；在4℃下，10000rpm，离心20min；收集沉淀，弃上清液；加入300ml1xPBS pH7.0缓冲液，在磁力搅拌器上搅拌30min；在
4℃下，4000rpm，离心20min；弃上清液，收集包涵体，加入900ml变性缓冲液至洗涤后的包涵体，在25℃下，10000rpm离心30min，收集上清液，弃沉淀；将离心上清液转移至6‐8KD透析袋中，封闭透析袋；置透析袋于10升复性缓冲液1中，室温下，在磁力搅拌器上搅拌透析过夜；
次日将透析袋转入10升复性缓冲液2中，室温搅拌透析8‐10小时；将透析袋转入10升复性缓冲液3中，室温搅拌透析过夜；次日将透析袋转入10升复性缓冲液4中，室温搅拌透析8‐10小时；将透析袋转入10升复性缓冲液5中，室温搅拌透析过夜；次日将透析袋转入2升储备缓冲液中，室温搅拌透析8‐10小时；更换储备缓冲液二次，室温透析过夜；取1ml透析液，室温
12000rpm离心10min，收集上清，测蛋白质浓度；将蛋白溶液上样至预先平衡的DEAE‐Sepharose胶柱，用等梯度洗脱，并收集目的蛋白峰；然后上样至Q Sepharose柱进一步纯化，收集洗脱峰；最后上样SP胶柱，收集洗脱峰；将收集获得的纯化目的蛋白转至透析袋中，在0.15M的氯化钠中透析，完成后转移至4℃下储存待用。
4℃下，4000rpm，离心20min；弃上清液，收集包涵体，加入900ml变性缓冲液至洗涤后的包涵体，在25℃下，10000rpm离心30min，收集上清液，弃沉淀；将离心上清液转移至6‐8KD透析袋中，封闭透析袋；置透析袋于10升复性缓冲液1中，室温下，在磁力搅拌器上搅拌透析过夜；
次日将透析袋转入10升复性缓冲液2中，室温搅拌透析8‐10小时；将透析袋转入10升复性缓冲液3中，室温搅拌透析过夜；次日将透析袋转入10升复性缓冲液4中，室温搅拌透析8‐10小时；将透析袋转入10升复性缓冲液5中，室温搅拌透析过夜；次日将透析袋转入2升储备缓冲液中，室温搅拌透析8‐10小时；更换储备缓冲液二次，室温透析过夜；取1ml透析液，室温
12000rpm离心10min，收集上清，测蛋白质浓度；将蛋白溶液上样至预先平衡的DEAE‐Sepharose胶柱，用等梯度洗脱，并收集目的蛋白峰；然后上样至Q Sepharose柱进一步纯化，收集洗脱峰；最后上样SP胶柱，收集洗脱峰；将收集获得的纯化目的蛋白转至透析袋中，在0.15M的氯化钠中透析，完成后转移至4℃下储存待用。
[0541] 四、多糖CoreVP8结合物的制备
[0542] 用三种结合物合成方法，即还原胺法，CDAP法(1‐(3‐二甲基氨基丙基)‐3‐乙基碳化二亚胺盐酸盐法)和ADH法(己二酰二肼法)，来合成多糖CoreVP8结合物。不同细菌多糖结构中含有不同的基团，采用不同的合成方法合成的结合物的产量和免疫原性有所不同。为显示含有万能表位肽蛋白载体对不同细菌多糖蛋白结合物的免疫原性的影响，本发明合成了13价肺炎球菌多糖CoreVP8结合物，流行性嗜血杆菌b型多糖CoreVP8结合物，以及4价流行性脑膜炎球菌多糖CoreVP8结合物。
[0543] 1、13价肺炎球菌多糖CoreVP8蛋白结合物(含有万能表位肽和不含万能表位肽)的制备
[0544] 采用了六种含有万能表位肽的CoreVP8蛋白载体来合成13价肺炎球菌多糖结合物，包括P2CoreVP8、P2CoreVP8P2、P30CoreVP8、OVApCoreVP8、P30CoreVP8P2、以及P2P30CoreVP8OVAp，来合成相应的13价肺炎球菌多糖结合疫苗：13Pn‐P2CoreVP8、13Pn‐P2CoreVP8P2、13Pn‐P30CoreVP8、13Pn‐OVApCoreVP8、13Pn‐P30CoreVP8P2、以及13Pn‐P2P30CoreVP8OVAp。这些结合物的合成方法和“13价肺炎球菌多糖CRM197A结合疫苗制备”方法相似。
[0545] 2、流行性嗜血杆菌b型多糖CoreVP8蛋白结合物(含有万能表位肽和不含万能表位肽)的制备
[0546] 采用六种含有万能表位肽的CoreVP8蛋白载体来合成流行性嗜血杆菌b型多糖结合物，包括P2CoreVP8、P2CoreVP8P2、P30CoreVP8、OVApCoreVP8、P30CoreVP8P2、以及P2P30CoreVP8OVAp，来合成相应的流行性嗜血杆菌b型多糖结合物：Hib‐P2CoreVP8、Hib‐P2CoreVP8P2、Hib‐P30CoreVP8、Hib‐OVApCoreVP8、Hib‐P30CoreVP8P2、Hib‐P2P30CoreVP8OVAp以及对照样品Hib‐CoreVP8。这些结合物的合成方法和“流行性嗜血杆菌b型多糖CoreVP8结合疫苗的制备”方法相似。
[0547] 3、4价流行性脑膜炎球菌多糖CoreVP8蛋白结合物(含有万能表位肽和不含万能表位肽)的制备
[0548] 采用六种含有万能表位肽的CoreVP8蛋白载体来合成4价流行性脑膜炎球菌多糖结合疫苗，包括P2CoreVP8、P2CoreVP8P2、P30CoreVP8、OVApCoreVP8、P30CoreVP8P2、以及P2P30CoreVP8OVAp，来合成相应的流行性脑膜炎球菌多糖结合疫苗：4Men‐P2CoreVP8、4Men‐P2CoreVP8P2、4Men‐P30CoreVP8、4Men‐OVApCoreVP8、4Men‐P30CoreVP8P2、4Men‐P2P30CoreVP8OVAp以及对照样品4Men‐CoreVP8。这些结合物的合成方法和“4价流行性脑膜炎球菌多糖CoreVP8结合疫苗的制备”方法相似。
[0549] 五、多糖CoreVP8结合疫苗的免疫原性的评估
[0550] 1、13价肺炎球菌多糖CoreVP8蛋白结合疫苗免疫原性的评估
[0551] 用和“13价肺炎球菌多糖P2CRM197A蛋白结合疫苗的免疫原性的评估”相似的方法进行实验，结合疫苗的抗多糖抗体IgG浓度结果如下表，本表只是列出注射三针后的抗多糖IgG浓度。
[0552]
