一种水凝胶电极的制备方法与应用

摘要

一种水凝胶电极的制备方法与应用，涉及水凝胶电极。制备方法：用石墨粉为原料，加入硝酸钠、硫酸、高锰酸钾，混合后反应，直至形成粘稠的混合物，然后第一次加入纯水，继续反应，再第二次加入纯水将反应终止，再加入过氧化氢溶液用以除去未反应的高锰酸钾，经洗涤，离心，干燥，即得氧化石墨固体，氧化石墨固体经超声得到分散均匀的氧化石墨烯水溶液；将氧化石墨烯水溶液与鱼精DNA混合，再加入离心管中加热，待凝胶稳定形成后，将铜丝插入离心管底部小孔固定，即得到氧化石墨烯和鱼精DNA复合的水凝胶电极。可用于制备氧化石墨烯和鱼精DNA复合材料水凝胶生物传感器。可在检测卵巢癌线粒体DNA突变中应用。

权利要求

1.一种水凝胶电极的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)用石墨粉为原料，加入硝酸钠、硫酸、高锰酸钾，混合后反应，直至形成粘稠的混合物，然后第一次加入纯水，继续反应，再第二次加入纯水将反应终止，再加入过氧化氢溶液用以除去未反应的高锰酸钾，经洗涤，离心，干燥，即得氧化石墨固体，氧化石墨固体经超声得到分散均匀的氧化石墨烯水溶液；

2)将步骤1)得到的氧化石墨烯水溶液与鱼精DNA混合，得混合溶液，将混合溶液加入用保鲜膜包裹的底部打孔的离心管中，加热，待凝胶稳定形成后，将铜丝插入离心管底部小孔固定，即得到氧化石墨烯和鱼精DNA复合的水凝胶电极。

2.如权利要求1所述一种水凝胶电极的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述石墨粉、硝酸钠、硫酸、高锰酸钾的配比为2g∶1g∶16ml∶6g，其中，石墨粉、硝酸钠、高锰酸钾以质量计算，硫酸以体积计算。

3.如权利要求1所述一种水凝胶电极的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述硫酸采用市售浓硫酸。

4.如权利要求1所述一种水凝胶电极的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述反应的条件为在35℃下反应30min。

5.如权利要求1所述一种水凝胶电极的制备方法，其特征在于在步骤1)中，第一次加入纯水的量为92ml，所述继续反应的条件为在95℃继续反应5h；所述第二次加入纯水的量为

400ml。

6.如权利要求1所述一种水凝胶电极的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述过氧化氢溶液采用6ml质量分数为30％的过氧化氢溶液。

7.如权利要求1所述一种水凝胶电极的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述加热的时间为10min。

8.如权利要求1～7任一项所述一种水凝胶电极的制备方法制备的氧化石墨烯和鱼精DNA复合的水凝胶电极。

9.如权利要求1～7任一项所述一种水凝胶电极的制备方法制备的氧化石墨烯和鱼精DNA复合的水凝胶电极在制备氧化石墨烯和鱼精DNA复合材料水凝胶生物传感器中的应用，所述氧化石墨烯和鱼精DNA复合材料水凝胶生物传感器的制备方法如下：将氧化石墨烯和鱼精DNA复合的水凝胶电极经过聚乙烯亚胺修饰，再通过静电作用固定探针DNA，即得氧化石墨烯和鱼精DNA复合材料水凝胶生物传感器。

10.如权利要求1～7任一项所述一种水凝胶电极的制备方法制备的氧化石墨烯和鱼精DNA复合的水凝胶电极在检测卵巢癌线粒体DNA突变中的应用。

说明书

一种水凝胶电极的制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及水凝胶电极，尤其是涉及可用于电化学检测卵巢癌线粒体DNA突变的一种水凝胶电极的制备方法与应用。

背景技术

[0002] 作为严重威胁妇女健康的恶性肿瘤之一，卵巢癌发病隐匿，缺乏有效的筛查手段，临床上开展的多种检测难以切实提高卵巢癌的早期诊断率。[1-3]线粒体DNA的高突变率以及在癌细胞中的高拷贝数使其成为肿瘤非侵入性诊断的有效分子标记。[4-5]常规的突变分析方法比如超声诊断、计算机体层扫描(CT)和磁共振(MRI)等多具有成本高昂、过程复杂等缺点，相比之下，电化学方法因其具有简单、便携、低成本、高灵敏、快速、无需标记等特点受到人们的广泛关注。电极的构建和修饰是电化学检测的关键步骤。石墨烯具有优异的导电性和超高的比表面积，石墨烯的片层结构能够提供更大的比表面积用于其他分子的吸附，并且能够通过π-π作用结合多种生物分子。因此，石墨烯一经发现，便很快被用于电化学生物[6-8]传感器的构建和优化。 然而，目前文献中报道的基于石墨烯电化学生物传感器不仅构造较为复杂，而且表面固定的生物活性分子因长期储存而失活，难以真正走向临床应用。

