一种氧化石墨烯混合材料的基质固相分散剂的应用

摘要

本发明涉及一种基质固相分散剂及其应用，尤其是一种以氧化石墨烯的混合材料作为基质固相分散剂及其应用，属于化学技术领域。本发明利用一种氧化石墨烯和弗罗里硅土的混合材料作为基质固相分散剂，以HPLC-MS/MS法的正离子模式MRM的检测方式测定小麦粉样品中的18种真菌毒素，其优点是提高真菌毒素检测方法的回收率和增强了方法的通用性，使不具正负离子切换模式的质谱也可实现检测要求，并且灵敏度和检出限能满足各项标准的要求。

权利要求

1.一种氧化石墨烯混合材料的基质固相分散剂的应用，包括以下步骤：步骤一、制备样品，将氧化石墨烯混合材料的基质固相分散剂和小麦粉按比例用漩涡混匀器混合3-5min，其中小麦粉的质量为氧化石墨烯的2-10倍；混合物转移于研钵中，研磨5-10min，所述分散剂由氧化石墨烯和弗罗里硅土组成，所述弗罗里硅土的质量为氧化石墨烯的8-40倍；

步骤二、小麦粉样品的提取净化，混合物用甲醇溶液淋洗样品，再用含1％-3％浓盐酸的甲醇溶液洗脱目标分析物，收集洗脱液,30℃-50℃下氮气吹近干，加入乙腈，过滤后待测；

步骤三、用高效液相色谱-串联三重四级杆法，以正离子模式的MRM方法测定小麦粉样品中的真菌毒素，色谱条件如下，色谱柱是美国Thermo公司Hypersil ODS C18柱

150mm×2.1mm，3.5μm；柱温25℃；进样量1μL；流速0.3mL/min；梯度洗脱程序是A：

10mmol/L醋酸铵+0.1％甲酸水溶液，B：甲醇作流动相进行梯度洗脱，0-3min，90％B；

3-6min，60-55％B；6-12min，55-5％B；12-14min，5％B；14-15min，90％B；质谱条件如下，离子源是电喷雾离子源；电离方式是ESI+；检测方式是多反应监测(MRM)；毛细管电压是

3.5kV；雾化气压力是40psi；干燥气流速是10L/min；干燥气温度是350℃；

步骤四、绘制标准曲线,计算样品中各种真菌毒素的含量，计算公式为，式中，Xi—样品中各真菌毒素的含量，单位μg/kg；

Ci—从标准工作曲线上得到被测组分溶液浓度，单位纳克每毫升ng/mL；

V—样品定容体积，单位毫升mL；

m—样品的质量，单位克g。

2.根据权利要求1所述氧化石墨烯混合材料的基质固相分散剂的应用，其特征在于：所述步骤一中，称取0.5g小麦粉、0.1g氧化石墨烯和2g弗罗里硅土于150mL三角瓶中，混合物用漩涡混匀器混合3-5min，混匀后转移于研钵中，研磨5min，在5ml玻璃注射器的底层放置一块筛板，将研磨后的混合物转移到注射器中，样品上方再放置一筛板，压实。

3.根据权利要求1所述氧化石墨烯混合材料的基质固相分散剂的应用，其特征在于：所述步骤二中，甲醇溶液用量为5ml，淋洗的流速为1ml/min，弃去淋洗液，再用含2％盐酸的甲醇溶液洗脱目标分析物，收集洗脱液；乙腈的加入量为200μL，过滤用0.22μm的四氟乙烯滤膜。

说明书

一种氧化石墨烯混合材料的基质固相分散剂的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种基质固相分散剂及其应用，尤其是一种以氧化石墨烯的混合材料作为基质固相分散剂及其应用，属于化学技术领域。

背景技术

[0002] 真菌毒素(mycotoxin)是真菌在生长繁殖过程中产生的次生有毒代谢产物。目前常见的真菌毒素有：黄曲霉毒素类(AFs)、赭曲霉毒素类(OTs)、伏马毒素类(FBs)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)等毒素。真菌毒素广泛污染农作物、食品及饲料等植物源性食品，研究证实，部分真菌毒素可引起人类和动物急性或慢性中毒，损害机体的肝脏、肾脏、神经组织、造血组织及皮肤组织等，因而国内外对真菌毒素有严格的限量规定。