[0553] 从上表可见，所有含有万能表位肽蛋白载体合成的13价肺炎球菌多糖CoreVP8结合物的免疫原性，和不含有万能表位肽蛋白载体合成的13价肺炎球菌多糖CoreVP8结合物比较，有明显的增强。含有两个相同的万能表位肽蛋白载体合成的13价肺炎球菌多糖CoreVP8结合物的免疫原性要强于只含有一个万能表位肽蛋白载体合成的13价肺炎球菌多糖CoreVP8结合物。而含有二种以上不同的万能表位肽以上的蛋白载体合成的13价肺炎球菌多糖CoreVP8结合物的免疫原性进一步增加。
[0554] 2、Hib‐CoreVP8结合疫苗免疫原性的评估
[0555] 用和“流行性嗜血杆菌b型P2CRM197A蛋白结合疫苗的免疫原性的评估”相似的方法进行实验，用ELISA法检测血清中抗Hib多糖抗体浓度，结果如下表：
[0556]
[0557] 从以上Hib多糖抗体浓度可见，和流行性嗜血杆菌b型多糖CoreVP8结合物的结果相似，和不含有万能表位肽蛋白载体合成的Hib‐CoreVP8多糖结合物比较，其它六个含有万能表位肽的蛋白载体CoreVP8合成的Hib多糖结合物，Hib‐P2CoreVP8、Hib‐P2CoreVP8P2、Hib‐P30CoreVP8、Hib‐OVApCoreVP8、Hib‐P30CoreVP8P2、以及Hib‐P2P30CRM197AOVAp，的抗体IgG浓度显着提高(第三针血清和第一针血清中抗体浓度比较，p＜0.05)。
[0558] 3、4价流行性脑膜炎球菌多糖结合疫苗免疫原性的评估
[0559] 与13价肺炎球菌多糖P2CRM197A结合疫苗相似的注射和采血程序获得免疫血清。每只小鼠注射0.1ml，多糖注射量为10μg/小鼠/次。用ELISA法检测血清中抗各群多糖的抗体浓度，结果如下表：
[0560]
[0561]
[0562]
[0563] 从以上多糖抗体浓度可见，和13价肺炎球菌多糖结合物和流行性嗜血杆菌b型物的结果相似，和不含有万能表位肽蛋白载体合成的4价流行性脑膜炎球菌多糖CoreVP8结合物比较，含有万能表位肽的4价流行性脑膜炎球菌多糖CoreVP8结合物，多糖抗体的IgG浓度显着提高(第三针血清和第一针血清中抗体浓度比较，p＜0.05)。
[0564] 实施例3：含有万能表位肽的白喉毒素变异体H21G蛋白A链(简称H21G)蛋白载体结合物合成及免疫原性的评估
[0565] 一、H21G蛋白载体和含有万能表位肽的H21G蛋白载体氨基酸序列的设计[0566] 1、H21G蛋白载体的氨基酸序列的设计
[0567] H21G蛋白载体是用基因重组技术，将白喉毒素的A链上的第21位的组氨酸(Histidine，H)修饰成甘氨酸(Glycine，G)。修饰后的白喉毒素变异体的A链，和白喉毒素变异体CRM197相似，仍然保持有白喉毒素的免疫学特性，抗白喉毒素变异体H21G血清与白喉毒素或类毒素有免疫交叉反应。由于白喉毒素变异体H21G和白喉类毒素相似，从安全角度评估，可以用于合成结合疫苗所用的蛋白载体。白喉毒素变异体H21G氨基酸序列如下：
[0568] GADDVVDSSKSFVMENFSSYGGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
[0569] 2、带有万能表位肽的H21G蛋白载体氨基酸序列的设计
[0570] 将万能表位肽连接至H21G蛋白载体上，构建出一种新的多糖蛋白质结合物的蛋白载体。所用的万能表位肽可连接至H21G蛋白载体的N‐末端或C‐末端；也可将两个不同的万能表位肽分别连接至H21G蛋白载体的N‐末端或C‐末端；另一种方式是将两个万能表位肽自身连接，然后再连接至H21G蛋白载体的N‐末端或者C‐末端。
[0571] 由于含有万能表位肽蛋白载体增强多糖蛋白结合物的原理相同，本发明以六种代表性蛋白载体的设计加以说明。
[0572] 2‐1、含有万能表位肽P30的H21G蛋白载体氨基酸序列的设计
[0573] 2‐1‐1、P30‐N‐末端H21G蛋白载体(称为P30H21G)氨基酸序列的设计[0574] 通过将P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE加入至H21G蛋白载体的N‐末端，形成一个新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0575] FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYGGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR[0576] 在P30氨基酸序列和H21G蛋白载体的N‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P30H21G蛋白载体。
[0577] 2‐1‐2、P30‐N‐末端H21G C‐末端‐P30蛋白载体(称为P30H21GP30)氨基酸序列的设计
[0578] 通过将两个P30表位肽分别连接至H21G蛋白载体的N‐末端和C‐末端，形成了一种新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0579] FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYGGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
[0580] 在P30氨基酸序列和H21G蛋白载体的N‐末端，及C‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P30H21GP30蛋白载体。
[0581] 2‐2、含有万能表位肽P2的H21G蛋白载体氨基酸序列的设计
[0582] 2‐2‐1、P2‐N‐末端H21G蛋白载体(称为P2H21G)氨基酸序列的设计
