基于滚环扩增的限制性核酸内切酶单链切割的分析方法

摘要

本发明涉及一种基于滚环扩增的限制性核酸内切酶单链切割的分析方法。该方法中，限制性核酸内切酶的底物是含有酶切位点的DNA双链，其中一条是待检测环形单链模板，另一条是线性单链寡核苷酸。加入限制性核酸内切酶后，切割底物，环形单链模板不断减少，滚环扩增所产生的荧光信号也随之减少。通过检测荧光信号的变化分析限制性核酸内切酶对环形单链模板的切割效率。该方法为研究限制性核酸内切酶对特定单链的切割提供了快速、简便、定量的测量技术。此外，该技术还可以用来研究限制性核酸内切酶与核酸的相互作用及酶切机制、切刻酶的单链切割作用、核苷酸衍生物修饰对限制性核酸内切酶切割的影响，具有重要的科学价值和广阔的应用前景。

权利要求

1.一种基于滚环扩增的限制性核酸内切酶单链切割的分析方法，其特征在于：该分析方法由待检测的环形单链模板、与环形单链模板的核苷酸序列互补的线性单链寡核苷酸、限制性核酸内切酶、DNA聚合酶以及dNTP组成；其包括下述步骤：限制性核酸内切酶的底物为DNA双链，将底物双链中待分析的一条DNA单链进行环化，形成环形单链模板，以环形单链模板和另一条与之互补的线性单链寡核苷酸形成双链作为限制性核酸内切酶的底物，进行酶切反应；随着酶切反应的进行，环形单链模板被不断的线性化，反应体系中环形单链模板的量逐渐减少；反应后，使用滚环扩增技术检测反应体系中环形单链模板的量；由于滚环扩增只对反应体系中的环形单链模板进行扩增；扩增产物与环形单链模板的量具有直接的关系，酶切反应后剩余的环形单链模板的量反应限制性核酸内切酶对该单链的切割效率；

所述的待检测的环形单链模板，是DNA单链，或是含有一个或数个RNA核苷酸的DNA单链，或是核苷酸衍生物修饰的DNA单链，该环形单链模板含有限制性核酸内切酶的识别序列；

所述的与环形单链模板的核苷酸序列互补的线性单链寡核苷酸，是DNA单链，或是含有一个或数个RNA核苷酸的DNA单链，或是核苷酸衍生物修饰的DNA单链，该线性单链寡核苷酸的核苷酸序列与环形单链模板上的一段序列完全互补。

2.按照权利要求1所述的基于滚环扩增的限制性核酸内切酶单链切割的分析方法，其特征在于：所述的待检测的环形单链模板是预先制备的，或是在酶切反应前即时制备的。

3.按照权利要求1所述的基于滚环扩增的限制性核酸内切酶单链切割的分析方法，其特征在于：所述的限制性核酸内切酶是天然的限制性核酸内切酶，或是经人工改造的限制性核酸内切酶。

4.按照权利要求1所述的基于滚环扩增的限制性核酸内切酶单链切割的分析方法，其特征在于：所述的DNA聚合酶是用于滚环扩增的DNA聚合酶。

说明书

基于滚环扩增的限制性核酸内切酶单链切割的分析方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物化学、分子生物学、酶学、核酸化学、酶促反应动力学领域中的检测方法，具体涉及一种基于滚环扩增的限制性核酸内切酶单链切割的分析方法。

