一种关附甲素及其盐的制备方法

摘要

本发明提供了一种关附甲素及其盐的制备方法。该方法采用酸水提取与阳离子吸附树脂净化相结合的工艺，再以有机酸沉淀去除杂质，重结晶得关附甲素及其盐，具体来说该方法包括如下步骤：步骤1：取关白附药材用酸水提取，得提取液A；步骤2：提取液A通过阳离子树脂进行纯化，得到纯化物步骤3：将步骤2得到的纯化物加入有机酸，沉淀，取沉淀物进行碱化处理得到关附甲素粗品；以及步骤4：步骤3得到的关附甲素粗品进行重结晶。该方法快速提高产品中关附甲素的含量，大大缩短结晶周期。

权利要求

1.一种关附甲素的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：步骤1：取关白附药材用酸水提取，得提取液A；

步骤2：将步骤1得到的提取液A通过阳离子树脂进行纯化，得到纯化物；

步骤3：将步骤2得到的纯化物加入有机酸，沉淀，取沉淀物进行碱化处理得到关附甲素粗品；以及步骤4：步骤3得到的关附甲素粗品进行重结晶，即得；

其中，步骤2所述阳离子交换树脂纯化为：将步骤1提取液A吸附于阳离子交换树脂，待交换完全后将树脂取出，碱化，以有机溶剂提取，回收溶剂得到纯化物。

2.一种关附甲素盐的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：步骤1：取关白附药材用酸水提取，得提取液A；

步骤2：将步骤1得到的提取液A通过阳离子树脂进行纯化，得到纯化物；

步骤3：将步骤2得到的纯化物加入有机酸，沉淀，得沉淀物，取沉淀物进行碱化处理得到关附甲素粗品；以及步骤4：将步骤3得到的关附甲素粗品以有机溶剂复溶，加入酸溶液调节pH为1-6，以有机溶剂重结晶，即得关附甲素盐；

其中，步骤2所述阳离子交换树脂纯化为：将步骤1提取液A吸附于阳离子交换树脂，待交换完全后将树脂取出，碱化，以有机溶剂提取，回收溶剂得到纯化物。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤1所述酸水选自0.1-3％的盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、草酸中的任意一种。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤1所述提取方法选自浸渍提取、渗漉提取、回流提取、超声提取中任意一种。

5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述阳离子交换树脂包括以苯乙烯、二乙烯苯、丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯中任意一种为骨架材料的强酸性或弱酸性阳离子交换树脂；

所述碱化用溶液选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、浓氨水或碳酸钠溶液中的任意一种，碱化至pH8-12；

所述提取用有机溶剂为氯仿、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙酸乙酯、醋酸甲酯、丙酮、乙醚中的一种或几种的混合溶剂。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤3所述有机酸选自草酸、酒石酸、柠檬酸中的任意一种。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，酸化至pH为1-4。

8.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤3所述取沉淀物进行碱化至pH为8-

11。

9.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤3所述沉淀物进行碱化处理后进行晾干或低温干燥；所述低温干燥温度不高于50℃。

10.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤4所述重结晶的有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、氯仿、乙酸乙酯和丙酮中的一种或几种的混合物。

说明书

一种关附甲素及其盐的制备方法

技术领域

[0001] 本发明提供了一种从中草药中提取分离关附甲素及其盐的方法，具体涉及一种从黄花乌头中提取分离关附甲素及其盐的方法。

背景技术

[0002] 关白附是中药毛茛科黄花乌头Aconitum coreanum(Lévl.)Rapaics的块根，为常用中药之一，多年来中医临床将关白附用于寒湿痹痛，偏头痛，腰膝关节冷痛等，收到良好效果。现代药理研究表明关白附中主要活性成分为C20二萜类生物碱类化合物，主要包括关附庚素（Guanfu base G,GFG），关附甲素（Guanfu base A，GFA），关附壬素（Guanfu base I，GFI）等。