[0003] 由于食品中真菌毒素含量较低，样品基质复杂，因而目标分析物的分离富集方法成为制约检测时间和回收率的瓶颈技术。目前，常见的样品前处理技术有免疫亲和柱、固相萃取(SPE)、QuEChERS、液液萃取和基质固相分散法(MSPD)等。其中，免疫亲和柱采用特异性免疫反应作为分离手段，但由于各种毒素的分子结构和性质差异很大，免疫亲和柱只能针对某种或某类结构的毒素，而不适用于多种真菌毒素的分离富集。QuEChERS有操作简单、快速和经济的优势，但对于基质中含有较多淀粉、蛋白和脂肪的样品的净化效果不是非常理想。液液萃取是利用化合物在两种互不相溶(或微溶)的溶剂中溶解度或的不同，使化合物从一种溶剂转到另一种溶剂。例如申请人检索到的一篇公开的中国发明专利申请就采用了液液萃取，申请号为201410005346.0，名称为“一种同时检测多种真菌毒素的方法”，公 开了利用高效液相色谱-串联三重四级杆法达到同时检测33种真菌毒素的方法。该专利先用水萃取，再用相同体积的酸性乙腈萃取，以无水氯化钠和硫酸镁进行盐析，取上层的乙腈层。由于伏马毒素B1、B2等毒素在水和乙腈中的溶解度都比较大，仅收集乙腈层会造成这些毒素的大量损失。研究表明，提取大多数真菌毒素时，采用体积比为80～90％的乙腈和20～10％的水，提取效率均达到较高水平，1：1的乙腈水对大多数真菌毒素并不适合。因而，采用该液液提取方法，没有进行净化，直接进样，样品基质效应明显，容易造成回收率低，出现假阴性的结果。

[0004] 由此可见，目前真菌毒素的提取方法虽然较多,存在提取方法通用性不强，样品的基质效应影响较大，结果回收率较低，存在假阴性问题，采用了纳米材料作吸附剂的MSPD技术有助于显著改善样品的萃取效率，非常适合固体小麦粉中真菌毒素的快检和确证工作。

发明内容

[0005] 本发明的目的是针对现有真菌毒素提取技术存在的缺陷，提出一种以氧化石墨烯和弗罗里硅土作为基质固相分散剂，快速准确检测小麦粉中真菌毒素的方法。

[0006] 本发明通过以下技术方案解决技术问题：一种氧化石墨烯混合材料的基质固相分散剂，由氧化石墨烯和弗罗里硅土组成，所述弗罗里硅土的质量为氧化石墨烯的8-40倍。

[0007] 氧化石墨烯混合材料的基质固相分散剂的应用，包括以下步骤：

[0008] 步骤一、制备样品，将氧化石墨烯混合材料的基质固相分散剂和小麦粉按比例用漩涡混匀器混合3-5min，其中小麦粉的质量为氧化石墨烯的2-10倍；混合物转移于研钵中，研磨5-10min；

[0009] 步骤二、小麦粉样品的提取净化，混合物用甲醇溶液淋洗样品，再用含1％-3％浓盐酸的甲醇溶液洗脱目标分析物，收集洗脱液,30℃ -50℃下氮气吹近干，加入乙腈，过滤后待测；

[0010] 步骤三、以高效液相色谱-串联三重四级杆法的正离子模式测定小麦粉样品中的18种真菌毒素。

[0011] 18种真菌毒素分别为青霉酸、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、杂色曲霉毒素、伏马毒素B1、伏马毒素B2、二乙酰镳草镰刀菌烯醇、桔青霉毒素、赭曲霉毒素、烟曲霉素、玉米赤霉烯酮、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇和展青霉毒素。