背景技术

[0002] 限制性核酸内切酶（Restriction Endonuclease，RE）是分子生物学领域应用十分广泛的一种工具酶，它们可以识别特定的DNA序列,并在特定位点上切割双链DNA。限制性核酸内切酶不仅广泛地应用在分子克隆等技术，而且还用于临床疾病的检测，例如利用限制性酶切片段长度多态性的分析来确定基因的突变。限制性核酸内切酶可以分为I、II、III和IV型，II型还可以分为IIA、IIP和IIS等。在分子生物学和分子克隆技术中最常用的是IIP型限制性核酸内切酶。但是限制性核酸内切酶对底物DNA双链的切割并非是完全对称的。有些限制性核酸内切酶对两条单链的切割具有先后顺序，有些限制性核酸内切酶对两条单链的切割速度是不同的。还有一些特殊的限制性核酸内切酶，它们只切割双链中的一条单链而对另一条单链并不切割。这类内切酶又称为切刻酶（Nicking Endonuclease），该类酶在基因修复、疾病诊断、核酸检测中具有重要的应用。当限制性核酸内切酶的底物DNA双链中的一条被核苷酸衍生物修饰时，限制性核酸内切酶切割这样的DNA双链时也会表现出非对称切割的特性，也就是说，在DNA底物中引入核苷酸衍生物，不仅会影响到被修饰链的切割，而且可能影响到未被修饰的核酸单链。检测和分析对不同链的切割效率，可以更全面地了解核苷酸衍生物对酶切的影响，进而更有效的进行酶切的构效分析。因此，研究限制性核酸内切酶对不同单链的切割效率对于开发和发现新的非对称切割的内切酶以及研究酶与核酸底物的相互作用均具有重要意义。

[0003] 目前，最常用的分析限制性核酸内切酶酶切产物的技术是电泳法、层析法、荧光法和核酸杂交方法。这些方法的缺点是操作繁琐，通量有限，定量精度低，实验时间长以及浪费人力，特别是这些方法只能检测限制性核酸内切酶对DNA双链进行切割分析，而无法对特定单链的切割进行分析。因此，开发新的检测方法，实现简便、快捷、高精度、高通量的分析限制性核酸内切酶对特定单链的切割具有重要意义。

发明内容

[0004] 本发明在于开发一种可以对限制性核酸内切酶对特定单链的切割进行简便、快捷、定量和高通量分析的方法，即一种基于滚环扩增的限制性核酸内切酶单链切割的分析方法(Single strand cleavage analysis based on Rolling circle amplification，简称SSCAR)，为研究限制性核酸内切酶的切割机制和开发新型的核酸检测方法开创新的思路。

[0005] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0006] 一种基于滚环扩增的限制性核酸内切酶单链切割的分析方法，其特征在于：该分析方法由待检测的环形单链模板、与环形单链模板的核苷酸序列互补的线性单链寡核苷酸、限制性核酸内切酶、DNA聚合酶以及dNTP组成；

[0007] 所述的待检测的环形单链模板是预先制备的，或是在酶切反应前即时制备的。

[0008] 所述的待检测的环形单链模板，是DNA单链，或是含有一个或数个RNA核苷酸的DNA单链，或是核苷酸衍生物修饰的DNA单链，该环形单链模板含有限制性核酸内切酶的识别序列。

[0009] 所述的与环形单链模板的核苷酸序列互补的线性单链寡核苷酸，是DNA单链，或是含有一个或数个RNA核苷酸的DNA单链，或是核苷酸衍生物修饰的DNA单链，该线性单链寡核苷酸的核苷酸序列与环形单链模板上的一段序列完全互补。

[0010] 所述的限制性核酸内切酶是天然的限制性核酸内切酶，或是经人工改造的限制性核酸内切酶。

[0011] 所述的DNA聚合酶是用于滚环扩增的DNA聚合酶。

[0012] 本发明基于滚环扩增的限制性核酸内切酶单链切割的分析方法包括下述步骤：

[0013] 限制性核酸内切酶的底物为DNA双链，将底物双链中待分析的一条DNA单链进行环化，形成环形单链模板（以下简称CT），以环形单链模板和另一条与之互补的线性单链寡核苷酸（以下简称ON-2）组成的双链结构作为限制性核酸内切酶的底物，进行酶切反应；随着酶切反应的进行，环形单链模板被不断的线性化，反应体系中环形单链模板的量逐渐减少；反应后，使用滚环扩增技术检测反应体系中环形单链模板的量；由于滚环扩增只对反应体系中的环形单链模板进行扩增；因此，扩增产物与环形单链模板的量具有直接的关系，酶切反应后剩余的环形单链模板的量反应限制性核酸内切酶对该单链的切割效率。

