本发明属于食品领域，涉及一种测定三甲胺含量的方法。具体地，本发明涉及一种测定食用油中特别是植物油中三甲胺含量的方法。本发明还涉及一种从食用油中分离三甲胺的方法，以及一种测定三甲胺含量的试剂盒。本发明首次建立了食用油中三甲胺含量的测定方法，并且建立了全新的从食用油中分离三甲胺的方法。本发明的测定方法具有灵敏度高、选择性强、操作简单等优点，方法检测限可达到5.0μg/kg。
1.一种从食用油中分离三甲胺的方法，包括下述步骤：(1)称取适量食用油，并与适量的酸溶液混合；
(3)向水溶液层中加入适量正辛醇，然后加入适量碱至pH大于或等于11.8，迅速密封，振荡；
(5)向步骤(4)中得到的上清液加入适量酸使pH小于7，振荡，离心，吸取下层液；
(6)将步骤(5)中的下层液，进行滤膜过滤，得到通过滤膜的液体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于如下的1)－7)项中的任意一项或者多项：
1)步骤(1)或(5)中所述酸独立地为选自盐酸、硫酸、磷酸、甲酸和醋酸中的任一种或者多种；
2)步骤(1)中所述酸溶液的加入量为样品体积的0.1－2倍；
3)步骤(2)或(4)中所述离心独立地为在大于4000r/min离心至少3min；
4)步骤(3)中正辛醇加入量为酸溶液量的0.05－2倍；
5)步骤(3)中所述碱为选自NaOH、KOH和CaOH水溶液中的任一种或者多种；
6)步骤(5)中所述离心为在大于3000r/min离心至少1min；
7)步骤(6)中所述滤膜选自PTFE、PVDF、PES、CA/CN、PP和Nylon6滤膜。
3.根据权利要求1所述的从食用油中分离三甲胺的方法，其中，步骤(1)或(5)中所述酸为盐酸。
4.根据权利要求1所述的从食用油中分离三甲胺的方法，其中，步骤(1)或(5)中所述酸为0.1mol/L的盐酸。
5.根据权利要求1所述的从食用油中分离三甲胺的方法，其中，步骤(1)中所述酸溶液的加入量为样品体积的0.4－0.8倍。
6.根据权利要求1所述的从食用油中分离三甲胺的方法，其中，步骤(1)中所述酸溶液的加入量为样品体积的0.5倍。
7.根据权利要求1所述的从食用油中分离三甲胺的方法，其中，步骤(2)或(4)中所述离心为5000r/min离心5min。
8.根据权利要求1所述的从食用油中分离三甲胺的方法，其中，步骤(3)中正辛醇加入量为酸溶液量的0.1－0.5倍。
9.根据权利要求1所述的从食用油中分离三甲胺的方法，其中，步骤(3)中所述碱为NaOH。
10.根据权利要求1所述的从食用油中分离三甲胺的方法，其中，步骤(3)中所述碱为
11.根据权利要求1所述的从食用油中分离三甲胺的方法，其中，步骤(5)中所述离心为3500r/min离心2min。
12.根据权利要求1所述的从食用油中分离三甲胺的方法，其中，步骤(6)中所述滤膜为PTFE滤膜。
13.根据权利要求1所述的从食用油中分离三甲胺的方法，其中，步骤(6)中所述滤膜孔径为0.22μm或0.45μm。
14.根据权利要求1所述的从食用油中分离三甲胺的方法，其中，步骤(6)中所述滤膜孔径为0.22μm。
15.根据权利要求1所述的从食用油中分离三甲胺的方法，其中，所述食用油为植物油。
16.一种测定食用油中三甲胺含量的方法，包括权利要求1-14任一项所述的从食用油中分离三甲胺的步骤；
(7)将步骤(6)的通过滤膜的液体进行离子色谱分析；
检测仪器：Thermo ICS-5000，色谱柱：IonPac CS12A+CG12A，淋洗液：12mM硫酸或甲磺酸，
17.一种分离三甲胺的试剂盒，包括：10M NaOH 5ml、0.1mol/L的盐酸25ml、正辛醇
18.根据权利要求17所述的试剂盒，其为用于分离食用油中的三甲胺的试剂盒。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中，所述食用油为植物油。
一种测定食用油中三甲胺含量的方法
技术领域
[0001] 本发明属于食品领域，涉及一种测定三甲胺含量的方法。具体地，本发明涉及一种测定食用油中特别是植物油中三甲胺含量的方法。本发明还涉及一种从食用油中分离三甲胺的方法，以及一种测定三甲胺含量的试剂盒。
