水稻抗稻瘟病基因Pi2的分子标记及其应用

摘要

本发明属于农作物生物技术领域，具体涉及水稻抗稻瘟病基因Pi2的分子标记及其应用。所述分子标记基于核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的特异性插入/缺失位点多态。两个分子标记是针对Pi2功能基因两侧紧密连锁区间开发的共显性分子标记，具有准确性高、可广泛应用于不同育种亲本的优点。通过检测两个分子标记，可以准确判断所检测水稻材料是否具有抗病基因Pi2。利用分子标记组合，能够准确检测Pi2功能基因亲本与其它亲本的杂交转育后代植株基因组中是否含有Pi2功能基因以及其纯合状态，提高选育含有Pi2功能基因抗稻瘟病水稻品种的效率。

权利要求

1.一种用于扩增水稻抗稻瘟病基因Pi2 上游分子标记的引物组合Pi2U-F/Pi2U-R， 其特征在于 ： 由如SEQ ID NO.3所示的DNA序列和如SEQ ID NO.4所示的DNA序列组成。

2.一种用于扩增水稻抗稻瘟病基因Pi2 下游分子标记的引物组合Pi2D-F/Pi2D-R， 其特征在于 ： 由如SEQ ID NO.5所示的DNA序列和如SEQ ID NO.6所示的DNA序列组成。

3. 一种检测水稻抗稻瘟病基因Pi2方法， 其特征在于包括以下步骤 ：

1）提取水稻样品基因组 DNA；

2）利用权利要求1 所述的引物组合 Pi2U-F/Pi2U-R 和权利要求 2所述的引物组合Pi2D-F/Pi2D-R 对水稻样品基因组 DNA 进行 PCR 扩增， 根据 Pi2U-F/Pi2U-R 的扩增产物是否为一条144 bp条带， 并且Pi2D-F/Pi2D-R的扩增产物是否为一条195 bp条带， 判断所检测水稻样品基因组是否具有抗稻瘟病基因Pi2， 即如果利用Pi2U-F/Pi2U-R和Pi2D-F/Pi2D-R能够分别扩增出一个144 bp和195 bp的标记片段， 则标志着该水稻样品基因组中存在抗稻瘟病基因Pi2。

4. 一种选育水稻抗稻瘟病品种的方法， 其特征在于 ： 所述方法包括以下步骤：

1） 以含有抗稻瘟病基因Pi2 的水稻品种 C101A51 或其衍生系为亲本材料， 与其他水稻品种杂交或回交并繁衍后代群体；

2）提取上述所获得群体中单个植株的基因组 DNA， 利用权利要求 1 所述引物组合Pi2U-F/Pi2U-R和权利要求2所述引物组合Pi2D-F/Pi2D-R进行检测， 如果能够同时检测到Pi2U-F/Pi2U-R所扩增的144 kb标记片段和Pi2D-F/Pi2D-R所扩增的195 kb标记片段， 则所检测水稻植株携带有抗稻瘟病基因Pi2。

说明书

水稻抗稻瘟病基因Pi2的分子标记及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于农作物生物技术领域，具体涉及水稻抗稻瘟病基因Pi2的分子标记及其应用。

背景技术

[0002] 水稻是中国乃至世界上最重要的粮食作物之一，但其生产遭受稻瘟病严重危害。在世界范围内，由稻瘟菌（Magnapothe oryzae）引起的稻瘟病常年可造成水稻产量10-30%的损失（Dean等，2005）。长期的生产实践表明，选育和利用抗病水稻品种是防治稻瘟病最有效、最经济、对环境安全的方法。

[0003] 传统抗病水稻品种选育，主要依赖于苗期抗性接种表型鉴定或在稻瘟病易发区进行抗性表型筛选，容易因环境、气候等稻瘟发病条件的变化而受影响，导致鉴定结果不准确，育种效率偏低。此外，不少抗病基因间存在表型上的抗谱重叠性，传统育种依靠表型选择，难以鉴定到聚合多抗病基因的持久广谱抗病品种。

[0004] 分子标记辅助选择是随着现代分子生物学、分子遗传学的发展而产生的农作物育种新技术。这一技术主要通过分析与目标基因紧密连锁的分子标记基因型，实现对目标基因的选择。在作物抗病育种中，分子标记辅助选择能够提高选择可靠性，加快育种进程。此外，基于对目标基因紧密连锁分子标记的检测，还能够实现多个抗病基因聚合，培育持久抗病品种的目标。