[0014] 与传统的荧光检测、电泳检测、层析检测、杂交检测方法相比，本发明具有如下优点：

[0015] 1、操作简便、不需标记、不需电泳；

[0016] 2、高通量；

[0017] 3、便于定量。

附图说明

[0018] 图1是发明的流程图。

[0019] 图2是本发明利用SSCAR分析切刻酶对核酸单链切割的原理示意图。1、含有GCTGAGG序列的线性DNA单链（top链）；2、连接酶所用的连接寡核苷酸；3、含有CCTCAGC序列的线性单链寡核苷酸（bottom链）；4、切刻酶Nb.BbvCI；5、DNA聚合酶；6、含有CCTCAGC序列的线性DNA单链（bottom链）；7、含有GCTGAGG序列的线性单链寡核苷酸（top链）。

[0020] 图3是本发明利用SSCAR分析切刻酶Nb.BbvCI对核酸单链切割的实验结果图。（A）top链和bottom链的切割时间曲线；（B）top链和bottom链的相对切割效率。Cleavage Efficiency：切割效率；Relative Cleavage Rate：相对切割效率；Time：时间；top strand：top链；bottom strand：bottom链。

[0021] 图4是本发明利用SSCAR分析限制性核酸内切酶对核酸链进行cis切割，即对核苷酸衍生物修饰的环形单链模板进行切割的示意图。8、LNA修饰的线性DNA单链；9、含有内切酶EcoRI序列的线性单链寡核苷酸；10、限制性内切酶EcoRI。

[0022] 图5是本发明利用SSCAR分析EcoRI对LNA修饰链进行cis切割的实验结果图。（A）LNA不同修饰位点的切割时间曲线；（B）相对切割效率柱状图。Cleavage Efficiency：切割效率；Relative Cleavage Rate：相对切割效率；Time：时间；Substitution Position：LNA取代位点。

[0023] 图6是本发明利用SSCAR分析限制性核酸内切酶对核苷酸进行trans切割，即对与核苷酸衍生物修饰链互补的环形单链模板进行切割的示意图。11、含有内切酶EcoRI序列线性DNA单链；12、LNA修饰的的线性单链寡核苷酸。

[0024] 图7是本发明利用SSCAR分析EcoRI对与LNA修饰链互补的进行trans切割的实验结果图。（A）LNA不同修饰位点的切割时间曲线；（B）相对切割效率柱状图。Cleavage Efficiency：切割效率；Relative Cleavage Rate：相对切割效率；Time：时间；Substitution Position：LNA取代位点。

具体实施方式

[0025] 下面结合附图和实施例详细描述本发明。

[0026] 本发明基于滚环扩增的限制性核酸内切酶单链切割的分析方法，用于限制性核酸内切酶对底物特定单链的切割分析。其特点在于将待分析的一条单链环化为环形单链，即本发明所述的环形单链模板，而另一条单链仍是线性单链，即本发明所述的线性单链寡核苷酸。

[0027] 本发明由待检测的环形单链模板、与环形单链模板的核苷酸序列互补的线性单链寡核苷酸、限制性核酸内切酶、DNA聚合酶以及dNTP组成。

[0028] 本发明基于滚环扩增的限制性核酸内切酶单链切割的分析方法包括下述步骤：环形单链模板与线性单链寡核苷酸形成互补双链，该互补双链含有限制性核酸内切酶的识别序列，限制性核酸内切酶识别该序列并切割双链；在酶切反应的不同时间点终止酶切反应；对酶切反应产物进行滚环扩增；对滚环扩增产物检测，通过测量不同时间点滚环扩增的效率，计算出限制性核酸内切酶对环形单链模板的酶切效率。