[0583] 通过将P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL加入至H21G蛋白载体的N‐末端，形成一个新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0584] QYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYGGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
[0585] 在P2氨基酸序列和H21G蛋白载体的N‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P2H21G蛋白载体。
[0586] 2‐3、含有万能表位肽OVAp的H21G蛋白载体氨基酸序列的设计
[0587] 2‐3‐1、OVAp‐N‐末端H21G蛋白载体(称为OVApH21G)氨基酸序列的设计[0588] 通过将OVAp氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR加入至H21G蛋白载体的N‐末端，形成一个新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0589] ISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYGGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR[0590] 在OVAp氨基酸序列和H21G蛋白载体的N‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为OVApH21G蛋白载体。
[0591] 2‐4、含有两个以上的万能表位肽的H21G蛋白载体氨基酸序列的设计
[0592] 2‐4‐1、P30‐N‐末端H21G C‐末端‐P2蛋白载体(称为P30H21GP2)氨基酸序列的设计[0593] 通过将P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE和P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL分别加入至H21G蛋白载体N‐末端和C‐末端，形成一个新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0594] FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYGGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKANSKFIGITEL
[0595] 在P30和P2氨基酸序列和H21G蛋白载体的N‐末端和C‐末端间分别插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P30H21GP2蛋白载体。
[0596] 2‐4‐2、P2OVAp‐N‐末端白喉毒素变异体H21G C‐末端‐P30蛋白载体(称为P2OVApH21GP30)氨基酸序列的设计
[0597] 通过将P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL和OVAp氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR连接，然后加入至H21G蛋白载体的N‐末端；将P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE加入至H21G蛋白载体的C‐末端，形成一个新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0598] QYIKANSKFIGITELGSGSGISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYGGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
[0599] 在P2和OVAp氨基酸序列之间，H21G蛋白载体的N‐末端和C‐末端间，以及P30和H21G蛋白载体的N‐末端之间分别插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P2OVApH21GP30蛋白载体。
[0600] 二、H21G蛋白载体和含有万能表位肽的H21G蛋白载体表达质粒的构建
[0601] 1、H21G蛋白载体表达质粒的构建
[0602] 从GenBank获取白喉毒素完整的氨基酸序列Reference Sequence:NP_938615，确定白喉毒素的A链片段，将其氨基酸序列的第21位的组氨酸修饰为甘氨酸。以此为依据，对该片段的氨基酸的核酸序列进行优化，以便在大肠杆菌表达系统中高效表达。采用自制的表达质粒，用Nde I酶识别质粒位点CATATG，Bam HI酶识别位点GGATCC。经过H21G蛋白的基因序列进行分析，在序列内，无Nde I及Bam HI酶切位点。H21G蛋白基因合成序列如下：
[0603] CATATG