[0003] 临床前药理研究表明：盐酸关附甲素可对抗高钙、结扎冠状动脉及乌头碱诱发的室性心动过速和心室颤动，并可对抗乙酰胆碱诱发的心房扑动和心房颤动；可浓度依赖性降低对心肌快反应动作电位的Vmax。膜片钳全细胞法证明该药物抑制快反应心肌细胞的Na+内流为主的多离子通道作用，是一个较好的抗心率失常的天然产物。大量临床数据表明，盐酸关附甲素是治疗阵发性室上心动过速和室性心率失常的有效药物，疗效肯定，不良反应少且轻微，为首次发现的全新结构类型的安全、有效的广谱抗心率失常西药一类原创新药。

[0004] 现有技术多采用多步萃取的方法制备盐酸关附甲素，中国专利CN1088827A公布了关附甲素的制备工艺，该工艺乙醇提取率低，脱脂步骤采用了大量有机溶剂，环境污染严重；萃取步骤乳化严重，萃取效率低；其中用到柱层析的方法，关附甲素损失大，设备要求高，操作步骤繁琐，关附甲素得率低；结晶步骤是在杂质较多情况下进行的，结晶困难，结晶周期很长（数周），而且得率比较低。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种关附甲素的制备方法。

[0006] 本发明的目的是提供一种关附甲素盐的制备方法。

[0007] 本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

[0008] 方案一：

[0009] 一种关附甲素的制备方法，该方法包括：

[0010] 步骤1：取关白附用酸水提取，得提取液A；

[0011] 步骤2：提取液A通过阳离子树脂纯化，得到纯化物（生物碱类物质）；

[0012] 步骤3：将步骤2得到的纯化物加入有机酸，沉淀，得沉淀物，将沉淀物进行碱化后得到关附甲素粗品；

[0013] 步骤4：步骤3所得关附甲素粗品进行重结晶。

[0014] 进一步，步骤1所述酸水选自0.1-3%的盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、草酸中的任意一种；优选0.1-3%的盐酸。酸水用量为药材：酸水（kg/L）=1:20-40。

[0015] 进一步，步骤1所述提取方法选自浸渍提取、渗漉提取、回流提取、超声提取中任意一种；优选渗漉提取或回流提取。

[0016] 进一步，步骤2所述阳离子交换树脂纯化为：将步骤1提取液A吸附于阳离子交换树脂，待交换完全后将树脂取出，碱化，以有机溶剂提取，回收溶剂得到纯化物（生物碱类物质）；其中，所述阳离子交换树脂包括以苯乙烯、二乙烯苯、丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯中任意一种为骨架材料的强酸性或弱酸性阳离子交换树脂；优选为以苯乙烯为骨架材料的强酸性阳离子交换树脂；所述碱化用溶液选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、浓氨水或碳酸钠溶液中的任意一种，碱化至pH8-12（优选pH10-12）；所述提取用有机溶剂为氯仿、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙酸乙酯、醋酸甲酯、丙酮、乙醚中的一种或几种的混合溶剂；优选为甲醇与乙酸乙酯的混合溶液；所述有机溶剂的用量为树脂用量的3-6倍（v/v）。

[0017] 进一步，步骤3所述有机酸选自草酸、酒石酸、柠檬酸中的任意一种；酸化至pH为1-4（优选pH1-3）。

[0018] 进一步，步骤3所述取沉淀物进行碱化至pH为8-11（优选pH9-11）。

[0019] 进一步，步骤3所述沉淀物进行碱化处理后进行晾干或低温干燥；更进一步的，所述低温干燥温度不高于50℃。

[0020] 进一步，步骤4所述重结晶的有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、氯仿、乙酸乙酯和丙酮中的一种或几种的混合物。

[0021] 更进一步的，一种关附甲素的制备方法，该方法包括：

[0022] 步骤1：取关白附药材，粉碎，用酸水渗漉或回流提取，得提取液A；

[0023] 步骤2：将步骤1得到的提取液A吸附于阳离子交换树脂，待交换完全后将树脂取出，晾干，以浓氨水碱化至pH为8-12，以有机溶剂回流提取，回收溶剂得到纯化物（生物碱类物质）；