[0029] 所述的待检测的环形单链模板是预先制备的，或是在酶切反应前即时制备的。环形单链模板的制备方法在滚环扩增领域的专业文献中可以方便的获得。本发明中将环形单链模板环化前称为术语‘线性DNA单链’。例如：可以采用实施例1～3中所述的方法，利用和线性DNA单链的3’末端和5’末端首尾互补的‘连接寡核苷酸’，在T4DNA连接酶的作用下，使线性DNA单链的3’末端和5’末端通过磷酸二酯键连接，也可以通过使用Circligase ssDNA ligase将线性DNA单链直接将首尾连接，实现模板环化。其他的很多连接酶也可以用于环化反应，例如E.coli DNA ligase。不同的连接酶需要不同的反应缓冲液以及反应最适条件，这些均可在现有的专业文献中方便的获得。本发明的核心在于如何使用环形单链模板，而不是如何制备环形单链模板，所以制备环形单链模板时可以使用不同的连接酶和连接方法，但是只要在使用环形单链模板时，采用环形单链模板和线性单链寡核苷酸互补所组成的酶切的底物结构，以及使用本发明所述步骤，也属于本发明的思路和保护范围。

[0030] 所述的待检测的环形单链模板，是DNA单链，或是含有一个或数个RNA核苷酸的DNA单链，或是核苷酸衍生物修饰的DNA单链。该环形单链模板含有限制性核酸内切酶的识别序列。在环形单链模板中，是否含有RNA核苷酸或核苷酸衍生物，以及含有RNA核苷酸或核苷酸衍生物的位置和数量，由研究的目的所决定。核苷酸衍生物可以是实施例3中的锁核苷酸，也可以包括但不限于磷硫酸修饰的核苷酸、甲基化修饰的核苷酸以及氟原子修饰的核苷酸。

[0031] 所述的与环形单链模板上序列互补的线性单链寡核苷酸，是DNA单链，或是含有一个或数个RNA核苷酸的DNA单链，或是核苷酸衍生物修饰的DNA单链，以上均含有与环形单链模板上的限制性核酸内切酶的识别序列互补的识别序列。在线性单链寡核苷酸中，是否含有RNA核苷酸或核苷酸衍生物，以及含有RNA核苷酸或核苷酸衍生物的位置和数量，由研究的目的所决定。核苷酸衍生物可以是实施例3中的锁核苷酸，也可以包括但不限于磷硫酸修饰的核苷酸、甲基化修饰的核苷酸以及氟原子修饰的核苷酸。

[0032] 所述的限制性核酸内切酶是天然的限制性核酸内切酶，或是经人工改造的限制性核酸内切酶。限制性核酸内切酶的底物是含有特定核苷酸序列（也称为限制性核酸内切酶的识别序列）的核酸双链。可以是实施例1中的Nb.BbvCI或是实施例2和实施例3中的EcoRI，也可以是其他的限制性核酸内切酶。本发明中，作为限制性核酸内切酶底物的核酸双链中的一条单链是环形单链模板。不同限制性核酸内切酶的酶切反应的最适反应缓冲液和最适反应条件的选择，可以在现有的专业文献中获得。

[0033] 所述的DNA聚合酶是用于滚环扩增的DNA聚合酶。可以是实施例1～3中所用的phi29DNA聚合酶，也可以是其他用于滚环扩增的DNA聚合酶。不同聚合酶的最适反应缓冲液和最适反应条件，可以在现有的滚环扩增的专业文献中获得。滚环扩增产物的检测可以用本实施例中的荧光检测方法，也可以用滚环扩增专业领域的其他现有的检测方法，包括但不限于电泳法、层析法、杂交法。

