日本沼虾血红蛋白基因及其克隆方法与重组蛋白制备方法

摘要

本发明公开了一种日本沼虾血红蛋白基因及其克隆方法与重组蛋白制备方法，利用表达序列标签技术、3’和5’末端快速扩增技术（RACE）从日本沼虾克隆得到血红蛋白基因cDNA全长1201bp，有一个579bp的开放阅读框，编码193个氨基酸，5’非编码区为199bp，3’非编码区为420bp，有多聚腺苷酸加尾信号和多聚腺苷酸尾巴，该基因在日本沼虾免疫防御方面发挥重要作用。本发明利用体外重组表达技术获得了日本沼虾血红蛋白，该重组蛋白不仅具有携氧作用，而且具有抑菌作用，可为日本沼虾病害防治、基因辅助育种和饲料添加剂的研制提供理论基础。

权利要求

1.一种日本沼虾血红蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码权利要求1所述的日本沼虾血红蛋白的基因，其特征在于，其cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的日本沼虾血红蛋白，其特征在于，其氨基酸序列具有以下保守氨基酸残基位点：第54位的Trp，第69位的Phe，第77位的Pro，第103位的His，第106位的Thr，第107位的Val，第135位的His和第172位的Trp。

4.一种权利要求2所述的日本沼虾血红蛋白基因的克隆方法，其特征在于，通过利用氮气装置模拟低氧胁迫环境，诱导并提高日本沼虾血红蛋白表达水平、提取总RNA并反转录成cDNA、设定引物、PCR扩增中间片段，利用RACE 技术获得3’与5’序列，然后拼接为全长cDNA序列。

5.根据权利要求4所述的克隆方法，其特征在于，通过利用氮气装置模拟低氧胁迫环境过程为将暂养在溶解氧含量为6.5 mg/L水体中的日本沼虾移至低溶解氧水槽中，通过调整空气、氮气比例来调节低溶解氧水槽中氧气在水体中的含量，用溶解氧仪监测水槽中溶解氧含量的变化，直到测试值为2±0.2mg/L。

6.根据权利要求4所述的克隆方法，其特征在于，其中设定引物的正向引物为5’AAGTTGTTCAGAGAGGAGCCTG3’，反向引物为5’TTCCTCTGAAACTCGATGACCG3’。

7.一种权利要求2所述的日本沼虾血红蛋白基因的重组蛋白的制备方法，其特征在于，将SEQ ID NO.2所示cDNA与pET-23b载体相连接，转化入克隆菌DH5a后进行阳性转化子的筛选鉴定。

8.权利要求1所述的日本沼虾血红蛋白在制备甲壳动物抗菌药物和饲料添加剂中的应用。

说明书

日本沼虾血红蛋白基因及其克隆方法与重组蛋白制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，涉及日本沼虾血红蛋白基因序列，依据RNA-seq高通量测序手段构建的日本沼虾转录组文库中筛选出血红蛋白基因序列，采用RACE PCE技术获得血红蛋白cDNA全序列，并进行了原核重组表达，还分析了该基因表达产物具有抗菌作用。

背景技术

[0002] 动物的呼吸蛋白通常划分为三大类:血红蛋白(Hemoglobin,Hb)、血蓝蛋白(Hemocyanin,Hc)和蚯蚓血红蛋白(Hemerythreins,Hr)(Terwilliger,1998)。其中，血红蛋白分布最为广泛，不仅存在于脊椎动物，还存在于无脊椎动物甲壳纲。鉴于高等动物中血红蛋白参与氧的感受和运输，基于血红蛋白来揭示高等动物低氧应激调控机制一直是研究热点；而虾蟹类是否存在血红蛋白一直存在争论。传统观点认为，甲壳动物的呼吸蛋白是游离在血淋巴中的血蓝蛋白，它在肝胰腺内被合成，负责氧气的运输，起着“分子肺”(即呼吸蛋白)的作用。有趣的是甲壳动物滨蟹体内同时存在血红蛋白和血蓝蛋白(Ertas et al.,2011)，基于日本沼虾和滨蟹同属于十足目种类，日本沼虾鳃组织中也发现存在血红蛋白。