[0012] 色谱条件：色谱柱：美国Thermo公司Hypersil ODS C18柱(150mm×2.1mm，3.5μm)；柱温25℃；进样量1μL；流速0.3mL/min；流动相：采用梯度洗脱程序：A：10mmol/L醋酸铵+0.1％甲酸水溶液，B甲醇作流动相进行梯度洗脱：0-3min，90％B；3-6min，
60-55％B；6-12min，55-5％B；12-14min，5％B；14-15min，90％B。

[0013] 质谱条件：离子源：电喷雾离子源；电离方式：ESI+；检测方式：多反应监测(MRM)；毛细管电压:3.5kV；雾化气压力：40psi；干燥气流速：10L/min；干燥气温度：350℃。MRM参数见表1。

[0014] 表1 18种真菌毒素的串联质谱检测参数

[0015]

[0016]

[0017] 步骤四绘制标准曲线,计算样品中各种真菌毒素的含量。将不含上述18种真菌毒素的空白小麦粉样品按上述步骤一、二和三，在0.5～50ng/mL范围内配制18种真菌毒素的系列浓度标准工作液，绘制标准曲线。采用外标法计算各组分的含量。

[0018]

[0019] 式中：Xi—样品中各真菌毒素的含量，单位μg/kg；

[0020] Ci—从标准工作曲线上得到被测组分溶液浓度，单位纳克每毫升ng/mL；

[0021] V—样品定容体积，单位毫升mL；

[0022] m—样品的质量，单位克g。

[0023] 本发明采用以HPLC-MS/MS法的正离子模式MRM的检测方式测定小麦粉样品中的18种真菌毒素，同现有的技术相比，本发明的优势主要有以下2点：

[0024] 1、引入氧化石墨烯材料和弗罗里硅土用作基质固相分散(d-SPE)的分散剂(吸附剂)。氧化石墨烯是一种新型的纳米材料，具有石墨的层状结构，但作为极性物质，它具有较高的比表面积和吸附容量，表面丰富的-OH和-COOH等极性基团，比C18、石墨化碳黑更易吸附极性物质-真菌毒素。与单/多壁碳纳米管等材料相比，在吸附后能够采用相对简单淋洗液将真菌毒素洗脱下来。优异的吸附和洗脱能力,避免了现有液液萃取技术中真菌毒素大量损失的问题。加入弗罗里硅土使氧化石墨烯的分散更为均匀，减少氧化石墨烯的团聚,节省氧化石墨烯的用量，在保证萃取和净化效果的基础 上，节约成本。同时，采用2种极性有所差异的分散剂有利于不同极性分子的分离，保证了极性不同的多种真菌毒素的高回收率。

[0025] 2、本发明采用HPLC-MS/MS的正离子模式替代了现有技术中用正/负离子两种模式进行采集的赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇、展青霉毒素等7种物质。避免了正负离子同时切换，使不具有正负离子切换的仪器也可以实现18种真菌毒素的同步检测，增强了仪器的通用性，并且灵敏度和检出限能满足各项标准的要求。

具体实施方式

[0026] 实施例一

[0027] 准确称取0.5g小麦粉、0.1g氧化石墨烯粉末(购自中国科学院成都有机化学有限公司的TNGO)和2g弗罗里硅土(购自上海博势生物科技有限公司，用前先于650℃的高温加热3h以活化处理)于150mL三角瓶中。混合物用漩涡混匀器混合3-5min，使之充分混合。转移于研钵中，研磨5min，充分进行提取。

[0028] 在5ml玻璃注射器的底层放置一块筛板，将混合物转移到注射器中，在上方再放置一筛板，压实。

[0029] 先用5ml的甲醇溶液淋洗(控制流速约为1ml/min)，弃去淋洗液，再用5ml的酸性甲醇(含2％浓盐酸)溶液洗脱目标分析物，收集洗脱液于旋转蒸发瓶中。