[0034] 实施例1

[0035] 利用SSCAR分析切刻酶（Nicking Endonuclease）进行单链切割的原理示意图（图2）。

[0036] 具体步骤如下：

[0037] （一）线性DNA单链“1”或“6”与连接寡核苷酸“2”杂交；

[0038] （二）连接酶催化线性DNA单链环化为环形单链模板；

[0039] （三）环形单链模板与线性单链寡核苷酸“3”或“7”杂交，形成切割酶的底物；

[0040] （四）切割酶“4”催化的非对称切割；

[0041] （五）DNA聚合酶“5”催化滚环扩增。

[0042] 1、分析切刻酶Nb.BbvCI对top链的切割

[0043] （1）设计寡核苷酸：

[0044] 制备3条寡核苷酸（ON-CT-TS是线性DNA单链，将被环化为环形单链模板，ON-1是连接酶所用的连接寡核苷酸，ON-2-BS是切割酶所用的线性单链寡核苷酸），序列见表1。

[0045] 表1.实施例1-1中所用的寡核苷酸序列

[0046]

[0047] 表1序列中的p表示磷酸基团。

[0048] （2）环形单链模板的制备：

[0049] 配制10μl连接反应体系缓冲液（50mM Tris pH8.0,10mM MgCl2,5mM DTT和0.1mM ATP），加入10pmol线性DNA单链ON-CT-TS、20pmol连接寡核苷酸ON-1和175U T4DNA连接酶，16℃孵育1小时。

[0050] （3）环形单链模板的酶切：

[0051] 配制10μl酶切反应体系缓冲液（2mM Tris-Acetate pH7.9,Potassium Acetate5mM,Magnesium Acetate1mM,and BSA10μg/ml），加入含有0.5pmol环形单链模板、2.0pmol线性单链寡核苷酸ON-2-BS和5U切刻酶Nb.BbvCI。

[0052] 分别在酶切反应的0、5、10、30和60分钟取样，将样品升温至90℃，保持20分钟，终止酶切反应。

[0053] （4）酶切产物的滚环扩增：

[0054] 配制100μl的聚合反应体系缓冲液（50mM Tris pH7.5,10mM MgCl2,10mM(NH4)2SO4,4mM DTT,SYB Green II(1:10000)和3U phi29DNA聚合酶）；加入0.25pmol酶切反应产物，进行滚环扩增。

[0055] 利用多功能酶标仪（Microplate Reader，Infinite M200,Tecan,USA）检测滚环扩增反应的荧光信号。实验温度为37℃，激发波长480nm，发射波长524nm。信号采集时间为20微秒，每15秒采集一次信号，检测时间为30分钟。

[0056] （5）计算酶切效率：

[0057] 通过扩增效率分析切刻酶Nb.BbvCI对top链的切割效率。RCA的荧光时间曲线的斜率作为滚环扩增效率，反应环形单链模板的量。酶切不同时间点的滚环扩增效率为Rt与酶切前扩增效率为R0，酶切效率为(R0-Rt)/R0（图3）。

[0058] 2、分析切刻酶Nb.BbvCI对bottom链的切割

[0059] （1）设计寡核苷酸：

[0060] 制备3条寡核苷酸（ON-CT-BS是线性DNA单链，将被环化为环形单链模板，ON-1是连接酶所用的连接寡核苷酸，ON-2-TS是切割酶所用的线性单链寡核苷酸），序列见附表2。

[0061] 表2.实施例1-2中所用的寡核苷酸序列

[0062]

[0063] 表2序列中的p表示磷酸基团。

[0064] （2）环形单链模板的制备：

[0065] 配制10μl连接反应体系缓冲液（50mM Tris pH8.0,10mM MgCl2,5mM DTT和0.1mM ATP），加入10pmol线性DNA单链ON-CT-BS、20pmol连接寡核苷酸ON-1和175U T4DNA连接酶，16℃孵育1小时。

[0066] （3）环形单链模板的酶切：

[0067] 配制10μl酶切反应体系缓冲液（2mM Tris-Acetate pH7.9,Potassium Acetate5mM,Magnesium Acetate1mM,and BSA10μg/ml），加入含有0.5pmol的环形单链模板、2.0pmol线性单链寡核苷酸ON-2-TS和5U切刻酶Nb.BbvCI。