[0003] 日本沼虾(Macrobrachium nipponense)属于甲壳纲、十足目、长臂虾科、沼虾属，俗称青虾或河虾，是我国重要的淡水经济虾类。其养殖分布较广，在江苏、浙江、上海等地的水产养殖中发挥举足轻重的作用，已成为我国农业增效、农民增收的重要途径之一。随着养殖技术不断推广，养殖方式日趋多样，我国的日本沼虾产量不断提升，截至2011年已达到23万吨，产值超过100亿元。然而，因受温度、昼夜节律和季节变化以及富营养化作用的影响，再加上人为养殖管理不善，容易导致日本沼虾疾病暴发甚至大规模死亡；尤其在高温时节，养殖场所底层大量累积物(未消化饲料和排泄物)腐败分解，底泥释放大量致病细菌，致使具有底栖习性的日本沼虾长期处于生理胁迫状态，故此寻找有效的免疫增强剂来增强甲壳动物免疫机能是当前研究的热点问题。迄今，不仅日本沼虾血红蛋白的研究尚属空白，而且甲壳动物血红蛋白在其免疫反应过程中作用也鲜有报道。

发明内容

[0004] 解决的技术问题：本发明的目的在于从日本沼虾中克隆到血红蛋白，并对其进行原核表达及重组蛋白产物的抗菌功能鉴定，为日本沼虾疾病防控提供理论基础。

[0005] 技术方案：

[0006] 一种日本沼虾血红蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0007] 一种编码所述的日本沼虾血红蛋白的基因，其cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。

[0008] 所述的日本沼虾血红蛋白，其氨基酸序列具有SEQ ID NO.3所示的保守氨基酸残基位点。

[0009] 一种克隆所述的日本沼虾血红蛋白基因的方法，通过利用氮气装置模拟低氧胁迫环境，诱导并提高日本沼虾血红蛋白表达水平、提取总RNA并反转录成cDNA、设定引物、PCR扩增中间片段，利用RACE技术获得3’与5’序列，然后拼接为全长cDNA序列。

[0010] 所述的克隆日本沼虾血红蛋白基因的方法，通过利用氮气装置模拟低氧胁迫环境过程可以为将暂养在溶解氧含量为6.5mg/L水体中的日本沼虾移至低溶解氧水槽中，通过调整空气、氮气比例来调节低溶解氧水槽中氧气在水体中的含量，用溶解氧仪监测水槽中溶解氧含量的变化，直到测试值为2±0.2mg/L。

[0011] 所述的克隆日本沼虾血红蛋白基因的方法，其中设定引物的正向引物为5’AAGTTGTTCAGAGAGGAGCCTG3’，反向引物为5’TTCCTCTGAAACTCGATGACCG3’。

[0012] 一种所述的日本沼虾血红蛋白基因的重组蛋白的制备方法，将cDNA与pET-23b载体相连接，转化入克隆菌DH5a后进行阳性转化子的筛选鉴定。

[0013] 所述的日本沼虾血红蛋白在制备甲壳动物抗菌药物和饲料添加剂中的应用。

[0014] 本发明利用构建cDNA文库，采用RACE技术以及体外重组表达等技术，对日本沼虾血红蛋白进行了研究，首次从淡水虾类克隆出血红蛋白，并进行了该基因重组蛋白的携氧功能以抗菌作用的验证。本发明从日本沼虾中克隆到血红蛋白基因cDNA全长1,201bp，有一个579bp的开放阅读框，编码193个氨基酸，5’非编码区长199bp，3’非编码区长420bp，有多聚腺苷酸加尾信号和多聚腺苷酸尾巴，该基因在日本沼虾携氧功能方面发挥重要作用。利用PET30a(+)表达载体在大肠杆菌origami(DE3)重组表达了该蛋白，表达产物对具有携氧功能。其编码的蛋白具有血红蛋白特有的氨基酸残基位点，等电点为5.96。

[0015] 所述日本沼虾血红蛋白与其他节肢动物血红蛋白氨基酸序列比对图如图1所示，方框表示血红蛋白的氨基酸残基位点。

[0016] 所述血红蛋白的重组产物具有携氧的作用，具有一定的杀菌活性，能够应用于淡水虾类相关疾病的治疗、药物生产和饲料添加剂的生产中。

[0017] 有益效果

[0018] 本发明提供了日本沼虾血红蛋白基因，首次发现日本沼虾血红蛋白不仅具有携氧功能，也具有较强的抗菌作用，可广泛应用于新型医药、兽药、饲料添加剂、水产养殖的研发领域，特别对于解决目前日本沼虾疾病防控提供了重要的思路。本发明提供的血红蛋白基因的克隆方法也可借鉴应用到筛选其它甲壳动物血红蛋白基因的研究之中。