[0604] GGTGCCGACG ACGTGGTTGA TAGCTCTAAA TCTTTCGTTA TGGAAAACTT CAGTTCCTAT[0605] GGCGGTACCA AACCGGGCTA CGTCGATTCG ATTCAGAAAG GTATCCAAAA ACCGAAAAGC[0606] GGCACCCAGG GTAACTATGA TGACGATTGG AAAGGCTTTT ACTCAACGGA CAATAAATAT[0607] GATGCGGCCG GCTACTCCGT GGACAACGAA AATCCGCTGA GCGGTAAAGC GGGCGGTGTC[0608] GTGAAAGTTA CCTATCCGGG TCTGACGAAA GTGCTGGCTC TGAAAGTTGA TAATGCGGAA[0609] ACCATCAAAA AAGAACTGGG CCTGTCCCTG ACCGAACCGC TGATGGAACA AGTGGGTACG[0610] GAAGAATTTA TCAAACGTTT CGGCGACGGT GCCTCTCGCG TTGTCCTGAG TCTGCCGTTT[0611] GCAGAAGGCT CATCGAGCGT CGAATACATT AACAATTGGG AACAAGCAAA AGCTCTGAGC[0612] GTGGAACTGG AAATCAACTT CGAAACGCGT GGCAAACGCG GTCAGGATGC GATGTATGAA[0613] TACATGGCGC AAGCCTGCGC AGGTAATCGT GTTCGTCGC
[0614] GGATCC
[0615] 将空白质粒和合成的H21G蛋白基因的PCR产物中，分别加入Nde I酶和Bam HI酶进行双酶切反应；纯化后，在连接体系中加入T4连接酶进行连接，完成后纯化表达质粒，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化至细胞内，筛选克隆，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。获得阳性表达工程菌后，建立种子库，包括主种子和工作种子。储存于‐20℃以下冰箱中。
[0616] 2、含有万能表位肽的H21G蛋白载体表达质粒的构建
[0617] 2‐1、P30H21G蛋白载体表达质粒的构建
[0618] 采用自制的表达质粒，用Nde I酶识别质粒位点CATATG，Bam HI酶识别位点GGATCC。经过P30H21G的蛋白基因序列进行分析，在序列内，无Nde I及Bam HI酶切位点。P30H21G基因合成全序列如下：
[0619] CATATG
[0620] TTCAACAATT TTACGGTGTC TTTTTGGCTG CGTGTGCCGA AAGTGTCTGC GAGTCATCTG[0621] GAAGGTAGTG GTTCTGGTGG TGCCGACGAC GTGGTTGATA GCTCTAAATC TTTCGTTATG[0622] GAAAACTTCA GTTCCTATGG CGGTACCAAA CCGGGCTACG TCGATTCGAT TCAGAAAGGT[0623] ATCCAAAAAC CGAAAAGCGG CACCCAGGGT AACTATGATG ACGATTGGAA AGGCTTTTAC[0624] TCAACGGACA ATAAATATGA TGCGGCCGGC TACTCCGTGG ACAACGAAAA TCCGCTGAGC[0625] GGTAAAGCGG GCGGTGTCGT GAAAGTTACC TATCCGGGTC TGACGAAAGT GCTGGCTCTG[0626] AAAGTTGATA ATGCGGAAAC CATCAAAAAA GAACTGGGCC TGTCCCTGAC CGAACCGCTG[0627] ATGGAACAAG TGGGTACGGA AGAATTTATC AAACGTTTCG GCGACGGTGC CTCTCGCGTT[0628] GTCCTGAGTC TGCCGTTTGC AGAAGGCTCA TCGAGCGTCG AATACATTAA CAATTGGGAA[0629] CAAGCAAAAG CTCTGAGCGT GGAACTGGAA ATCAACTTCG AAACGCGTGG CAAACGCGGT[0630] CAGGATGCGA TGTATGAATA CATGGCGCAA GCCTGCGCAG GTAATCGTGT TCGTCGCTAA[0631] GGATCC
[0632] 将空白质粒和合成的P30H21G基因的PCR产物中，分别加入Nde I酶和Bam HI酶进行双酶切反应；纯化后，在连接体系中加入T4连接酶进行连接，完成后纯化表达质粒，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化至细胞内，筛选克隆，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。获得阳性表达工程菌后，建立种子库，包括主种子和工作种子。储存于‐20℃以下冰箱中。
[0633] 2‐2、P30H21GP30蛋白载体表达质粒的构建
[0634] 采用自制的表达质粒，用Nde I酶识别质粒位点CATATG，Bam HI酶识别位点GGATCC。经过P30H21GP30的蛋白基因序列进行分析，在序列内，无Nde I及Bam HI酶切位点。P30H21GP30基因合成全序列如下：
[0635] CATATG
[0636] TTCAACAATT TTACGGTGTC TTTTTGGCTG CGTGTGCCGA AAGTGTCTGC GAGTCATCTG[0637] GAAGGTAGTG GTTCTGGTGG TGCCGACGAC GTGGTTGATA GCTCTAAATC TTTCGTTATG[0638] GAAAACTTCA GTTCCTATGG CGGTACCAAA CCGGGCTACG TCGATTCGAT TCAGAAAGGT[0639] ATCCAAAAAC CGAAAAGCGG CACCCAGGGT AACTATGATG ACGATTGGAA AGGCTTTTAC[0640] TCAACGGACA ATAAATATGA TGCGGCCGGC TACTCCGTGG ACAACGAAAA TCCGCTGAGC[0641] GGTAAAGCGG GCGGTGTCGT GAAAGTTACC TATCCGGGTC TGACGAAAGT GCTGGCTCTG[0642] AAAGTTGATA ATGCGGAAAC CATCAAAAAA GAACTGGGCC TGTCCCTGAC CGAACCGCTG[0643] ATGGAACAAG TGGGTACGGA AGAATTTATC AAACGTTTCG GCGACGGTGC CTCTCGCGTT[0644] GTCCTGAGTC TGCCGTTTGC AGAAGGCTCA TCGAGCGTCG AATACATTAA CAATTGGGAA[0645] CAAGCAAAAG CTCTGAGCGT GGAACTGGAA ATCAACTTCG AAACGCGTGG CAAACGCGGT[0646] CAGGATGCGA TGTATGAATA CATGGCGCAA GCCTGCGCAG GTAATCGTGT TCGTCGCTAA[0647] GGTAGTGGTT CTGGTTTCAA CAATTTTACG GTGTCTTTTT GGCTGCGTGT GCCGAAAGTG[0648] TCTGCGAGTC ATCTGGAA