[0005] Pi2基因是一个抗谱很广的水稻抗稻瘟病基因。Chen等（2001）以来源于中国中部和南部稻区的792个生理小种接种携带Pi2基因的水稻近等基因系C101A51，发现C101A51对超过92%的生理小种表现抗性；Liu等（2002）研究表明，携带Pi2基因的水稻近等基因系C101A51对来自13个国家的36个生理小种表现抗性。这些结果表明Pi2基因在水稻抗稻瘟病育种中具有重要的应用价值。因此，建立Pi2基因的分子标记，对充分利用该基因培育抗稻瘟病水稻新品种，具有重大意义。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供水稻抗稻瘟病基因Pi2的分子标记及其应用。通过检测该分子标记，可以准确判断所检测水稻材料是否具有抗病基因Pi2，显著提高培育抗稻瘟病水稻品种的效率。

[0007] 本发明通过分析抗稻瘟病功能基因Pi2及其上、下游区间的序列，发现与其它不含Pi2功能基因水稻品种基因组中等位区间的序列相比，Pi2功能基因的起始密码子ATG上游约28.3 kb区间存在一个27 bp的插入/缺失位点，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；同时，Pi2功能基因的终止密码子TGA下游2236/2237 bp之间存在一个53 bp的插入/缺失位点，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0008] 基于上述发现，本发明提供了一种水稻抗稻瘟病基因Pi2的分子标记，分为上游分子标记和下游分子标记，分别针对核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的特异性插入/缺失位点多态。

[0009] 所述的水稻抗稻瘟病基因Pi2的分子标记的引物组合Pi2U-F/Pi2U-R，由如SEQ ID NO.3所示的DNA序列和如SEQ ID NO.4所示的DNA序列组成，用于扩增上游分子标记。

[0010] 所述的水稻抗稻瘟病基因Pi2的分子标记的引物组合Pi2D-F/Pi2D-R，由如SEQ ID NO.5所示的DNA序列和如SEQ ID NO.6所示的DNA序列组成，用于扩增下游分子标记。

[0011] 根据上述引物组合，本发明还提供了一种检测水稻抗稻瘟病功能基因Pi2的分子标记的方法，包括以下步骤：

[0012] 1）提取水稻样品基因组DNA；

[0013] 2）利用权利要求3所述的引物组合Pi2U-F/Pi2U-R和权利要求4所述的引物组合Pi2D-F/Pi2D-R对水稻样品基因组DNA进行PCR扩增，根据Pi2U-F/Pi2U-R的扩增产物是否为一条144 bp条带，并且Pi2D-F/Pi2D-R的扩增产物是否为一条195 bp条带，判断所检测水稻样品基因组是否具有水稻抗稻瘟病基因Pi2，即如果利用Pi2U-F/Pi2U-R和Pi2D-F/Pi2D-R能够分别扩增出一个144 bp和195 bp的标记片段，则标志着该水稻样品基因组中存在抗稻瘟病基因Pi2。

[0014] 本发明另外保护了一种选育水稻抗稻瘟病品种的方法，包括以下步骤：

[0015] 1）以含有抗稻瘟病基因Pi2的水稻品种C101A51或其衍生系为亲本材料，与其他水稻品种杂交或回交并繁衍后代群体；

[0016] 2）提取上述所获得群体中单个植株的基因组DNA，利用权利要求3所述引物组合Pi2U-F/Pi2U-R和权力要求4所述引物组合Pi2D-F/Pi2D-R进行检测，如果能够同时检测到Pi2U-F/Pi2U-R所扩增的144 kb标记片段和Pi2D-F/Pi2D-R所扩增的195 kb标记片段，则所检测水稻植株携带有抗稻瘟病基因Pi2。

[0017] 本发明的优点及有益效果：

[0018] 1）本发明基于对具有Pi2功能基因水稻品系C101A51基因组中的Pi2及其上、下游区间的序列，以及其它不具有Pi2功能基因水稻品种基因组中的等位区间序列进行分析，在Pi2功能基因的上游约28.3 kb区间，以及在Pi2功能基因的下游2236/2237 bp区间分别确定了特异性插入/缺失多态，并开发了基于PCR反应的上、下游分子标记组合Pi2-ID-U和Pi2-ID-D。与常规育种方法相比，应用本发明建立的标记方法选育含有Pi2功能基因的抗稻瘟病水稻品种，具有选择目标明确、选择效率高以及节约成本的优势。在常规水稻抗病育种中，一般是依赖于苗期抗性接种表型鉴定或在稻瘟病易发区进行抗性表型筛选，受环境影响较大，不同年份间差别也较大，筛选鉴定的可靠性低，育种效率也低。基于本发明提供的抗稻瘟病基因Pi2分子标记方法，可以在苗期对水稻植株进行取样、DNA提取以及PCR快速鉴定，能够有效控制育种群体规模，节约育种筛选成本。

[0019] 2）本发明提供的标记位于Pi2功能基因的上、下游区间，在遗传上与Pi2抗病性呈共分离，选择效率达到100%，其比常用SSR标记的准确性显著提高。

[0020] 3）本发明提供的两个分子标记均为共显示标记，除了准确性高、重复性好，还能够区分出杂合体和纯合体，可以快速获得具有纯合Pi2功能基因的抗稻瘟病水稻植株。