[0019] 本发明首次合成了一种日本沼虾血红蛋白，它是一种非游离的膜结合蛋白，非常便于用基因工程菌株表达，可用于水产添加剂的开发之中。

附图说明

[0020] 图1为日本沼虾血红蛋白与其他节肢动物血红蛋白氨基酸序列比对图；

[0021] 图2为实施例2中血红蛋白N端肉豆蔻酰基化图；

[0022] 图3为实施例3中日本沼虾血红蛋白在不同氧环境中表达量对比图；

[0023] 图4为实施例4中日本沼虾血红蛋白原核表达试验结果图。具体实施方式：

[0024] 下面结合实施例对本发明进一步说明，但不构成对本发明的限制。

[0025] 实施例1

[0026] 血红蛋白的cDNA全长序列的克隆

[0027] 1)将10尾日本沼虾放入玻璃钢桶中，以虾的鳃组织为研究对象提取RNA，试验系统包括塑料水槽(50cm×40cm×30cm)、充气泵、氮气罐等。试验处理组的溶解氧含量主要通过充气(调整空气、氮气比例)来调节氧气在水体中含量为2mg/L，以充空气组作为对照组。试验时将暂养在溶解氧含量为6.5mg/L水体中的日本沼虾分别移至各低溶解氧水槽中，每个水槽分别放养处于蜕皮间期健康日本沼虾20尾，各梯度均设3个平行对照组，每隔2h用YSI-556MPS型溶解氧仪监测水槽中溶解氧含量的变化，实验组实测值为(2±0.2)mg/L，低氧胁迫24h后取日本沼虾鳃组织保存于液氮中，转入-80℃超低温冰箱。

[0028] 2)总RNA的提取，采用RNAiso Plus(Total RNA提取试剂)试剂盒说明书操作，并用氯仿/酚混合抽提法去除痕量残余蛋白。具体如下

[0029] (1)取2个1.5ml离心管，分别加1ml Unizol RNA提取液，备用；

[0030] (2)取鳃组织于液氮预冷研钵中，在液氮中迅速研磨成粉末；

[0031] (3)将粉末以均等量转移到上述含1ml Unizol的离心管内，迅速混匀，室温放置5min；

[0032] (4)加100μl氯仿，迅速混匀，在漩涡振荡仪中振荡45s，14000rpm离心5min；

[0033] (5)将上清700μl转移到一无RNase的1.5ml离心管内，加560μl RNA沉淀缓冲液(奥莱博生物)，混匀，冰浴10min；

[0034] (6)10000g，4℃离心10min，弃上清；

[0035] (7)分别用100μl去离子水溶解RNA，合并成一管；

[0036] (8)加200μl氯仿/酚混合液，剧烈振荡1min，14000rpm离心5min；

[0037] (9)将上清转移到一无RNase的1.5ml离心管内，加200μl氯仿，剧烈振荡1min，14000rpm离心5min；

[0038] (10)将上清转移到一无RNase的1.5ml离心管内，加600μl无水乙醇，混匀，冰浴10min；

[0039] (11)14000rpm，4℃离心10min，弃上清后加1ml70％乙醇；

[0040] (12)14000rpm，4℃离心5min，弃乙醇，超净台中吹干10min后加6μl水溶解沉淀RNA；

[0041] (13)采用分子生物学方法提取鳃的mRNA并反转录成cDNA，第一链cDNA合成根据Primer ScriptII1st Strand cDNA Synthesis试剂盒说明书操作步骤进行，反转录过程如下：

[0042] (1)在Microtube中配制下列混合液：

[0043]

[0044] (2)在PCR仪上进行下列条件的变性、退火反应：

[0045] 65℃       5min

[0046] 冰上急冷

[0047] (3)在上述Microtube管中配制下列反转录反应液：

[0048]

[0049] (4)在PCR仪上按下列条件进行逆转录反应：

[0050] 42℃      30-60min

[0051] 95℃      5min(酶失活)处理后，冰上放置。

[0052] 3)中间片断扩增：根据转录组测序结果进行同源比对后，设计出一对引物Hb-F：5’AAGTTGTTCAGAGAGGAGCCTG3’(SEQ ID NO.4)；Hb-R：5’TTCCTCTGAAACTCGATGACCG3’(SEQ ID NO.5)；采用常规的分子生物学方法扩增日本沼虾血红蛋白的中间片断，采用PCR技术对中间片段进行验证，PCR体系如下表：

[0053]

[0054] PCR的反应程序如下：

[0055]

[0056] 4)再利用RACE技术获得3’与5’序列，RACE(rapid-amplification of cDNA ends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3’端和5’端的方法，扩增方法详见CLONTECH SMART RACE kit说明书，拼接为cDNA全长序列，扩见序列表中的SEQ ID NO.2。