背景技术
[0002] 三甲胺(Trimethylamine，简写TMA)，分子式N(CH3)3，属于机化合物，也是最简单的叔胺类化合物。三甲胺是气体，呈刺激性鱼和氨气味；溶于水、醇和乙醚；易燃；相对密度20
(d 4)0.632，沸2.9℃，凝固点－117.1℃。三甲胺的结构式如下面的式I所示：
[0003] 式I
[0004] 三甲胺有毒，对人的嗅觉阈浓度0.002mg/L。浓的三甲胺水溶液能引起皮肤剧烈的烧灼感并使其潮红；洗去溶液后，皮肤上仍残留点状出血，并在短时内感觉疼痛。
[0005] 磷脂酰胆碱(PC)俗称卵磷脂,是生命活动基础物质,广泛存在于动植物和人的细胞膜和卵细胞中，它是胆碱的主要来源。卵磷脂的稳定性受光、温度、湿度、溶剂、pH值等的影响，易发生水解、氧化、羟基化、氢化等反应，尤其是在酸、碱、酶作用下发生水解，得到脂肪酸磷脂甘油和胆碱，而胆碱进一步水解即产生三甲胺。
[0006] 目前已知的三甲胺测定方法有酸滴定法、微量扩散法、有机溶剂提取后气相色谱法、苦味酸盐比色法、顶空气相色谱法等。前两者测定的是总挥发胺，误差较大；有机溶剂提取后气相色谱法灵敏度低；苦味酸盐比色法是目前测定火腿中三甲胺的国标法，但该法要用高毒试剂甲苯，测得的是各种能与苦味酸结合的有机胺的总和，结果偏高。游离的三甲胺属于可挥发性气体，其沸点为3℃，基于基质固相微萃取的顶空气相色谱法以应用在鱼肉中三甲胺的含量，及水体中的低分子量胺类，然而此法前处理繁琐，成本较高，并且由于食用油中含有大量挥发性风味气体，采用基质固相微萃取的顶空气相色谱法会产生大量干扰，选择性不强。基于电子鼻的方法也见于报道，但总的来说还是定性识别的多，定量检测的少，而且由于敏感原理的限制，在气体识别的分辨力和气体检测的灵敏度以及抗湿度干扰等方面还有待加强。
[0007] 离子色谱(ion Chromatography)是高效液相色谱的一种。离子色谱利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子色谱的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配。固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相的运动而运动，最终实现分离。凡在溶液中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法进行分离。现在它不仅适用于无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子，因此应用范围较广。
[0008] 目前尚需要一种有效的并且高灵敏度的测定食用油中三甲胺含量的方法。
发明内容
[0009] 本发明经过深入的研究和创造性的劳动，有效地从食用油中分离出三甲胺，并得到了一种测定食用油中三甲胺含量或者浓度的方法，其灵敏度高，操作简便。由此提供了下述发明：
[0010] 本发明的一个方面涉及一种从食用油中分离三甲胺的方法，包括下述步骤：
[0011] (1)称取适量食用油，并与适量的酸溶液混合；
[0012] (2)离心，弃去上层油脂，保留下层的水溶液；
[0013] (3)向水溶液层中加入适量正辛醇，然后加入适量碱至pH大于或等于11.8，迅速密封，振荡；
[0014] (4)离心，取上清液；
[0015] (5)向步骤(4)中得到的上清液加入适量酸使pH小于7，振荡，离心，吸取下层液；
[0016] (6)将步骤(5)中的下层液，进行滤膜过滤，得到通过滤膜的液体。
[0017] 根据本发明任一项所述的分离三甲胺的方法，其中，步骤(1)中，优选地，混合后进行振荡；优选地，使三甲胺溶解于酸溶液中。具体地，三甲胺以离子形态溶解于酸溶液中。
[0018] 根据本发明任一项所述的分离三甲胺的方法，其中，步骤(1)或(5)中所述酸为独立地选自盐酸、硫酸、磷酸、甲酸和醋酸中的任一种或者多种；优选为盐酸；更优选为0.1mol/L的盐酸。