[0003] 参考文献：

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发明内容

[0012] 本发明的目的在于提供一种基于氧化石墨烯和鱼精DNA的一种水凝胶电极的制备方法。

[0013] 本发明的第二目的在于提供氧化石墨烯和鱼精DNA复合材料水凝胶生物传感器的制备方法。

[0014] 本发明的第三目的在于提供所述水凝胶电极在检测卵巢癌线粒体DNA突变中的应用。

[0015] 所述水凝胶电极的制备方法，包括以下步骤：

[0016] 1)用石墨粉为原料，加入硝酸钠、硫酸、高锰酸钾，混合后反应，直至形成粘稠的混合物，然后第一次加入纯水，继续反应，再第二次加入纯水将反应终止，再加入过氧化氢溶液用以除去未反应的高锰酸钾，经洗涤，离心，干燥，即得氧化石墨固体，氧化石墨固体经超声得到分散均匀的氧化石墨烯水溶液；

[0017] 在步骤1)中，所述石墨粉、硝酸钠、硫酸、高锰酸钾的配比可为2g∶1g∶16ml∶6g，其中，石墨粉、硝酸钠、高锰酸钾以质量计算，硫酸以体积计算；所述硫酸可采用市售浓硫酸；所述反应的条件可为在35℃下反应30min；第一次加入纯水的量可为92ml，所述继续反应的条件可为在95℃继续反应5h；所述第二次加入纯水的量可为400ml；所述过氧化氢溶液可采用6ml质量分数为30％的过氧化氢溶液。

[0018] 2)将步骤1)得到的氧化石墨烯水溶液与鱼精DNA混合，得混合溶液，将混合溶液加入用保鲜膜包裹的底部打孔的离心管中，加热，待凝胶稳定形成后，将铜丝插入离心管底部小孔固定，即得到氧化石墨烯和鱼精DNA复合的水凝胶电极。

[0019] 在步骤2)中，所述加热的时间可为10min。

[0020] 所制备的氧化石墨烯和鱼精DNA复合的水凝胶电极可用于制备氧化石墨烯和鱼精DNA复合材料水凝胶生物传感器，所述氧化石墨烯和鱼精DNA复合材料水凝胶生物传感器的制备方法如下：

[0021] 将氧化石墨烯和鱼精DNA复合的水凝胶电极经过聚乙烯亚胺(PEI)修饰，再通过静电作用固定探针DNA，即得氧化石墨烯和鱼精DNA复合材料水凝胶生物传感器。

[0022] 所述水凝胶电极可在检测卵巢癌线粒体DNA突变中应用。

[0023] 所述基于氧化石墨烯/鱼精DNA水凝胶电极的电化学阻抗法与传统的检测卵巢癌线粒体DNA突变相比有以下优势：

[0024] 1、所述氧化石墨烯/DNA水凝胶电极制备方法简单，成本低，可以宏量制备。

[0025] 2、所制备的氧化石墨烯/DNA水凝胶电极具有性质均一、稳定、可再生、形状大小可调等特点。

[0026] 3、氧化石墨烯/DNA水凝胶含有大量的水分和鱼精DNA分子，后者与卵巢癌线粒体DNA具有类似的分子结构，因此这种凝胶应该具有较高的生物相容性和仿生特性，能够提高DNA在水凝胶表面的杂化效率。

[0027] 4、氧化石墨烯/DNA凝胶电极检测卵巢癌线粒体DNA突变灵敏度特别高，对靶序列进行高灵敏性和选择性的检测，检测下限达到1.0×10-21M。对突变热点的卵巢癌患者线粒体DNA扩增片段的检测，检测下限可达到5.69×10-13M。

