尿素酶抑制剂制剂

摘要

提供了液体尿素酶抑制剂制剂，其包括尿素酶抑制剂和选自二烷基砜、聚亚甲基环状砜及它们的混合物的主要溶剂。还描述了使用所述液体尿素酶抑制剂制剂来抑制含有尿素的肥料或废料的尿素酶水解的方法。

权利要求

1.用于含有尿素化合物的尿基肥料和废料的液体尿素酶抑制剂制剂，其包括：(a)尿素酶抑制剂，其选自结构I代表的N-取代的硫代磷酰三胺和N-取代的磷酰三胺及它们的混合物，其中X＝O或S，R＝未取代和取代的C3-C6烷基、未取代和取代的C5-C8环烷基、苯基及具有硝基、氨基、烷基或卤化物取代基的取代的苯基；以及Y＝H、NO2、卤化物、NH2或C1-C8烷基，其中所述尿素酶抑制剂不是具有以下结构的化合物：(b)主要溶剂，其选自根据结构II的二烷基砜、根据结构III的聚亚甲基环状砜及它们的混合物；

其中R2＝C1-C6烷基

3

R＝C1-C6烷基

其中n＝3-6

其中，所述尿素酶抑制剂可溶于所述主要溶剂；和

(c)缓冲剂和稳定剂，其选自根据结构IV的羟乙胺和羟丙胺，其中所述胺是伯胺、仲胺或叔胺，并且羟乙基或羟丙基基团的数量是1、2或3，其中

R4和R5独立地为H、C1-C6烷基或

R7＝H或CH3。

2.根据权利要求1所述的液体尿素酶抑制剂制剂，其还包括：(d)具有湿润剂性能的非离子表面活性剂，其选自脂肪醇烷氧基化合物、烷基酚烷氧基化合物及它们的混合物。

3.根据权利要求1所述的液体尿素酶抑制剂制剂，其中，按重量计，所述尿素酶抑制剂的量为总制剂的0.5-51％的范围内。

4.根据权利要求1所述的液体尿素酶抑制剂制剂，其中，按重量计，主要溶剂的量为总制剂的10-80％的范围内。

5.根据权利要求1所述的液体尿素酶抑制剂制剂，其中，按重量计，缓冲剂和稳定剂的量在总制剂的1-50％的范围内。

6.根据权利要求2所述的液体尿素酶抑制剂制剂，其中，按重量计，所述非离子表面活性剂的量在总制剂的0.1-2.0％的范围内。

7.根据权利要求1所述的液体尿素酶抑制剂制剂，其中所述主要溶剂为四亚甲基砜。

8.根据权利要求1所述的液体尿素酶抑制剂制剂，其中所述缓冲剂和稳定剂选自三乙醇胺、单乙醇胺及它们的混合物。

9.根据权利要求1所述的液体尿素酶抑制剂制剂，其中，所述尿素酶抑制剂选自N-丁基磷酰三胺、2-硝基苯基磷酰三胺、N-环己基磷酰三胺(CHPT)及它们的混合物。

10.用于抑制含有尿素的肥料或废料的尿素酶水解的方法，所述方法包括将液体尿素酶抑制剂制剂施加至含有尿素的肥料或废料的步骤，所述液体尿素酶抑制剂制剂包括：(a)尿素酶抑制剂，其选自结构I代表的N-取代的硫代磷酰三胺和N-取代的磷酰三胺及它们的混合物，其中X＝O或S，R＝未取代和取代的C3-C6烷基、未取代和取代的C5-C8环烷基、苯基及具有硝基、氨基、烷基或卤化物取代基的取代的苯基；以及Y＝H、NO2、卤化物、NH2或C1-C8烷基，其中所述尿素酶抑制剂不是具有以下结构的化合物：(b)主要溶剂，其选自根据结构II的二烷基砜、根据结构III的聚亚甲基环状砜及它们的混合物；