[0057] 实施例2

[0058] 生物信息学分析：

[0059] 根据已获得日本沼虾血红蛋白的cDNA全长序列，利用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/上的BLAST软件比对，确定ORF共579bp，编码193个氨基酸，见SEQ ID NO.1。血红蛋白基因家族中含有8个保守的氨基酸残基位点，其序列为：Trp Phe Pro His Thr Val His Trp(SEQ ID NO.3)。采用生物信息学方法已发现日本沼虾血红蛋白中的N-豆蔻酰化所必需的保守序列MGXXSX(灰色部分)，N-末端甘氨酸上形成N-肉豆蔻酰化蛋白以增强其亲脂性(箭头所示)，证实血红蛋白是一种细胞膜结合蛋白，如图2所示。其中血红蛋白基因cDNA全长1,201bp，有一个579bp的开放阅读框，编码193个氨基酸，5’非编码区长
199bp，3’非编码区长420bp，有多聚腺苷酸加尾信号和多聚腺苷酸尾巴。

[0060] 实施例3

[0061] 荧光定量PCR分析：

[0062] 本发明验证了日本沼虾血红蛋白参与低氧应激分子过程，图3表明日本沼虾血红蛋白在低氧胁迫时显著升高。本实施例中将介绍血红蛋白荧光定量PCR的检测方法。

[0063] 荧光定量PCR(qRT-PCR)是利用高灵敏的DNA荧光染料——SYBR GreenΙ与dsDNA结合释放荧光信号的特性，来指示目的基因扩增产物量的一种电泳分析法。针对日本沼虾血红蛋白基因和β-actin基因，以反转录液为模板，使用qRT-PCR-F:5’GGTCTTCAAAGGTTGGAGCA3’(SEQ ID NO.6)；qRT-PCR-R:5’GTTCGGTGCCTTAGAGTGAG3’(SEQ ID NO.7)对此两个基因进行扩增，反应体系如下：

[0064]

[0065] 采用两步PCR法进行扩增，即首先95℃预变性1min，然后进入40个循环，每个循环中95℃变性10s，60℃延伸30s，循环结束后，从55℃缓慢升温到95℃，绘制熔解曲线。每个样本设置3个重复，每次反应都设置阴性对照和无模板对照。使用BIO-RAD iQ5荧光定量PCR仪进行PCR反应，由系统自动记录荧光曲线和数据，结果如图3所示，低氧胁迫24h后日本沼虾鳃组织的血红蛋白基因表达量显著高于常氧对照组。

[0066] 实施例4

[0067] 血红蛋白重组蛋白的制备：

[0068] 本发明提供的日本沼虾血红蛋白的基因序列和氨基酸序列，可用于原核表达、蛋白纯化技术制备血红蛋白重组蛋白产物，所以涉及到日本沼虾血红蛋白的DNA序列或原核表达方法和重组表达载体，均在此保护范围内。本实施例中将介绍原核表达制备血红蛋白的方法。

[0069] 将获得的目的cDNA与pET-23b载体相连接，转化入克隆菌DH5a后进行阳性转化子的筛选鉴定：为产生带有组氨酸标签的融合蛋白，选择pET-23b(+)作为克隆的载体，克隆具体的操作如下：

[0070] (1)目的基因的回收与测序：目的基因的回收采用TaKaRa PCR Fragment Recovery Kit进行，对回收的DNA进行测序。

[0071] (2)采用宝生物的质粒提取试剂盒进行质粒的提取。

[0072] (3)目的基因DNA片段与载体的连接，鉴于设计的引物分别带有Nde I和Hind III酶切位点，而上述两个酶切位点也是pET-23b载体放入多克隆位点，这使得基因片段能够有载体连接上。

[0073] (4)采用CaCl2法将连接产物转化至克隆菌E.coli BL21中。

[0074] (5)利用T7通用引物法和双酶切法进行阳性转化子的筛选鉴定，并对其进行终浓度为1mmol/L的IPTG诱导表达。

[0075] (6)对表达的重组蛋白进行组氨酸的亲和层析纯化，如图4所示，其中mHb为目标片段。经测定，该蛋白具有血红蛋白特有的氨基酸残基位点，等电点为5.96。

[0076] 实施例5

[0077] 人工合成血红蛋白重组产物抗菌活性测定

[0078] 试验在96孔组织培养板上进行，每孔先加入10μl的血红蛋白重组产物溶液，嗜水气单胞菌作为受试菌株检验表达产物的杀菌活性，接种5μl对数生长期的受试菌(浓度为104-105cfu/ml)，在28℃培养24h后，600nm测定细菌浓度，分3，6，12，24，48，72h记录细菌生长状况。以不加血红蛋白重组产物的溶液I作为对照组。试验时每组设3个重复，至少重复3次。研究结果发现嗜水气单胞菌只有在低血红蛋白浓度下或者不含血红蛋白的培养基中生长，表明该血红蛋白具有一定的抗菌活性。