[0028] 5、由于水凝胶独特的高水含量、生物相容性和仿生特性，采用水凝胶修饰电极可降低电极的峰间噪声水平，克服目前生物传感器在生物兼容性和电极-生物分子间相互作用方面的局限性，可提高DNA在电极表面的杂化效率。氧化石墨烯和鱼精DNA水凝胶含有大量的水分和鱼精DNA分子，后者与卵巢癌线粒体DNA具有类似的分子结构，因此这种凝胶应该具有较高的生物相容性和仿生特性，因此我们以氧化石墨烯和鱼精DNA水凝胶直接作为电极，在综合利用氧化石墨烯和水凝胶各自独特而优越的电化学与生物活性的同时，摆脱常规电化学传感器对标准电极的依赖，以期构建一种能够高度灵敏、特异性识别卵巢癌线粒体DNA突变的低成本新型电化学传感器。

附图说明

[0029] 图1是氧化石墨烯/DNA水凝胶制备过程的光学照片。

[0030] 图2是冷冻干燥后的氧化石墨烯/DNA水凝胶内部结构的扫描电镜照片。

[0031] 图3为所构建的电化学测量体系具体结构示意图。在图3中，GO表示氧化石墨烯。

[0032] 图4是所制备的氧化石墨烯/DNA水凝胶电极在经PEI修饰前后的Nyquist曲线图。其中曲线a是未经修饰的氧化石墨烯/DNA水凝胶电极的Nyquist曲线图，曲线b是经PEI修饰的氧化石墨烯/DNA水凝胶电极的Nyquist曲线图。

[0033] 图5是借助电化学模拟软件利用Randles&Ershlern式进行等效电路拟合的原理图。图中Rs表示电解质溶液的电阻；C表示电解质溶液与电极界面区间产生的双电层电容；Zw表示Warburg阻抗，亦即扩散阻抗；Rct表示电极与溶液接触面发生氧化还原反应时产生的电荷转移阻抗。

[0034] 图6为PEI和寡核苷酸探针修饰后的氧化石墨烯/DNA水凝胶电极与不同浓度互补靶序列溶液杂交后的电化学阻抗谱。

[0035] 图7为氧化石墨烯/DNA水凝胶电极杂交前后的阻抗变化(ΔR)与靶序列浓度间的关系图。

[0036] 图8为PEI和寡核苷酸探针修饰后的氧化石墨烯/DNA水凝胶电极分别与10-18M互补序列以及10-9M单碱基错配和完全非互补靶序列杂交前后的电化学阻抗谱。

[0037] 图9是图8电化学阻抗谱处理后的ΔR对不同靶序列的柱状图。

[0038] 图10是氧化石墨烯/DNA水凝胶电极用于检测不同浓度卵巢癌患者线粒体DNA的电化学阻抗谱图。

[0039] 图11是氧化石墨烯/DNA水凝胶电极杂交前后的阻抗变化(ΔR)与靶序列浓度间的关系图。

[0040] 图12为氧化石墨烯/DNA水凝胶电极对卵巢癌患者线粒体DNA扩增片段(1.0×10-11 -9
M)与正常人线粒体DNA扩增片段(1.0×10 M)的选择性检测图。

具体实施方式

[0041] 下面通过实施例结合附图对本发明作进一步说明。

[0042] 实施例1

[0043] 准确称取2g天然石墨粉和1g硝酸钠加入圆底烧瓶，在冰浴的条件下与46mL浓硫酸混合均匀；再将6g高锰酸钾逐次缓慢地加入到上述混合液，保持混合液温度低于20℃搅拌反应2h，然后将混合液转移至35±5℃的油浴中继续反应30min，此时反应体系为棕褐色粘稠状液体；然后向混合液中逐次缓慢地加入92mL去离子水，并将温度升至95±5℃继续反应3h，混合液由棕褐色变成亮黄色，最后加入400mL纯水终止反应，同时加入6mL质量分数为
30％的H2O2溶液中和未反应的高锰酸钾。待上述溶液冷却至室温后进行抽滤，依次用100mL盐酸水溶液(1∶10)和大量纯水反复洗涤滤饼，除去残留的金属离子和盐酸。再将滤饼重新分散在纯水中，以2000rpm低速离心10min除去未被氧化的石墨沉淀；将除去沉淀的上层混合液超声8h使其完全分散，然后以4000rpm低速离心20min除去未剥离的氧化石墨，再以
8000rpm高速离心20min，收集沉淀；将沉淀重新分散在纯水中透析一周，除去残留的盐，最后得到分散均匀的氧化石墨烯水溶液。