其中R2＝C1-C6烷基

R3＝C1-C6烷基

其中n＝3-6

其中，所述尿素酶抑制剂可溶于所述主要溶剂；和

(c)缓冲剂和稳定剂，其选自根据结构IV的羟乙胺和羟丙胺，其中所述胺是伯胺、仲胺或叔胺，并且羟乙基或羟丙基基团的数量是1、2或3，其中

R4和R5独立地为H、C1-C6烷基或

R7＝H或CH3。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述液体尿素酶抑制剂制剂进一步包括：(d)具有湿润剂性能的非离子表面活性剂，其选自脂肪醇烷氧基化合物、烷基酚烷氧基化合物及它们的混合物。

12.根据权利要求10所述的方法，其中，按重量计，用于所述液体尿素酶抑制剂制剂的所述尿素酶抑制剂的量为总制剂的0.5至51％的范围内。

13.根据权利要求10所述的方法，其中，按重量计，用于所述液体尿素酶抑制剂制剂的主要溶剂的量为总制剂的10至80％的范围内。

14.根据权利要求10所述的方法，其中，按重量计，用于所述液体尿素酶抑制剂制剂的缓冲剂和稳定剂的量在总制剂的1至50％的范围内。

15.根据权利要求11所述的方法，其中，按重量计，用于所述液体尿素酶抑制剂制剂的所述非离子表面活性剂的量在总制剂的0.1至2.0％的范围内。

16.根据权利要求10所述的方法，其中用于所述液体尿素酶抑制剂制剂的所述主要溶剂为四亚甲基砜。

17.根据权利要求10所述的方法，其中用于所述液体尿素酶抑制剂制剂的所述缓冲剂和稳定剂选自三乙醇胺、单乙醇胺及它们的混合物。

18.根据权利要求10所述的方法，其中，用于所述液体尿素酶抑制剂制剂的所述尿素酶抑制剂选自N-丁基磷酰三胺、2-硝基苯基磷酰三胺、N-环己基磷酰三胺(CHPT)及它们的混合物。

19.根据权利要求10所述的方法，其中所述含有尿素的肥料是尿素颗粒，并且所述施加液体尿素酶抑制剂制剂的步骤包括将所述制剂喷涂至所述尿素颗粒的表面，或使所述尿素颗粒与所述制剂熔化以形成固体混合物。

20.根据权利要求19所述的方法，其中对湿润土壤中尿素的尿素酶水解的抑制持续至少14天。

21.权利要求1-9中任一项所述的液体尿素酶抑制剂制剂在抑制湿润土壤中尿素的尿素酶水解中的用途。

说明书

尿素酶抑制剂制剂

发明领域

[0001] 本发明涉及包含尿素酶抑制剂的制剂。特别是，本发明涉及包含尿素酶抑制剂的制剂，其用于含有尿素化合物的尿基肥料和废料从而抑制尿素酶活性对这种肥料和废料的影响。

[0002] 发明背景

[0003] 在本说明书中引用或讨论了知识的文件、法案或条款的地方，该引用或讨论并不承认知识的文件、法案或条款或其结合在优先权日期是公开可用、公众已知、部分公知常识；或者已知与试图解决本说明书所关心的任何问题有关。

[0004] 氮是重要的植物养分。尿素(CO(NH2)2)代表了用于世界范围内农作物的总氮肥的40％以上。然而，尿素在土壤中容易被酶中的“尿素酶”组降解，其催化尿素和水反应以生成气态氨和铵离子(称为“尿素水解(urea hydrolysis)”)。由于该酶促水解，氨容易从处理的土壤中挥发；导致了高达60％的施加的尿素的损失。

[0005] 为了延缓该水解，“尿素酶抑制剂”已用于尿基肥料，以试图降低尿素水解速率以及随后氨的损失。这种尿素酶抑制剂的实例包括N-烷基硫代磷酰三胺(N-alkyl thiophosphoric triamides)，如N-正丁基硫代磷酰三胺(N-(n-butyl)thiophosphoric triamide,NBPT)。然而，NBPT是蜡状、粘稠、热敏性及水敏性的材料，因此在储存和配料期间需要特定的制剂来将分解降至最低。这种制剂的实例包括：

[0006] ·N-烷基硫代磷酰三胺溶于溶剂混合物的浓溶液，该溶剂混合物为二醇类(如丙二醇)和液体酰胺类(如N-甲基吡咯烷酮)(参见例如WO97/22568号国际专利申请)；