[0021] 综上所述，利用本发明提供的分子标记方法，能够准确预测不同水稻植株基因组中是否含有Pi2功能基因以及其是否纯合，显著提高选育含有Pi2功能基因抗稻瘟病水稻品种的效率。

附图说明

[0022] 图1为部分水稻品种基因组中Pi2等位位点上游区间序列分析。

[0023] 其中，C101A51：C101A51；NPB：日本晴；9311：9311；SE21S：SE21S；MH63：明恢63；MY46：密阳46；II32：II-32B；GH998：广恢998；75-1-127：75-1-127；C64：测64；02428：02428；
ZG：早冈B；GZ63S：广占63S；D62：D62B；SH527：蜀恢527；F838：辐838；ZR101：ZR101。

[0024] 图 2为基于Pi2U-F/Pi2U-R引物组合的Pi2上游分子标记Pi2-ID-U检测部分水稻品种基因组DNA的电泳图谱。

[0025] 其中，M：分子量Marker；1：C101A51；2：日本晴；3：9311；4：SE21S；5：明恢63；6：密阳46；7：II-32B；8：广恢998；9：75-1-127；10：测64；11：02428；12：早冈B；13：广占63S；14：
D62B；15：蜀恢527；16：辐838；17：ZR101。含有Pi2功能基因的C101A51样本显示一条144bp条带，其它无Pi2功能基因品种的样本（除75-1-127扩增产物为 162 bp外）显示一条171 bp或
172 bp的条带。

[0026] 图3为具有Pi2功能基因水稻品种C101A51和无Pi2功能基因水稻品种日本晴的基因组中Pi2等位位点下游区间序列分析。

[0027] 其中，C101A51：C101A51；NPB：日本晴。

[0028] 图 4为基于Pi2D-F/Pi2D-R引物组合的Pi2功能基因下游分子标记Pi2-ID-D检测部分水稻品种基因组DNA的电泳图谱。

[0029] 其中，M：分子量Marker；1：C101A51；2：日本晴；3：9311；4：SE21S；5：明恢63；6：密阳46；7：II-32B；8：广恢998；9：75-1-127；10：测64；11：02428；12：早冈B；13：广占63S；14：
D62B；15：蜀恢527；16：辐838；17：ZR101。含有Pi2功能基因的C101A51样本显示一条195bp条带，其它无Pi2功能基因品种的样本显示一条142bp左右的条带。

具体实施方式

[0030] 下面结合具体实施例，对本发明作进一步阐述。以下实施例用于说明本发明，但不限制本发明的范围。

[0031] 实施例 1  Pi2功能基因上、下游区间DNA序列特异插入/缺失位点多态性确定[0032] 从公共数据库Genebank下载获得已经公开发表的来源于水稻品种C101A51的Pi2功能基因及其上、下游区间的序列（Genbank DQ352453）和来源于水稻品种日本晴（无Pi2功能基因）的等位区间序列（Genbank DQ454158），发现C101A51基因组序列与日本晴基因组序列相比 ，在Pi2功能基因的上游约28 .3 kb区间，缺失了一个序列为5 '-TTCGAGCCGTTTCATCCCTAATTGCAC-3'的大小为27bp的片段（附图1）。为分析这一缺失多态性是否在C101A51与其它不同水稻品种间具有保守性，进一步利用PCR技术从9311、SE21S、明恢63、密阳46、II-32B、广恢998、75-1-127、测64、02428、早冈B、广占63S、D62B、蜀恢527、辐
838和ZR101等15个水稻品种/品系基因组中扩增了相应的DNA片段并进行序列测序，结果表明，无Pi2功能基因等位区段均在相对应于Pi2功能基因的上游约28.3 kb区间，具有一个序列为5'-TTCGAGCCGTTTCATCCCTAMTTGCRC-3（' 其中M代表碱基A或者C，R代表碱基A或者G）的大小为27bp插入片段（附图1），说明Pi2功能基因上游区间的这个27bp缺失多态性能够特异性地甄别Pi2功能基因序列与无Pi2功能基因的等位序列。

[0033] 对DQ352453序列和DQ454158分析还发现，在DQ352453序列中，Pi2功能基因终止密码子TGA下游2236/2237 bp之间具有一个序列为5'-GGCAGCGGTTCACGTCGGCACTGGCGGCCCTAGGGGTAGCGGTGCCCCAGGAC-3'的大小为53 bp的插入多态性（附图3）。