[0044] 实施例2

[0045] 准确吸取等体积的氧化石墨烯水溶液(6mg/mL)和鱼精DNA水溶液(10mg/mL)于烧杯中均匀混合；取一只洁净的2mL离心管，在其底部打出直径1mm左右的小孔后，用保鲜膜紧紧包裹住底部备用；用微量移液器吸取适量氧化石墨烯和鱼精DNA的混合溶液，垂直缓慢地加入离心管中，保证管内液面尽可能水平，且管壁洁净无残留液滴；启动加热混匀仪，预热至95℃；将装有氧化石墨烯和鱼精DNA混合溶液的离心管小心地移至混匀仪的加热孔内，加热10min后取出，此时混合溶液凝固形成氧化石墨烯/DNA水凝胶。将水凝胶于4℃条件下密封保存。氧化石墨烯和氧化石墨烯/DNA水凝胶的光学照片以及扫描电镜照片如图1和2所示；使用前除去底部的保鲜膜，剪取4.5cm左右直径为1mm的铜丝，在砂纸上轻轻打磨除去表面的氧化层后轻轻插入离心管底部的小孔内约0.5cm，将铜丝用胶固定后即制得氧化石墨烯/DNA水凝胶电极。

[0046] 从图1中可以观察到，氧化石墨烯与鱼精DNA的等体积混合溶液在加热前为均一稳定、可自由流动的液体；将此混合溶液于95℃下加热10min后发生凝胶化，获得氧化石墨烯/DNA水凝胶。如图1所示，水凝胶呈黑褐色，且均一无分层，室温下长时间放置亦不会发生溶胶和分层现象，表明制得的水凝胶性质稳定。

[0047] 从图2中可以清晰地看到，所制备的水凝胶具有明显的三维多孔结构。空洞彼此连通，孔径尺寸范围为亚微米到微米，孔壁由非常薄的氧化石墨烯片层堆叠而成，从而印证了氧化石墨烯自组装的发生是由其与DNA分子间强烈的非共价作用引发的。

[0048] 实施例3

[0049] 吸取适量1％的聚乙烯亚胺(PEI)溶液加入氧化石墨烯/DNA水凝胶电极中水凝胶的上方，静置30min后，弃去电极中PEI溶液，水清，即得到PEI修饰的氧化石墨烯/DNA水凝胶电极。将寡核苷酸探针溶液加入PEI修饰的氧化石墨烯/DNA水凝胶电极中水凝胶的上方，于4℃条件下孵育30min后，弃去电极中寡核苷酸探针溶液，依次用PBS和超纯水清洗，即得到固定有寡核苷酸探针的PEI修饰氧化石墨烯/DNA水凝胶电极。另取未经PEI修饰的氧化石墨烯/DNA水凝胶电极，以相同方法和条件进行孵育，即得到固定有寡核苷酸探针的氧化石墨烯/DNA水凝胶电极。氧化石墨烯/DNA水凝胶电极作为工作电极，选用直径0.5mm的铂丝电极和直径4mm的Ag/AgCl(3M KCl)电极分别作为对电极和参比电极，构成典型三电极体系。将氧化石墨烯/DNA水凝胶电极中水凝胶上方空余的离心管作为电化学池，并向其中加入电解质溶液。插入对电极和参比电极后进行检测。基于氧化石墨烯/DNA水凝胶电极的电化学测量体系见图3。所制备的氧化石墨烯/DNA水凝胶电极在经PEI修饰前后的Nyquist曲线图见图4。其中曲线a是未经修饰的氧化石墨烯/DNA水凝胶电极的Nyquist曲线图，曲线b是经PEI修饰的氧化石墨烯/DNA水凝胶电极的Nyquist曲线图。其阻抗谱在高频范围均表现为半圆弧，说明电极与溶液界面存在电子转移受限情况；在低频范围均表现为直线，说明电解质溶液内存在扩散受限情况。当向体系中加入PEI时，大量带正电的PEI分子依靠强烈的静电作用吸附到表面带负电的氧化石墨烯上，在一定程度上阻止了溶液中电子在电极表面和内部与氧化石墨烯之间的转移，从而导致整个氧化石墨烯/DNA水凝胶电极阻抗的进一步增大。