[0030] 40℃下氮气吹至近干。

[0031] 加入200μL乙腈，涡旋30s，过0.22μm四氟乙烯(PTFE)滤膜，待测。

[0032] 液相色谱串联质谱仪为LC-MS/MS，Agilent,American。

[0033] 色谱条件：色谱柱：美国Thermo公司Hypersil ODS C18柱(150mm×2.1mm，3.5μm)；柱温25℃；进样量1μL；流速0.3mL/min；流动相：采用梯度洗脱程序：A：10mmol/L醋酸铵+0.1％甲酸水溶液，B：甲醇作流动相进行梯度洗脱：0-3min，90％B；3-6min，
60-55％B；6-12min，55-5％B；12-14min，5％B；14-15min，90％B。

[0034] 质谱条件：离子源：电喷雾离子源；电离方式：ESI+；检测方式：多反应监测(MRM)；毛细管电压:3.5kV；雾化气压力：40psi；干燥气流速：10L/min；干燥气温度：350℃。

[0035] 绘制标准曲线,计算样品中各种真菌毒素的含量。将不含上述18种真菌毒素的小麦粉样品按上述步骤一、二和三处理，用该空白样品基质溶液在0.5～50ng/mL范围内配制18种真菌毒素的系列浓度标准工作液，绘制标准曲线。采用外标法计算各组分的含量。

[0036]

[0037] 式中：Xi—样品中各真菌毒素的含量，单位μg/kg；

[0038] Ci—从标准工作曲线上得到被测组分溶液浓度，单位纳克每毫升ng/mL；

[0039] V—样品定容体积，单位毫升mL；

[0040] m—样品的质量，单位克g。

[0041] 对建立的方法进行方法学验证，包括以下几部分内容：

[0042] 1、标准曲线、线性范围和检出限。以甲醇为溶剂，以不含18种真菌毒素的小麦粉作为基质，配制质量浓度为0.5、5、10、20、50ng/mL的混合标准系列工作液，按照上述方法进行测定。以各组分的峰面积(y)为纵坐标，质量浓度(x)为横坐标，绘制标准曲线。结果表明，青霉酸、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒 素G2、杂色曲霉毒素、伏马毒素B1、二乙酰镳草镰刀菌烯醇、桔青霉毒素和烟曲霉素线性范围为0.5～50ng/mL，检出限为0.5ng/mL；玉米赤霉烯酮、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素和展青霉毒素线性范围为5～50ng/mL，检出限为5ng/mL。

[0043] 2、检出限：取不含18种真菌毒素的小麦粉作为基质，加入接近方法检出限的18种真菌毒素的标准样品，重复测定6次，以信噪比为3时对应质量浓度作为18种真菌毒素的方法检出限，见表2。

[0044] 3、回收率：取不含18种真菌毒素的小麦粉作为基质，分别加入高、中、低三个浓度水平的混合标准品，平行测定3份，基质加标的平均回收率范围见表2。

[0045] 4、精密度：取不含18种真菌毒素的小麦粉作为基质，加入18种霉菌毒素的混标，按上述方法重复实验3次。相对标准偏差RSD(n＝6)在0.9％～4.5％。

[0046] 表2 各化合物的线性范围、线性方程、相关系数、添加回收率及检出限[0047]

[0048]

[0049] 5、与现有技术的比较

[0050] 表3

[0051]真菌毒素 本发明 现有技术
电离方式 ESI+ ESI+/ESI-
线性范围/(ng/mL) 0.5～50/5～500 0.5～800
回收率/％ 78.65～103.40 67.7～118.8
检出限/(ng/mL) 0.5～5 0.1～10/0.2～15
相对标准偏差RSD/％ 0.9～4.5 0.8～19.5

[0052] 由此可见，采用氧化石墨烯和弗罗里硅土作为基质分散固相萃取的分散剂的回收率比已有的专利的回收率和精密度均有显著提高。检出限二者相差不大。在电离方式上，本专利采用了正离子模式，使不具备正负离子同时切换的质谱仪也可以用于检测，增加了方法的通用性。

[0053] 6、实际样品中各真菌毒素的检出情况。采用建立的真菌毒素测定方法，对20种市售品牌小麦粉进行分析。结果如表4所示。

[0054] 表4 20种市售品牌小麦粉中18种真菌毒素的检出情况

[0055]