[0034] 实施例 2  Pi2功能基因上、下游分子标记的建立

[0035] 针对Pi2功能基因上游区间的特异缺失位点多态性，设计了一对特异性引物组合Pi2U-F: 5'-TATGTGGGGTTTCTGATTCC-3'，Pi2U-R: 5'-CTTCACAAGCCATAATCAACA-3'，用于建立上游分子标记Pi2-ID-U。利用Pi2U-F/ Pi2U-R引物组合对C101A51、日本晴、9311、SE21S、明恢63、密阳46、II-32B、广恢998、75-1-127、测64、02428、早冈B、广占63S、D62B、蜀恢527、辐838和ZR101等17个水稻品种/品系的基因组DNA模板进行扩增。PCR反应体系为25 μL，含有模板DNA 50 ng，2×Reaction Mix 12.5 μL（含MgCl2、dNTP等），10 μM引物F9-F和F9-R各1 μL，0.5U Golden DNA Polymerase（2.5 U/12.5 μL，TIANGEN生物技术公司），ddH2O补齐至25 μL。反应条件为：94℃ 5min，94℃30S，58℃ 30S，72℃ 30S，共30个循环，最后72℃延伸8 min。扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分型。

[0036] 电泳结果表明，含有Pi2功能基因的C101A51扩增产物显示一条144bp条带，其它16个无Pi2功能基因水稻品种/品系的扩增产物（除75-1-127扩增产物为 162 bp外）显示一条171bp或172bp的条带（附图2），并且C101A51样品的带型与其它样品的带型可以在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中明显区分开。

[0037] 针对Pi2功能基因下游区间的特异缺失位点多态性，设计了一对特异性引物组合Pi2D-F: 5'-TAGGGGCTGCGGCGGAGGAC-3'，Pi2D-R: 5'-CTAGGCCTCCATTATCCATAGT-3'，用于建立上游分子标记Pi2-ID-D。利用Pi2D-F/ Pi2D-R引物组合对C101A51、日本晴、9311、SE21S、明恢63、密阳46、II-32B、广恢998、75-1-127、测64、02428、早冈B、广占63S、D62B、蜀恢527、辐838和ZR101等17个水稻品种/品系的基因组DNA模板进行扩增。PCR反应体系及反应条件与上述相同。扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分型。电泳结果表明，含有Pi2功能基因的C101A51扩增产物显示一条195bp条带，其它16个无Pi2功能基因水稻品种/品系的扩增产物显示一条142bp左右的条带（附图4）。

[0038] 上述所建立两个标记均是共显示标记，可以检测出水稻植株是否携带功能Pi2基因以及以及其基因型是纯合或杂合。如针对Pi2-ID-U标记和Pi2-ID-D标记，当所检测水稻样品的扩增产物分别是144bp和195bp的单一标记片段，标志着水稻植株染色体中的Pi2基因是纯合的。如果针对Pi2-ID-U标记扩增产物是包含一个144 bp片段和一个非144 bp片段（如171 bp或172 bp），或者针对Pi2-ID-D标记扩增产物是包含一个195 bp片段和一个142 bp片段，则标志着水稻植株染色体中的Pi2基因是杂合型。

[0039] 实施例 3  Pi2功能基因分子标记验证

[0040] 以Pi2功能基因供体品种C101A51为亲本与不含Pi2功能基因的水稻品种CO39配置F2群体。种植F2群体，提取幼苗基因组DNA，以Pi2-ID-U和Pi2-ID-D标记，筛选了132个Pi2-ID-U标记检测为阳性（扩增片段为144 bp）和Pi2-ID-D标记检测为阳性（扩增片段为195 bp）的植株。进一步以稻瘟菌菌株PO6-6进行接种鉴定。PO6-6菌株对无Pi2功能基因的CO39有强致病性，但对携带Pi2功能基因的植株则不具有致病性。接种结果表明，所有经过标记检测为阳性的植株均表现出对PO6-6抗性，选择效率达到100%。

[0041] 实施例 4  Pi2功能分子标记在水稻抗病分子育种中的应用

[0042] 利用Pi2功能基因供体品种C101A51与超级稻恢复系9311配置组合，并通过回交结合分子标记辅助选择将Pi2功能基因向9311转育。经过配组、回交并标记筛选获得了BC3代材料。进一步对BC3代材料进行筛选，提取BC3代植株的基因组DNA，通过PCR分析，分别检测Pi2功能基因上游标记Pi2-ID-U和下游标记Pi2-ID-D，检测到24个植株的样品具有代表Pi2功能基因144 bp的上游Pi2-ID-U标记条带，和195 bp的下游Pi2-ID-D标记条带，与这些植株的抗病性生物学鉴定结果一致。实施例结果体现出，应用本发明提供的Pi2功能基因的分子标记方法，能够快速准确地在育种群体中鉴定出携带Pi2功能基因的水稻植株，加速水稻抗稻瘟病品种培育的进程。