[0050] 实施例4

[0051] 向每管寡核苷酸探针样品中加入125μL灭菌后的超纯水后于涡旋振荡器上剧烈震荡混匀，即得到100μM的寡核苷酸探针贮存液，记为16223P，向每管靶序列样品中加入36μL灭菌后的超纯水后于涡旋振荡器上剧烈震荡混匀，即得到100μM的靶序列贮存液，互补和单碱基错配靶序列分别记为16223M和16223W。借助电化学模拟软件利用Randles&Ershlern式进行等效电路拟合的原理图见图5。由于氧化石墨烯/DNA水凝胶电极的电化学阻抗谱中出现了一个半圆弧，意味着存在一个时间常数，故而采用一个电容与电阻的并联电路来表征；又因为低频范围内出现了一端斜直线，意味着电极表面与溶液存在扩散受阻的情况，因而采用扩散阻抗与电子转移电阻并联后与电容串联的电路表示。根据拟合得到的等效电路计
4
算出氧化石墨烯/DNA水凝胶电极在经PEI修饰前后的电子转移阻抗分别为6.40×10Ω和
9.69×104Ω。

[0052] 实施例5

[0053] 分别吸取200μL血液样本、200μL Binding Buffer和40μL蛋白酶K(实验前用4.5mL去离子水溶解并分装)加入至1.5mL离心管中，经涡旋混匀后在70℃水浴中孵育10min，然后加入100μL异丙醇混匀。取High Filter柱子放入洁净的收集管中，将上步得到的混合液移至柱子中，以8000g离心1min，弃去滤液后将柱子放入新的收集管中。向High Filter柱子中加入500μL Inhibitor Removal Buffer(实验前用20mL无水乙醇稀释)，于室温下以8000g离心1min，弃去滤液后将柱子放入新的收集管中。向High Filter柱子中加入500μL Wash Buffer(实验前用80mL无水乙醇稀释)，于室温下以8000g离心1min，弃去滤液后将柱子放入新的收集管中。重复进行2次后于室温下以10000g离心10s，彻底去除Wash Buffer。将High Filter柱子放入灭菌后的1.5mL离心管中，加入200μL在70℃条件下预热后的Elution Buffer，于室温下以8000g离心1min，离心管中溶液即为所提取的基因组DNA溶液，将其储存于-20℃条件下备用或者用于PCR。为获得不同的实际样品进行检测，选取正常人和卵巢癌患者的基因组DNA作为模板进行PCR扩增，将得到的产物纯化后作为实际样品。PCR反应各组分为2.5μL10×Pfu DNA聚合酶缓冲液，0.5μL dNTPs(10mM)，0.5μL上游引物(20μM)，0.5μL下游引物(20μM)，0.5μL基因组DNA，0.5μL Pfu DNA聚合酶(5U/μL)和18μL去离子水。PCR条件是1)94℃预变性5min，2)94℃变性45s，退火45s，72℃延伸90s，此步重复34次，3)72℃再延伸5min。表2列出了PCR扩增实验中针对突变位点采用的引物及相应的退火温度和扩增产物长度。

[0054] 表2 针对突变位点设计的引物以及扩增产物长度和退火温度

[0055]

[0056] 将上述PCR反应体系各组分依次加入200μL无DNA酶薄壁PCR管，然后放入热循环仪中运行相应程序进行扩增。得到的产物用1.5％的琼脂糖凝胶(实验前用1mg/mL溴化乙锭染色)电泳分析，取3μL样品和1μL6×Loading Buffer混匀上样后电泳30min后于凝胶成像系统下观察并拍照。PCR产物纯化。实验前先用Buffer GPS平衡硅胶柱。向Hibind DNA柱子中加入200μL Buffer GPS平衡缓冲液，于室温条件下静置5min后以12000g离心2min，弃去收集管中的滤液，将Hibind DNA柱子重新放入收集管中。向Hibind DNA柱子中加入700μL灭菌去离子水，以12000g离心2min，弃去滤液，并将Hibind DNA柱子重新放入收集管中，柱子平衡完成。取1.5mL离心管，加入PCR产物和相当于其体积4～5倍的Buffer CP，经涡旋混匀后转移至平衡好的Hibind DNA柱子中，于室温下以10000g离心1min，弃去滤液并将Hibind DNA柱子重新放入收集管中。向Hibind DNA柱子中加入700μL DNA Wash Buffer(实验前用80mL无水乙醇稀释)，于室温下以10000g离心1min，弃去滤液，并将Hibind DNA柱子重新放入收集管中，重复进行2次，再于室温下以13000g离心2min，彻底去除DNA Wash Buffer。将纯化后的PCR产物取10μL稀释50倍后置于0.5cm标准比色皿中利用紫外—可见分光光度计检测其在260nm处的吸收值，由此确定样品浓度。据此将原样品稀释至1×10-9M。将稀释后的样品加热至100℃后保温5min，然后骤冷至室温变性解链，获得浓度为1×10-9M的靶序列溶液并稀释至不同浓度备用。