[0649] GGATCC
[0650] 将空白质粒和合成的P30H21GP30蛋白基因的PCR产物中，分别加入NdeI酶和Bam HI酶进行双酶切反应；纯化后，在连接体系中加入T4连接酶进行连接，完成后纯化表达质粒，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化至细胞内，筛选克隆，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。获得阳性表达工程菌后，建立种子库，包括主种子和工作种子。储存于‐20℃以下冰箱中。
[0651] 2‐3、P2H21G蛋白表达质粒的构建
[0652] 采用自制的表达质粒，用Nde I酶识别质粒位点CATATG，Bam HI酶识别位点GGATCC。经过P2H21G的基因序列进行分析，在序列内，无Nde I及Bam HI酶切位点。P2H21G基因合成全序列如下：
[0653] CATATG
[0654] CAGTACATTA AAGCAAACTC AAAAT TCAT TGGCATTACC GAACTGGGTA GTGGTTCTGG[0655] TGGTGCCGAC GACGTGGTTG ATAGCTCTAA ATCTTTCGTT ATGGAAAACT TCAGTTCCTA[0656] TGG CGGTAC CAAACCGGGCT ACGTCGATTC GATTCAGAAA GGTATCCAAA AACCGAAAAG[0657] CGGCACCCAG GGTAACTATG ATGACGATTG GAAAGGCTTT TACTCAACGG ACAATAAATA[0658] TGATGCGGCC GGCTACTCCG TGGACAACGA AAATCCGCTG AGCGGTAAAG CGGGCGGTGT[0659] CGTGAAAGTT ACCTATCCGG GTCTGACGAA AGTGCTGGCT CTGAAAGTTG ATAATGCGGA[0660] AACCATCAAA AAAGAACTGG GCCTGTCCCT GACCGAACCG CTGATGGAAC AAGTGGGTAC[0661] GGAAGAATTT ATCAAACGTT TCGGCGACGG TGCCTCTCGC GTTGTCCTGA GTCTGCCGTT[0662] TGCAGAAGGC TCATCGAGCG TCGAATACAT TAACAATTGG GAACAAGCAA AAGCTCTGAG[0663] CGTGGAACTG GAAATCAACT TCGAAACGCG TGGCAAACGC GGTCAGGATG CGATGTATGA[0664] ATACATGGCG CAAGCCTGCG CAGGTAATCG TGTTCGTCGC TAA
[0665] GGATCC
[0666] 将空白质粒和合成的P2H21G蛋白基因的PCR产物中，分别加入Nde I酶和Bam HI酶进行双酶切反应；纯化后，在连接体系中加入T4连接酶进行连接，完成后纯化表达质粒，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化至细胞内，筛选克隆，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。获得阳性表达工程菌后，建立种子库，包括主种子和工作种子。储存于‐20℃以下冰箱中。
[0667] 2‐4、OVApH21G蛋白载体表达质粒的构建
[0668] 采用自制的表达质粒，用Nde I酶识别质粒位点CATATG，Bam HI酶识别位点GGATCC。经过OVApH21G的基因序列进行分析，在序列内，无Nde I及Bam HI酶切位点。OVApH21G基因合成全序列如下：
[0669] CATATG
[0670] ATCAGCCAAG CGGTTCACGC AGCCCACGCC GAAATTAACG AAGCGGGTCG CGGTAGCGGT[0671] TCTGGCGGTG CCGACGACGT GGTTGATAGC TCTAAATCTT TCGTTATGGA AAACTTCAGT[0672] TCCTATGGCG GTACCAAACC GGGCTACGTC GATTCGATTC AGAAAGGTAT CCAAAAACCG[0673] AAAAGCGGCA CCCAGGGTAA CTATGATGAC GATTGGAAAG GCTTTTACTC AACGGACAAT[0674] AAATATGATG CGGCCGGCTA CTCCGTGGAC AACGAAAATC CGCTGAGCGG TAAAGCGGGC[0675] GGTGTCGTGA AAGTTACCTA TCCGGGTCTG ACGAAAGTGC TGGCTCTGAA AGTTGATAAT[0676] GCGGAAACCA TCAAAAAAGA ACTGGGCCTG TCCCTGACCG AACCGCTGAT GGAACAAGTG[0677] GGTACGGAAG AATTTATCAA ACGTTTCGGC GACGGTGCCT CTCGCGTTGT CCTGAGTCTG[0678] CCGTTTGCAG AAGGCTCATC GAGCGTCGAA TACATTAACA ATTGGGAACA AGCAAAAGCT[0679] CTGAGCGTGG AACTGGAAAT CAACTTCGAA ACGCGTGGCA AACGCGGTCA GGATGCGATG[0680] TATGAATACA TGGCGCAAGC CTGCGCAGGT AATCGTGTTC GTCGCTAA