[0068] 分别在0、5、10、30和60分钟取样，将其升温至90℃，终止酶切反应，保持20分钟。

[0069] （4）酶切产物的滚环扩增：

[0070] 配制100μl的聚合反应体系缓冲液（50mM Tris pH7.5,10mM MgCl2,10mM(NH4)2SO4,4mM DTT,SYB Green II(1:10000)和3U phi29DNA聚合酶）；加入0.25pmol酶切反应产物，进行滚环扩增。

[0071] 利用多功能酶标仪（Microplate Reader，Infinite M200,Tecan,USA）检测滚环扩增反应的荧光信号。实验温度为37℃，激发波长480nm，发射波长524nm。信号采集时间为20微秒，每15秒采集一次信号，检测时间为30分钟。

[0072] （5）计算酶切效率：

[0073] 通过扩增效率分析切刻酶Nb.BbvCI对bottom链的切割效率。RCA的荧光时间曲线的斜率作为滚环扩增效率，反应环形单链模板的量。酶切不同时间点的滚环扩增效率为Rt与酶切前扩增效率为R0，酶切效率为(R0-Rt)/R0（图3）。

[0074] 实施例2

[0075] 利用SSCAR分析EcoRI对锁核苷酸（locked nucleic acid，LNA）修饰的寡核苷酸单链的切割。由于LNA修饰和EcoRI酶切发生在同一条环形单链模板上，故称为cis酶切（图4）。具体步骤如下：

[0076] （一）LNA修饰的线性DNA单链“8”与连接寡核苷酸“2”杂交；

[0077] （二）连接酶催化线性DNA单链环化为环形单链模板；

[0078] （三）环形单链模板与线性单链寡核苷酸“9”杂交，形成限制性核酸内切酶的底物；

[0079] （四）限制性核酸内切酶“10”催化环形单链模板的切割；

[0080] （五）DNA聚合酶“5”催化滚环扩增。

[0081] （1）设计寡核苷酸：

[0082] 制备11条寡核苷酸链（九条ON-CT-X是线性DNA单链，将被环化为环形单链模板，ON-1是连接酶所用的连接寡核苷酸，ON-2是内切酶EcoRI所用的线性单链寡核苷酸），序列见附表3。

[0083] 表3.实施例2中所用的寡核苷酸序列

[0084]

[0085]

[0086] 表3序列中的p表示磷酸基团，LNA核苷酸用小写字母a、t、g、c表示。待分析九条是序列相同的线性DNA单链，均含有EcoRI的识别序列‘GAATTC’，其中八条线性DNA单链是在酶切识别序列以及两侧相邻的两个位点上依次被LNA修饰。

[0087] （2）环形单链模板的制备：

[0088] 配制10μl连接反应体系缓冲液（50mM Tris pH8.0,10mM MgCl2,5mM DTT和0.1mM ATP），加入10pmol线性DNA单链ON-CT-X（X代表LNA修饰）、20pmol连接寡核苷酸ON-1和175U T4DNA连接酶，16℃孵育1小时。

[0089] （3）环形单链模板的酶切：

[0090] 配制10μl酶切反应体系缓冲液（2mM Tris-Acetate pH7.9,Potassium Acetate5mM,Magnesium Acetate1mM,and BSA10μg/ml），加入含有0.5pmol的环形单链模板、2.0pmol线性单链寡核苷酸ON-2和5U内切酶EcoRI。

[0091] 分别在0、5、10、30和60分钟取样，将其升温至90℃，终止酶切反应，保持20分钟。

[0092] （4）酶切产物的滚环扩增：

[0093] 配制100μl的聚合反应体系缓冲液（50mM Tris pH7.5,10mM MgCl2,10mM(NH4)2SO4,4mM DTT,SYB Green II(1:10000)和3U phi29DNA聚合酶）；加入0.25pmol酶切反应产物，进行滚环扩增。