[0007] ·混合物，其包括硫代磷酰三胺和具有高于100℃沸点的含有氨基的化合物(参见例如WO2009/079994号国际专利申请)；和

[0008] ·液体组合物，其包含磷或硫代磷酰三胺衍生物以及一种或多种羟基酸、杂环醇类的酯类、碳酸的环状酯类和二羧酸的酯类(参见例如WO2010/072184号国际专利申请)。

[0009] 现存的目前用于农业的尿素酶抑制剂制剂(如叫做AgrotainＴＭ的商品(在一些国家中注册的Phosphate Resource Partners Limited Partnership的商标))在使用中有很多缺点，包括：

[0010] ·处理的尿素的有限的储存稳定性；

[0011] ·关于制剂中所用溶剂的健康和安全顾虑；和

[0012] ·制剂中所用溶剂一旦进入水生和陆地环境，关于其产生的影响的生态毒理顾虑。

[0013] 因此，需要一种改进的克服至少一种这些缺点的尿素酶抑制剂制剂。

[0014] 发明概述

[0015] 已发现活性成分的新溶剂结合物和/或混合物克服至少一种上述缺点。新的制剂通过延缓土壤中的尿素水解及减少氨向大气中的释放来持续提高尿基肥料的效率。

[0016] 根据本发明的第一方面，提供了液体尿素酶抑制剂制剂，其包括：

[0017] (a)尿素酶抑制剂，其选自结构I代表的N-取代的硫代磷酰三胺和N-取代的磷酰三胺及它们的混合物，

[0018]

[0019] 其中X＝O或S，R1＝未取代和取代的C3-C6烷基、未取代和取代的C5-C8环烷基、苯基及具有硝基、氨基、烷基或卤化物取代基的取代的苯基；以及Y＝H、NO2、卤化物、NH2或C1-C8烷基；和

[0020] (b)主要溶剂，其选自根据结构II的二烷基砜、根据结构III的聚亚甲基环状砜及它们的混合物；

[0021]

[0022] 其中R2＝C1-C6烷基

[0023] R3＝C1-C6烷基

[0024]

[0025] 其中n＝3-6

[0026] 其中，所述尿素酶抑制剂可溶于所述主要溶剂。

[0027] 用于根据本发明的制剂的尿素酶抑制剂包括：

[0028] ·N-烷基-硫代磷酰三胺；

[0029] ·N-烷基-磷酰三胺；

[0030] ·N-环烷基-硫代磷酰三胺；

[0031] ·N-环烷基-磷酰三胺；

[0032] ·N-芳基-硫代磷酰三胺；或

[0033] ·N芳基-磷酰三胺，

[0034] 其中所述烷基、环烷基或芳基可以进一步由氯、硝基或氨基取代。常用的尿素酶抑制剂包括N-丁基磷酰三胺(NBPT)、N-环己基磷酰三胺(CHPT)和2-硝基苯基磷酰三胺(2-NPT)。本领域技术人员已知的是很多其他尿素酶抑制剂可以用于根据本发明的制剂中。两种或更多种尿素酶抑制剂的结合也可以用于根据本发明的制剂中。优选地，按重量计，在所述制剂中存在的尿素酶抑制剂的量在总制剂的0.5-51％的范围内，更优选为10-20％。

[0035] 所述主要溶剂，选自特定的砜，为尿素酶抑制剂提供了优异的稳定性和溶解性。它们也具有环境和职业的健康和安全优点。优选地，所述主要溶剂为四亚甲基砜，其在土壤中易于生物降解(半衰期为10天)并且不存在生态毒理危害(对于鱼类、藻类和无脊椎动物的LC50为大于1000mg/l)。四亚甲基砜具有高沸点(284℃)，不易燃并且不归类为危险物品或有害物质。