[0681] GGATCC
[0682] 将空白质粒和合成的OVApH21G蛋白基因的PCR产物中，分别加入Nde I酶和Bam HI酶进行双酶切反应；纯化后，在连接体系中加入T4连接酶进行连接，完成后纯化表达质粒，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化至细胞内，筛选克隆，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。获得阳性表达工程菌后，建立种子库，包括主种子和工作种子。储存于‐20℃以下冰箱中。
[0683] 2‐5、P30H21GP2蛋白载体表达质粒的构建
[0684] 采用自制的表达质粒，用Nde I酶识别质粒位点CATATG，Bam HI酶识别位点GGATCC。经过P30H21GP2的蛋白基因序列进行分析，在序列内，无Nde I及Bam HI酶切位点。P30H21GP2基因合成全序列如下：
[0685] CATATG
[0686] TTCAACAATT TTACGGTGTC TTTTTGGCTG CGTGTGCCGA AAGTGTCTGC GAGTCATCTG[0687] GAAGGTAGTG GTTCTGGTGG TGCCGACGAC GTGGTTGATA GCTCTAAATC TTTCGTTATG[0688] GAAAACT TC AGTTCCTATG GCGGTACCAA ACCGGGCTAC GTCGATTCGA TTCAGAAAGG[0689] TATCCAAA A ACCGAAAAGC GGCACCCAGG GTAACTATGA TGACGATTGG AAAGGCTTTT[0690] ACTCAACGGA CAATAAATAT GATGCGGCCG GCTACTCCGT GGACAACGAA AATCCGCTGA[0691] GCGGTAAAGC GGGCGGTGTC GTGAAAGTTA CCTATCCGGG TCTGACGAAA GTGCTGGCTC[0692] TGAAAGTTGA TAATGCGGAA ACCATCAAAA AAGAACTGGG CCTGTCCCTG ACCGAACCGC[0693] TGATGGAACA AGTGGGTACG GAAGAATTTA TCAAACGTTT CGGCGACGGT GCCTCTCGCG[0694] TTGTCCTGAG TCTGCCGTTT GCAGAAGGCT CATCGAGCGT CGAATACATT AACAATTGGG[0695] AACAAGCAAA AGCTCTGAGC GTGGAACTGG AAATCAACTT CGAAACGCGT GGCAAACGCG[0696] GTCAGGATGC GATGTATGAA TACATGGCGC AAGCCTGCGC AGGTAATCGT GTTCGTCGCT[0697] AAGGCTCAGG CTCAGGTCAG TACATTAAAG CAAACTCAAA ATTCATTGGC ATTACCGAAC[0698] TG
[0699] GGATCC
[0700] 将空白质粒和合成的P30H21GP2基因的PCR产物中，分别加入Nde I酶和Bam HI酶进行双酶切反应；纯化后，在连接体系中加入T4连接酶进行连接，完成后纯化表达质粒，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化至细胞内，筛选克隆，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。获得阳性表达工程菌后，建立种子库，包括主种子和工作种子。储存于‐20℃以下冰箱中。
[0701] 2‐6、P2OVApH21GP30蛋白表达质粒的构建：
[0702] 采用自制的表达质粒，用Nde I酶识别质粒位点CATATG，Bam HI酶识别位点GGATCC。经过P2OVApH21GP30的蛋白基因序列进行分析，在序列内，无Nde I及Bam HI酶切位点。P2OVApH21GP30基因合成全序列如下：
[0703] CATATG
[0704] CAGTACATTA AAGCAAACTC AAAAT TCAT TGGCATTACC GAACTGGGTA GTGGTTCTGG[0705] TATCAGCCAA GCGGTTCACG CAGCCCACGC CGAAATTAAC GAAGCGGGTC GCGGTAGCGG[0706] TTCTGGCGGT GCCGACGACG TGGTTGATAG CTCTAAATCT TTCGTTATGG AAAACTTCAG[0707] TTCCTATGGC GGTACCAAAC CGGGCTACGT CGATTCGATT CAGAAAGGTA TCCAAAAACC[0708] GAAAAGCGGC ACCCAGGGTA ACTATGATGA CGATTGGAAA GGCTTTTACT CAACGGACAA[0709] TAAATATGAT GCGGCCGGCT ACTCCGTGGA CAACGAAAAT CCGCTGAGCG GTAAAGCGGG[0710] CGGTGTCGTG AAAGTTACCT ATCCGGGTCT GACGAAAGTG CTGGCTCTGA AAGTTGATAA[0711] TGCGGAAACC ATCAAAAAAG AACTGGGCCT GTCCCTGACC GAACCGCTGA TGGAACAAGT[0712] GGGTACGGAA GAATTTATCA AACGTTTCGG CGACGGTGCC TCTCGCGTTG TCCTGAGTCT[0713] GCCGTTTGCA GAAGGCTCAT CGAGCGTCGA ATACATTAAC AATTGGGAAC AAGCAAAAGC[0714] TCTGAGCGTG GAACTGGAAA TCAACTTCGA AACGCGTGGC AAACGCGGTC AGGATGCGAT[0715] GTATGAATAC ATGGCGCAAG CCTGCGCAGG TAATCGTGTT CGTCGCTAAG GTAGTGGTTC[0716] TGGTTTCAAC AATTTTACGG TGTCTTTTTG GCTGCGTGTG CCGAAAGTGT CTGCGAGTCA[0717] TCTGGAA