[0019] 根据本发明任一项所述的分离三甲胺的方法，其中，步骤(1)酸溶液的加入量为样品体积的0.1－2倍或0.1－1倍；优选地为0.4－0.8倍；具体地，为0.4、0.5、0.6、0.7或0.8倍；更优选地为0.5倍。
[0020] 根据本发明任一项所述的分离三甲胺的方法，其中，步骤(2)或(4)中所述离心独立地为在大于4000r/min离心至少3min；优选为5000r/min离心5min。步骤(3)中所述离心为在大于3000r/min离心至少1min；优选为3500r/min离心2min。
[0021] 根据本发明任一项所述的分离三甲胺的方法，其中，步骤(3)中，优选地，pH大于或等于12。具体地，步骤(3)中所述碱为选自NaOH、KOH和Ca(OH)2水溶液中的任一种或者多种；优选为NaOH水溶液；更优选为10mol/L的NaOH水溶液。
[0022] 根据本发明任一项所述的分离三甲胺的方法，其中，步骤(3)中所述正辛醇加入量为酸溶液量的0.05－2倍或0.05－1倍；优选地为0.1－1倍或0.1－0.5倍；具体地，为0.1、0.2、0.3、0.4或0.5倍。
[0023] 根据本发明任一项所述的分离三甲胺的方法，其中，步骤(5)中所述离心为在大于3000r/min离心至少1min；优选为3500r/min离心2min。
[0024] 根据本发明任一项所述的分离三甲胺的方法，其中，步骤(6)中使用针头过滤器进行滤膜过滤。具体地，所述针头过滤器的滤膜选自PTFE、PVDF、PES、CA/CN、PP和Nylon6滤膜；优选为PTFE滤膜；优选地，滤膜孔径为0.22μm或0.45μm，优选为0.22μm。
[0025] 本发明的另一方面涉及一种测定食用油中三甲胺含量的方法，包括本发明中任一项所述的从食用油中分离三甲胺的步骤。
[0026] 根据本发明任一项所述的测定食用油中三甲胺含量的方法，其还包括下述步骤：
[0027] (7)将步骤(6)的通过滤膜的液体进行离子色谱分析。
[0028] 根据本发明任一项所述的测定食用油中三甲胺含量的方法，其中所述离子色谱分析的条件是：
[0029] 检测仪器：Thermo ICS-5000，
[0030] 色谱柱：IonPac CS12A+CG12A，
[0031] 淋洗液：12mM硫酸或甲磺酸，
[0032] 淋洗液流速：1.0mL/min，
[0033] 抑制器：CSRS300 4mm，
[0034] 抑制电流：74mA，
[0035] 进样量：25μL。
[0036] 本发明的再一方面涉及一种分离三甲胺的试剂盒，包括：10MNaOH5ml、0.1mol/L的盐酸25ml、正辛醇2ml、PTFE滤膜。
[0037] 根据本发明所述的试剂盒，其为用于分离食用油中特别是植物油中的三甲胺的试剂盒。
[0038] 本发明中，所述振荡为涡旋振荡，特别是剧烈涡旋振荡。
[0039] 在本发明中，所述食用油是指液态食用油(在常温常压下)；例如植物油。其具体种类并不特别限定，可以是一种植物油，也可以是多种植物油的混合物。
[0040] 发明的有益效果
[0041] 本发明首次建立了食用油中三甲胺含量的测定方法，并且建立了全新的从食用油中分离三甲胺的方法。本发明的测定方法具有灵敏度高、选择性强、操作简单等优点，方法检测限可达到5.0μg/kg。
附图说明
[0042] 图1：标准样品色谱图。其中：三甲胺在9.02min时间出峰。胆碱在11.45min时间出峰。胆碱是植物油中磷脂酰胆碱(卵磷脂，PC)的代谢产物之一，用于指示三甲胺与胆碱能够达到完全的分离，互不影响监测准确性。其它峰为阳离子杂峰，不对检测产生影响。
[0043] 图2：为图1的局部放大图。其中：三甲胺在9.02min时间出峰。胆碱在11.45min时间出峰。
[0044] 图3：三甲胺浓度－响应面积标准曲线图。
具体实施方式
[0045] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0046] 实施例1：标准样品的离子色谱图的获得
[0047] 胆碱是植物油中磷脂酰胆碱(卵磷脂，PC)代谢产物之一，用于指示三甲胺与胆碱能够达到完全的分离，互不影响监测准确性。