[0024] 步骤3：将步骤2得到的纯化物加入有机酸至pH为1-4，沉淀，过滤，取沉淀物以水调成糊状，浓氨水碱化至pH为8-12，干燥，得关附甲素粗品；

[0025] 步骤4：将步骤3得到的关附甲素粗品以有机溶剂进行重结晶，过滤，干燥，即得关附甲素。

[0026] 方案二：

[0027] 一种关附甲素盐的制备方法，该方法包括：

[0028] 步骤1：关白附用酸水提取，得提取液A；

[0029] 步骤2：提取液A通过阳离子树脂进行纯化，得到纯化物（生物碱类物质）；

[0030] 步骤3：将步骤2得到的纯化物加入有机酸，沉淀，得沉淀物，取沉淀物进行碱化处理得到关附甲素粗品；

[0031] 步骤4：将步骤3得到的关附甲素粗品以有机溶剂复溶，加入酸溶液调节pH为1-6，静置析晶，再以有机溶剂重结晶，即得关附甲素盐。

[0032] 进一步，步骤1所述酸水选自0.1-3%的盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、草酸中的任意一种；优选0.1-3%的盐酸。酸水用量为药材：酸水（Kg/L）=1:20-40。

[0033] 进一步，步骤1所述提取方法选自浸渍提取、渗漉提取、回流提取、超声提取中任意一种；优选渗漉提取或回流提取。

[0034] 进一步，步骤2所述阳离子交换树脂纯化为：将步骤1提取液A吸附于阳离子交换树脂，待交换完全后将树脂取出，碱化，以有机溶剂提取，回收溶剂得到纯化物（生物碱类物质）；其中，所述阳离子交换树脂包括以苯乙烯、二乙烯苯、丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯中任意一种为骨架材料的强酸性或弱酸性阳离子交换树脂；优选为以苯乙烯为骨架材料的强酸性阳离子交换树脂；所述碱化用溶液选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、浓氨水或碳酸钠溶液中的任意一种，碱化至pH8-12（优选pH10-12）；所述提取用有机溶剂为氯仿、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙酸乙酯、醋酸甲酯、丙酮、乙醚中的一种或几种的混合溶剂；优选为甲醇与乙酸乙酯的混合溶液；所述有机溶剂的用量为树脂用量的3-6倍（v/v）。

[0035] 进一步，步骤3所述有机酸选自草酸、酒石酸、柠檬酸中的任意一种；酸化至pH为1-4（优选pH1-3）。

[0036] 进一步，步骤3所述取沉淀物进行碱化至pH为8-11（优选pH9-11）。

[0037] 进一步，步骤3所述沉淀物进行碱化处理后进行晾干或低温干燥；更进一步的，所述低温干燥温度不高于50℃。

[0038] 进一步，步骤4所述重结晶的有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、氯仿、乙酸乙酯和丙酮中的一种或几种的混合物。

[0039] 更进一步，一种关附甲素盐酸盐的制备方法，该方法包括：

[0040] 步骤1：取关白附药材，粉碎，用酸水渗漉或回流提取，得提取液A；

[0041] 步骤2：将步骤1得到的提取液A吸附于阳离子交换树脂，待交换完全后将树脂取出，晾干，以浓氨水碱化至pH为8-12，以有机溶剂回流提取，回收溶剂得到纯化物（生物碱类物质）；

[0042] 步骤3：将步骤2得到的纯化物加入有机酸至pH为1-4（优选pH1-3），沉淀，过滤，取沉淀物以水调成糊状，浓氨水碱化至pH为8-11，干燥，得关附甲素粗品；