[0718] GGATCC
[0719] 将空白质粒和合成的P2OVApH21GP30基因的PCR产物中，分别加入Nde I酶和Bam HI酶进行双酶切反应；纯化后，在连接体系中加入T4连接酶进行连接，完成后纯化表达质粒，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化至细胞内，筛选克隆，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。获得阳性表达工程菌后，建立种子库，包括主种子和工作种子。储存于‐20℃以下冰箱中。
[0720] 三、含有万能表位肽H21G蛋白载体和H21G蛋白载体的制备
[0721] 实验结果表明，H21G蛋白载体和含有万能表位肽的H21G蛋白载体的特性相似；因此，这些蛋白载体的纯化方法相似，以下以含有万能表位肽的H21G蛋白载体为例说明方法。
[0722] 1、表达含有万能表位肽的H21G蛋白载体工程菌的制备
[0723] 用分子生物学标准方法将各个表达蛋白载体的质粒转入至感受态细胞内，并进行表达检定。筛选出蛋白表达量高，并且通过用抗血清检定合格的克隆，建立主种子库和工作种子库。
[0724] 2、含有万能表位肽的H21G蛋白载体表达工程菌的发酵
[0725] 见“含有万能表位肽的CRM197A蛋白载体表达工程菌的发酵”节。
[0726] 3、含有万能表位肽的H21G蛋白载体的纯化
[0727] 由于构建含有不同万能表位肽的蛋白载体都是以H21G蛋白载体为主体，实验表明，尽管加入了万能表位肽，但对H21G蛋白载体纯化的参数影响不大，只需要在纯化H21G蛋白载体的工艺参数上进行一些修饰，就可建立起其他含有万能表位肽的H21G蛋白载体的纯化方法。
[0728] 称重50g湿菌体于2‐升离心杯中，加入300ml1xPBS pH7.0缓冲液混悬菌体，在磁力搅拌器上搅拌混匀30min；在4℃下，4000rpm，离心20min，弃上清，收集菌体；重复该步骤两次；加入300ml1xPBS pH7.0至菌体离心管，在均质机上进行破碎；在4℃下，10000rpm，离心20min；收集沉淀，弃上清液；加入300ml1xPBS pH7.0缓冲液，在磁力搅拌器上搅拌30min；在
4℃下，4000rpm，离心20min；弃上清液，收集包涵体，加入900ml变性缓冲液至洗涤后的包涵体，在25℃下，10000rpm离心30min，收集上清液，弃沉淀；将离心上清液转移至6‐8KD透析袋中，封闭透析袋；置透析袋于10升复性缓冲液1中，室温下，在磁力搅拌器上搅拌透析过夜；
次日将透析袋转入10升复性缓冲液2中，室温搅拌透析8‐10小时；将透析袋转入10升复性缓冲液3中，室温搅拌透析过夜；次日将透析袋转入10升复性缓冲液4中，室温搅拌透析8‐10小时；将透析袋转入10升复性缓冲液5中，室温搅拌透析过夜；次日将透析袋转入2升储备缓冲液中，室温搅拌透析8‐10小时；更换储备缓冲液二次，室温透析过夜；取1ml透析液，室温
12000rpm离心10min，收集上清，测蛋白质浓度；将蛋白溶液上样至预先平衡的DEAE‐Sepharose胶柱，用等梯度洗脱，并收集目的蛋白峰；然后上样至Phenyl Sepharose柱进一步纯化，收集洗脱峰；最后上样Q Sepharose胶柱，收集洗脱峰；将收集获得的纯化目的蛋白转至透析袋中，在0.15M的氯化钠中透析，完成后转移至4℃下储存待用。
4℃下，4000rpm，离心20min；弃上清液，收集包涵体，加入900ml变性缓冲液至洗涤后的包涵体，在25℃下，10000rpm离心30min，收集上清液，弃沉淀；将离心上清液转移至6‐8KD透析袋中，封闭透析袋；置透析袋于10升复性缓冲液1中，室温下，在磁力搅拌器上搅拌透析过夜；
次日将透析袋转入10升复性缓冲液2中，室温搅拌透析8‐10小时；将透析袋转入10升复性缓冲液3中，室温搅拌透析过夜；次日将透析袋转入10升复性缓冲液4中，室温搅拌透析8‐10小时；将透析袋转入10升复性缓冲液5中，室温搅拌透析过夜；次日将透析袋转入2升储备缓冲液中，室温搅拌透析8‐10小时；更换储备缓冲液二次，室温透析过夜；取1ml透析液，室温
12000rpm离心10min，收集上清，测蛋白质浓度；将蛋白溶液上样至预先平衡的DEAE‐Sepharose胶柱，用等梯度洗脱，并收集目的蛋白峰；然后上样至Phenyl Sepharose柱进一步纯化，收集洗脱峰；最后上样Q Sepharose胶柱，收集洗脱峰；将收集获得的纯化目的蛋白转至透析袋中，在0.15M的氯化钠中透析，完成后转移至4℃下储存待用。
[0729] 四、多糖H21G结合物的制备
[0730] 用三种结合物合成方法，即还原胺法，CDAP法(1‐(3‐二甲基氨基丙基)‐3‐乙基碳化二亚胺盐酸盐法)和ADH法(己二酰二肼法)，来合成结合物。不同细菌多糖结构中含有不同的基团，采用不同的合成方法合成的结合物的产量和免疫原性有所不同。本发明合成的结合物有13价肺炎球菌多糖H21G结合物，流行性嗜血杆菌b型多糖H21G结合物，以及4价流行性脑膜炎球菌多糖H21G结合物。
[0731] 1、13价肺炎球菌多糖H21G蛋白结合物(含有万能表位肽和不含万能表位肽)的制备