[0048] 不拘于理论的限制，三甲胺的出峰时间可能会影响到检测浓度。如果仪器参数、所用洗脱溶液不合适，可能将三甲胺与干扰物质不能完全色谱分离，对定性、定量形成干扰，因此，通过标准样品不断调整仪器参数和洗脱液是必要的。
[0049] 因此，需要适当的仪器参数等保证被检测的物质没有杂质干扰，即三甲胺与其他常见干扰离子实现基线分离。
[0050] 将浓度为1000mg/L的三甲胺标准溶液，通过逐级准确的稀释，得到浓度较低、含量准确的一系列标准工作液，如0.3mg/L-1.5mg/L,然后经设备检测，得到一组不同浓度的三甲胺的响应面积，然后用最小二乘法绘制曲线。
[0051] 具体地，准确称取三甲胺盐酸盐(纯度98％以上，CAS：593-81-7)0.16200g，用0.1mol/L盐酸溶液溶解，定容至100mL摇匀，此溶液为三甲胺浓度1000mg/L标准储备溶液。
采用逐级稀释的方法，将储备液逐级稀释成适合仪器检测的标准工作液，具体地为1.5mg/L。将稀释得到的标准工作液进样检测，得到标准色谱图即附图1－2。
[0052] 由图1－2可见，三甲胺在9.02min时间出峰。胆碱在11.45min时间出峰。其它峰为阳离子杂峰，不对检测产生影响。
[0053] 实施例2：植物油中三甲胺的测定
[0054] 1.试剂配制
[0055] 储备液配置：准确称取三甲胺盐酸盐(纯度98％以上，CAS：593-81-7)0.16200g，用0.1mol/L盐酸溶液溶解，定容至100mL摇匀，此溶液为1000mg/L标准储备溶液。4℃可保存1年。
[0056] 采用逐级稀释的方法，将储备液逐级稀释成浓度为0.3mg/L、0.6mg/L、0.9mg/L、1.5mg/L、5.0mg/L梯度的线性工作液，备用。
[0057] 10M NaOH：称取40g NaOH，100mL水溶解定容。
[0058] 0.1mol/L HCl：取8.3mL的浓盐酸倒入广口瓶，加去离子水定容至1L。
[0059] 2.仪器条件
[0060] 检测仪器：Thermo ICS-5000，
[0061] 色谱柱：IonPac CS12A+CG12A，
[0062] 淋洗液：12mM硫酸
[0063] 淋洗液流速：1.0mL/min，
[0064] 抑制器：CSRS300 4mm，
[0065] 抑制电流：74mA，
[0066] 进样量：25μL。
[0067] 3.实验方法：
[0068] 1)称样：在100mL离心管中称取50g植物油；
[0069] 2)正相提取：加入20mL0.1mol/L盐酸，剧烈涡旋振荡2min；
[0070] 3)反相提取：将步骤2)中的产物以5000r/min离心5min，弃去上层，水层移入另一100mL离心管中，加入20mL正辛醇，加入10MNaOH5mL，迅速盖紧盖子，涡旋振荡2min，5000r/min离心5min，取上清液；
[0071] 4)反提：将步骤3)中得到的上清液转入50mL离心管中，加入2mL0.1mol/L盐酸，振荡，3500r/min离心2min，吸取下层液；
[0072] 5)过滤：将步骤4)中的下层液过PTFE滤膜，得到通过PTFE滤膜的液体；
[0073] 6)检测：将步骤5)中得到的液体进行ICS分析，仪器条件如上所述。先依次将浓度为0.3mg/L、0.6mg/L、0.9mg/L、1.5mg/L、5.0mg/L梯度的线性工作液进样分析，以最小二乘法拟合线性方程、绘制曲线(如附图3)。再将实验样品处理溶液进样分析，以保留时间(RT)定性、线性方程曲线计算样品浓度。
[0074] 4.计算方法：
[0075] 按照下面的式子计算。
[0076]
[0077] 其中，
[0078] X：样品中三甲胺的浓度，mg/kg；
[0079] c:根据线性方程计算，得出的进样样品浓度，mg/L
[0080] V：进样样品总体积，即步骤(4)加入酸的体积，mL；
[0081] m：步骤(1)称取检测样品的质量，g。
[0082] 5.实验结果
[0083] 样品中的三甲胺的浓度是0.015mg/kg。
[0084] 尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