[0043] 步骤4：将步骤3得到的关附甲素粗品以有机溶剂复溶，加浓盐酸酸化至pH为1-6，静置析晶，再以有机溶剂进行重结晶，过滤，干燥，即得关附甲素盐酸盐。

[0044] 另外，本发明还提供了一种通过上述方法制备得到关附甲素产品。

[0045] 其中，在该关附甲素产品中，关附甲素的含量大于98%。

[0046] 本发明技术方案相比现有技术具有如下优势：

[0047] 1、采用酸水提取与阳离子吸附树脂净化相结合的工艺提取关白附总生物碱，相比现有技术的有机溶剂提取，不仅节省成本，减少环境污染，而且减少了目标成分关附甲素的损失，提高了关附甲素的提取率。

[0048] 2、避免了提取液浓缩后直接用有机溶剂萃取时乳化严重的问题，设备要求不高，可操作性很强。

[0049] 3、采用有机溶剂提取后直接加酸沉淀的净化方法，快速提高产品中关附甲素的含量，大大缩短结晶周期。本发明方法与现有技术相比，在保证关附甲素纯度（均达到98%以上）和得率（最高得率达到3.16‰）的情况下，其结晶周期仅为现有技术的1/10。

[0050] 效果实验例

[0051] 实验例1不同提取方法对关附甲素提取率的影响

[0052] 1样品制备

[0053] 实验组：取1kg关白附药材，破碎，200L0.1%硫酸渗漉提取，提取液吸附于25LAmberlite IR-20阳离子交换树脂，取出树脂，晾干，树脂以浓氨水碱化至pH为10，碱化后的树脂以100L乙酸乙酯和甲醇混合溶剂回流提取，回收溶剂得总生物碱。

[0054] 对照组：取1kg关白附药材，粉碎，乙醇渗漉提取，回收乙醇，得到浸膏，加入1%盐酸溶解，酸水液调pH3，静置酸水液析胶，滤除酸水液中沉淀，用石油醚脱脂，分去石油醚层，用浓氨碱化酸水液至pH5，再用氯仿萃取，收集氯仿液，减压回收氯仿，得到总生物碱。

[0055] 2关附甲素含量测定方法

[0056] 2.1对照品溶液的制备：

[0057] 取盐酸关附甲素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.50mg的溶液，摇匀，即得。

[0058] 2.2供试品溶液的制备：

[0059] 取实验组总生物碱、对照组总生物碱细粉各10mg，精密称定，分别置10ml量瓶中，加甲醇超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

[0060] 2.3色谱条件：

[0061] 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以2ml/ml的庚烷磺酸钠水溶液（含0.2%三乙胺，并以磷酸调pH值至3.0）-乙腈（75:25）为流动相；检测波长为205nm。

[0062] 3实验结果

[0063] 采用内标法进行，测定结果见表1。

[0064] 表1不同提取方法关附甲素含量比较

[0065]  实验组 对照组
关附甲素含量 38% 20%

[0066] 结果表明，相较于常规有机溶剂提取+酸提碱沉的生物碱制备工艺，本发明实验组酸水提取+阳离子树脂柱纯化工艺减少了提取过程中关附甲素的损失，其提取物中关附甲素的含量显著高于对照组。

具体实施方式

[0067] 实施例1

[0068] 2kg关白附药材，粉碎，以60L0.5%（w/w）盐酸渗漉提取48小时，提取液吸附于8L001×7阳离子交换树脂，取出树脂，晾干，树脂以浓氨水碱化至pH为9，碱化后的树脂以15L氯仿和甲醇（5:1）混合溶剂回流提取3次，提取液浓缩后加入草酸至pH为1，沉淀，过滤，沉淀以水调成糊状，浓氨水碱化至pH为8，50℃干燥，再以30ml异丙醇复溶，静置析晶，得粗晶，粗晶以异丙醇-丙酮（1:2）重结晶，过滤，干燥，得到关附甲素5.8g，收率2.9‰，纯度98.6%。