[0732] 采用六种含有万能表位肽的H21G蛋白载体来合成13价肺炎球菌多糖结合物，包括P30H21G、P30H21GP30、P2H21G、OVApH21G、P30H21GP2、以及P2OVApH21GP30，来合成相应的13价肺炎球菌多糖H21G结合物：13Pn‐P30H21G、13Pn‐P30H21GP30、13Pn‐P2H21G、13Pn‐OVApH21G、13Pn‐P30H21GP2、以及13Pn‐P2OVApH21GP30。这些结合物的合成方法和“13价肺炎球菌多糖CRM197A结合物的制备”方法相似。
[0733] 2、流行性嗜血杆菌b型多糖H21G蛋白结合物(含有万能表位肽和不含万能表位肽)的制备
[0734] 采用六种含有万能表位肽的H21G蛋白载体来合成流行性嗜血杆菌b型多糖结合物，包括P30H21G、P30H21GP30、P2H21G、OVApH21G、P30H21GP2、以及P2OVApH21GP30，来合成相应的流行性嗜血杆菌b型多糖结合物：Hib‐P30H21G、Hib‐P30H21GP30、Hib‐P2H21G、Hib‐OVApH21G、Hib‐P30H21GP2、以及Hib‐P2OVApH21GP30以及对照样品Hib‐H21G。这些结合物的合成方法和“流行性嗜血杆菌b型多糖CoreVP8结合物的制备”方法相似。
[0735] 3、4价流行性脑膜炎球菌多糖H21G蛋白结合物(含有万能表位肽和不含万能表位肽)的制备
[0736] 采用六种含有万能表位肽的H21G蛋白载体来合成4价流行性脑膜炎球菌多糖结合物，包括P30H21G、P30H21GP30、P2H21G、OVApH21G、P30H21GP2、以及P2OVApH21GP30，来合成相应的流行性脑膜炎球菌多糖结合物：4Men‐P30H21G、4Men‐P30H21GP30、4Men‐P2H21G、4Men‐OVApH21G、4Men‐P30H21GP2、4Men‐P2OVApH21GP30以及对照样品4Men‐H21G。这些结合物的合成方法和“4价流行性脑膜炎球菌多糖CoreVP8结合物的制备”方法相似。
[0737] 五、多糖H21G结合疫苗的免疫原性的评估
[0738] 1、13价肺炎球菌多糖H21G蛋白结合疫苗免疫原性的评估
[0739] 用和“13价肺炎球菌多糖P2CRM197A蛋白结合疫苗的免疫原性的评估”相似的方法进行实验，结合疫苗的抗多糖抗体IgG浓度结果如下表，本表只是列出注射三针后的抗多糖IgG浓度。
[0740] 配制成相应的疫苗后，按照13价肺炎球菌多糖P2CRM197A结合疫苗注射和采血程序获得血清(每只小鼠注射0.1ml，多糖注射量为10μg/小鼠/次)。用ELISA法检测血清中抗Hib多糖抗体浓度，下表是注射三针后小鼠血清中抗各个血清型多糖IgG浓度结果：
[0741]
[0742] 从上表可见，所有含有万能表位肽蛋白载体合成的13价肺炎球菌多糖H21G结合物的免疫原性，和不含有万能表位肽蛋白载体合成的13价肺炎球菌多糖H21G结合物比较，有明显的增强。
[0743] 2、Hib‐H21G结合疫苗免疫原性的评估
[0744] 用和“流行性嗜血杆菌b型P2CRM197A蛋白结合疫苗的免疫原性的评估”相似的方法进行实验，用ELISA法检测血清中抗Hib多糖抗体浓度，结果如下表：
[0745]
[0746] 以上Hib多糖抗体浓度可见，和流行性嗜血杆菌b型多糖H21G结合物的结果相似，和不含有万能表位肽蛋白载体合成的Hib‐H21G多糖结合物比较，其它六个含有万能表位肽的Hib多糖结合物，Hib‐P30H21G、P30H21GP30、P2H21G、OVApH21G、P30H21GP2、以及P2OVApH21GP30，的抗体IgG浓度显着提高(第三针血清和第一针血清中抗体浓度比较，p＜0.05)。
[0747] 3、4价流行性脑膜炎球菌多糖‐P2H21G疫苗免疫原性的评估
[0748] 按照13价肺炎球菌多糖P2CRM197A结合疫苗注射和采血程序获得血清。每只小鼠注射0.1ml，多糖注射量为10μg/小鼠/次。用ELISA法检测血清中抗各群多糖的抗体浓度，结果如下表：
[0749]
[0750]
[0751]
[0752] 从以上各群流脑多糖抗体浓度可见，与13价肺炎球菌多糖结合物和流行性嗜血杆菌b型物的结果相似，与不含有万能表位肽蛋白载体合成的流脑多糖结合物比较，含有万能表位肽的流脑多糖结合物，多糖抗体的IgG浓度显着提高(第三针血清和第一针血清中抗体浓度比较，p＜0.05)。
[0753] 参考文献
[0754] 1、Panina‐Bordignono P,Tano A,Termijtelen A,Universally immunogenic T cell epitopes promiscuous binding to human MHC class II and promiscuous recognition by T cells,Eur.J.Immunol.19:2237‐2242,1989。
[0755] 2、Su Y,Rossi R,De Groot AS,Regulatory T cell(Tregitopes)in IgG induce tolerance in vivo and lack immunogenicity per se.J Leukoc Biol.94(2):377‐383,2013。
[0756] 3、Giannini G,Rappuoli R,Ratti G,the amino‐acid sequence of two non‐toxic mutants of diphtheria toxin:CRM45and CRM197.Nucleic acids research,12:4063‐4069,1984。
[0757] 4、Johnson VG,Nichollson PJ,Histidine21does not play a major role in diphtheria toxin catalysis.J Bio Chem.269:4349‐4354,1994。