[0057] PEI和寡核苷酸探针修饰后的氧化石墨烯/DNA水凝胶电极与不同浓度互补靶序列溶液杂交后的电化学阻抗谱见图6。显然，随着靶序列浓度增加，水凝胶电极的阻抗值逐渐降低，这是因为靶序列的浓度越大，依靠其磷酸骨架引入的电荷量越多，同时与寡核苷酸探针形成的双链也越多，因而阻抗下降的幅度越大。

[0058] 氧化石墨烯/DNA水凝胶电极杂交前后的阻抗变化(ΔR)与靶序列浓度间的关系图见图7，如图7所示，ΔR与靶序列浓度的对数在10-9-10-20M范围内具有很好的线性关系：ΔR＝0.55log C+12.23(γ2＝0.9943)，且检测下限达到10-21M。

[0059] PEI和寡核苷酸探针修饰后的氧化石墨烯/DNA水凝胶电极分别与10-18M互补序列-9以及10 M单碱基错配和完全非互补靶序列杂交前后的电化学阻抗谱图见图8。电解质溶液采用10mM磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)。结果显示，PEI和寡核苷酸探针修饰后的氧化石墨烯/DNA水凝胶电极在与单碱基错配和完全非互补靶序列杂交后的阻抗仅发生十分微弱的变化，而互补靶序列即便是在浓度远远小于前两者的情况下仍然能够使水凝胶电极发生较大的阻抗变化，说明互补靶序列能够与寡核苷酸探针特异性结合形成双链，而单碱基错配和完全非互补靶序列与寡核苷酸探针之间的这种特异性很弱。由此说明，所构建的PEI和寡核苷酸探针修饰后的氧化石墨烯/DNA水凝胶电极对互补靶序列具有良好的选择性。

[0060] 图8的电化学阻抗谱处理后的ΔR对不同靶序列的柱状图见图9。

[0061] 氧化石墨烯/DNA水凝胶电极用于检测不同浓度卵巢癌患者线粒体DNA的电化学阻抗谱图见图10，从图10所示的Nyquist曲线中可以看出，同人工合成的样品体系相同，对于含有突变的卵巢癌患者线粒体DNA片段，水凝胶电极的阻抗值均随着靶序列浓度的增加而逐渐减小。

[0062] 氧化石墨烯/DNA水凝胶电极杂交前后的阻抗变化(ΔR)与靶序列浓度间的关系图见图11，如图11所示，ΔR与靶序列浓度的对数在10-9-10-12M范围内具有很好的线性关系：ΔR＝2log C+24.49(γ2＝0.993)，且检测下限达到5.69×10-13M。

[0063] 氧化石墨烯/DNA水凝胶电极对卵巢癌患者线粒体DNA扩增片段(1.0×10-11M)与正-9常人线粒体DNA扩增片段(1.0×10 M)的选择性检测图见图12。从图12中可以看出，从卵巢癌患者中提取的线粒体DNA的阻抗变化信号是正常人的4倍多。卵巢表明，该电极能较好地区分卵巢癌患者与正常人，能用于临床检测卵巢癌。

[0064] 以下给出获得寡核苷酸探针序列和的靶序列溶液的方法：

[0065] 针对卵巢癌线粒体DNA中的突变热点，设计并人工合成了长为20bp的寡核苷酸探针，见表1。由于人工合成的DNA样品呈极轻的干膜状附在样品管壁上，打开时极易散失，故溶解前，先将样品管在涡旋混匀器上剧烈震荡20s，然后慢慢打开盖子，加入适量灭菌后的超纯水溶解。由于临床研究和检测中靶序列长度通常远远大于探针序列长度，为了最大程度模拟这种情况，设计了59bp的互补和单碱基错配靶序列列于表1。

[0066] 表1 寡核苷酸探针序列和靶序列

[0067]

[0068] 实际检测样品的获得与处理方法如下：

[0069] 所采用的卵巢癌患者和正常人的血液样本全部取自厦门大学附属中山医院。人类基因组DNA分别从卵巢癌患者和正常人的血液中提取。为获得不同的实际样品进行检测，选取正常人和卵巢癌患者的基因组DNA作为模板进行PCR扩增，将得到的产物纯化后作为实际样品。实际样品通过紫外可见分光光度计确定浓度并加热骤冷解链最终稀释成不同浓度的检测液。