[0069] 实施例2

[0070] 1kg关白附药材，粉碎，分次以10L,8L，8L1%（w/w）盐酸回流提取三次，合并，吸附于5L001×7阳离子交换树脂，取出树脂，晾干，树脂以浓氨水碱化至pH为9，碱化后的树脂以
15L氯仿和乙醇（2:1）混合溶剂回流提取3次，提取液浓缩后加入草酸至pH为2，沉淀，过滤，沉淀以水调成糊状，浓氨水碱化至pH为8，50℃干燥，再以100ml无水乙醇复溶，加浓盐酸酸化至pH为1，静置析晶，得粗晶，粗晶以无水乙醇重结晶，过滤，干燥，得到关附甲素盐酸盐
2.6g，收率2.6‰，纯度为98%。

[0071] 实施例3

[0072] 5kg关白附药材，粉碎，以200L0.1%硫酸渗漉提取24小时，提取液吸附于25LAmberlite IR-20阳离子交换树脂，取出树脂，晾干，树脂以浓氨水碱化至pH为10，碱化后的树脂以100L乙酸乙酯和甲醇（1:1）混合溶剂回流提取3次，提取液浓缩后加入酒石酸至pH为3，沉淀，过滤，以水调成糊状，浓氨水碱化至pH为10，50℃干燥，以异丙醇复溶，浓盐酸酸化至pH为3，静置析晶，粗晶以异丙醇重结晶，过滤，干燥，得到关附甲素盐酸盐11.8g，收率2.36‰，纯度为98.4%。

[0073] 实施例4

[0074] 3kg关白附药材，粉碎，以120L0.5%盐酸渗漉提取，提取液吸附于10LD072型阳离子交换树脂，取出树脂，晾干，树脂以浓氨水碱化，碱化后的树脂以40L正丁醇和丙酮（1:2）混合溶液回流提取3次，提取液浓缩后加入柠檬酸至pH为2，沉淀，过滤，沉淀以水调成糊状，浓氨水碱化至pH为11，50℃干燥，以甲醇和乙醇混合溶剂溶解，加浓盐酸酸化至pH为5，静置析晶，粗晶以无水乙醇和乙酸乙酯混合溶剂重结晶，过滤，干燥，得到关附甲素盐酸盐7.6g，收率2.5‰，纯度为98.1%。

[0075] 实施例5

[0076] 600g关白附药材，粉碎，分别以4.8L，4.8L，6L3%草酸回流提取，提取液吸附于3LD151型阳离子交换树脂，取出树脂，晾干，树脂以浓氨水碱化至pH为9，风干，风干后的树脂以15L甲醇、乙酸乙酯和乙醚混合溶剂回流提取3次，提取液浓缩后加草酸酸化，沉淀，过滤，沉淀以水调成糊状，浓氨水碱化至pH为9，50℃干燥，以异丙醇复溶，加浓盐酸酸化至pH为2，静置析晶，粗晶以正丁醇重结晶，过滤，干燥，得到关附甲素盐酸盐1.9g，收率3.16‰，纯度为98.0%。

[0077] 实施例6

[0078] 将10kg关白附药材粉碎，分别以80L、80L、100L1%盐酸分三次回流提取，提取液放凉后吸附于50L001×7型阳离子交换树脂，取出树脂，晾干，树脂以浓氨水碱化至pH为10，风干，风干后的树脂以200L乙酸乙酯和乙醇（3:7）混合溶剂回流提取，提取液加酒石酸酸化，沉淀，过滤，沉淀以水调成糊状，浓氨水碱化至pH为10，40℃干燥，以正丁醇溶解，加浓盐酸酸化至pH为3，静置析晶，粗晶以异丙醇和丙酮（2:1）混合溶剂重结晶，过滤，干燥，得到关附甲素盐酸盐25g，收率2.5‰，纯度98.3%。

[0079] 实施例7

[0080] 按实施例1-6和现有技术CN1088827A实施例1-3的方法制备关附甲素（或其盐），计算得率并比较结晶周期，结果见表2。

[0081] 表2不同方法关附甲素（或其盐）得率及结晶时间比较