[0094] 利用多功能酶标仪（Microplate Reader，Infinite M200,Tecan,USA）检测滚环扩增反应的荧光信号。反应温度为37℃，激发波长480nm，发射波长524nm。信号采集时间为20微秒，每15秒采集一次信号，检测时间为30分钟。

[0095] （5）计算酶切效率：

[0096] 通过扩增效率分析EcoRI对LNA修饰的单链的切割效率。RCA的荧光时间曲线的斜率作为滚环扩增效率，反应环形单链模板的量。酶切不同时间点的滚环扩增效率为Rt与酶切前扩增效率为R0，酶切效率为(R0-Rt)/R0（图5）。

[0097] 实施例3

[0098] 利用SSCAR分析在EcoRI酶反应中LNA修饰的寡核苷酸单链对互补的环形单链模板的影响。由于LNA修饰在线性单链寡核苷酸上，而EcoRI酶切发生在环形单链模板上，故称为trans酶切（图6）。具体步骤如下：

[0099] （一）线性DNA单链“11”与连接寡核苷酸“2”杂交；

[0100] （二）连接酶催化线性DNA单链环化为环形单链模板；

[0101] （三）环形单链模板与LNA修饰的线性单链寡核苷酸“12”杂交，形成限制性核酸内切酶的底物；

[0102] （四）限制性核酸内切酶“10”催化环形单链模板的切割；

[0103] （五）DNA聚合酶“5”催化滚环扩增。

[0104] （1）设计寡核苷酸：

[0105] 制备11条寡核苷酸（ON-CT-DNA是一条线性DNA单链，将被环化为环形单链模板，ON-1是连接酶所用的连接寡核苷酸，ON-2-X（X代表LNA修饰）是九条内切酶EcoRI所用的线性单链寡核苷酸），序列见附表4。

[0106] 表4.实施例3中所用的寡核苷酸序列

[0107]

[0108]

[0109] 表4序列中的p表示磷酸基团，LNA核苷酸用小写字母a、t、g、c表示。待分析的一条线性DNA单链，含有EcoRI的酶切识别序列‘GAATTC’，与之互补的九条线性单链寡核苷酸在酶切识别序列以及两侧相邻的两个位点上依次被LNA修饰。

[0110] （2）环形单链模板的制备：

[0111] 配制10μl连接反应体系缓冲液（50mM Tris pH8.0,10mM MgCl2,5mM DTT和0.1mM ATP），加入10pmol线性DNA单链ON-CT-DNA、20pmol连接寡核苷酸ON-1和175U T4DNA连接酶，16℃孵育1小时。

[0112] （3）环形单链模板的酶切：

[0113] 配制10μl酶切反应体系缓冲液（2mM Tris-Acetate pH7.9,Potassium Acetate5mM,Magnesium Acetate1mM,and BSA10μg/ml），加入含有0.5pmol的环形单链模板、2.0pmol线性单链寡核苷酸ON-2-X和5U内切酶EcoRI。

[0114] 分别在0、5、10、30和60分钟取样，将其升温至90℃，终止酶切反应，保持20分钟。

[0115] （4）酶切产物的滚环扩增：

[0116] 配制100μl的聚合反应体系缓冲液（50mM Tris pH7.5,10mM MgCl2,10mM(NH4)2SO4,4mM DTT,SYB Green II(1:10000)和3U phi29DNA聚合酶）；加入0.25pmol酶切反应产物，进行滚环扩增。

[0117] 利用多功能酶标仪（Microplate Reader，Infinite M200,Tecan,USA）检测滚环扩增反应的荧光信号。反应温度为37℃，激发波长480nm，发射波长524nm。信号采集时间为20微秒，每15秒采集一次信号，检测时间为30分钟。

[0118] （5）计算酶切效率：

[0119] 通过扩增效率分析EcoRI对LNA修饰链的互补单链的切割效率。RCA的荧光时间曲线的斜率作为滚环扩增效率，反应环形单链模板的量。酶切不同时间点的滚环扩增效率为Rt与酶切前扩增效率为R0，酶切效率为(R0-Rt)/R0（图7）。