[0036] 根据本发明的制剂中的主要溶剂的使用具有现有技术中的溶剂体系无法实现的有益特性，包括：

[0037] ·即使在高温(高达40℃)条件下超过12个月，所述尿素酶抑制剂在浓溶液中稳定；

[0038] ·根据本发明的制剂可以直接施加至含有尿素化合物的液体肥料或液体废料中；

[0039] ·根据本发明的制剂可以直接喷洒在、及混合至含有尿素化合物的固体废料中；

[0040] ·根据本发明的制剂具有低粘度，因此促进了在尿素颗粒表面的快速和均匀扩散；

[0041] ·根据本发明的制剂可以施加至吸收该制剂的尿素颗粒表面，深度渗透至固体颗粒中(“浸渍”颗粒结构)；

[0042] ·涂覆有根据本发明制剂的尿素颗粒在储存、运输和处理期间仍然坚固，由此保留了它们的硬度和压碎强度；

[0043] ·涂覆有根据本发明制剂的尿素颗粒比用现有技术中制剂处理的尿素颗粒在土壤中水解更慢，由此实现了对于农作物和植物最有效吸收所期望的氨缓慢释放。更慢速率的尿素水解导致了接近于尿素颗粒的更低的pH，这产生了更高比例的稳定的铵/氨；以及[0044] ·涂覆有根据本发明制剂的尿素颗粒在高达40℃的炎热气候中储存超过3个月条件下保持稳定并保留它们的尿素酶抑制活性。

[0045] 根据本发明的制剂赋予了其他溶剂体系以前并未获得的优良性能以及意料不到的结果。

[0046] 优选地，按重量计，所述制剂中存在的主要溶剂的量在总制剂的10-80％的范围内，更优选为40-70％。

[0047] 在优选的实施方案中，所述液体尿素酶抑制剂制剂还包括：

[0048] (c)缓冲剂和稳定剂，选自由根据结构IV的羟乙胺和羟丙胺，其中所述胺可以是伯胺、仲胺或叔胺，并且羟乙基或羟丙基基团的数量可以是1、2或3，

[0049]

[0050] 其中

[0051] R4和R5独立地为H、C1-C6烷基或

[0052]

[0053] R7＝H或CH3。

[0054] 所述缓冲剂和稳定剂进一步改善根据本发明的制剂中的尿素酶抑制剂的储存稳定性。优选的缓冲剂和稳定剂为三乙醇胺、单乙醇胺及它们的混合物。优选地，按重量计，所述制剂中存在的缓冲剂和稳定剂的量在总制剂的1-50％的范围内，更优选为20-50％。

[0055] 在优选的实施方案中，所述液体尿素酶抑制剂制剂还包括：

[0056] (d)具有湿润剂性能的非离子表面活性剂，其选自脂肪醇烷氧基化合物、烷基酚烷氧基化合物及它们的混合物。

[0057] 所述非离子表面活性剂改善了根据本发明的制剂在尿素颗粒表面的湿润度和扩散效应。适合的非离子表面活性剂的实例为TerwetＴＭ品牌下提供的产品。优选地，按重量计，所述制剂中存在的非离子表面活性剂的量在总制剂的0.1-2.0％的范围内。

[0058] 根据本发明的制剂可以还包括附加组分，如酰胺类、酯类、杂环醇类和二醇类。实施例

[0059] 现将结合以下非限制性实施例来描述本发明的多种实施方案/方面。

[0060] 实施例1

[0061] 根据本发明制备制剂。

[0062]组分 量(克)
环丁砜(四亚甲基砜) 690
三乙醇胺 100
N-丁基硫代磷酰三胺 200
Terwet 245 (表面活性剂) 10
总质量 1000

[0063] 按示出的顺序混合组分并在50℃下搅拌30分钟。得到澄清的、没有不溶性固体的溶液。

[0064] 实施例2

[0065] 根据本发明制备制剂。

[0066]组分 量(克)
环丁砜 690
单乙醇胺 100
N-丁基硫代磷酰三胺 200
Terwet 245 10
总质量 1000

[0067] 根据实施例1描述的方法制备以上制剂。

[0068] 实施例3

[0069] 根据本发明制备制剂。

[0070]

[0071]

[0072] 根据实施例1描述的方法制备以上制剂。

[0073] 实施例4

[0074] 根据本发明制备制剂。

[0075]组分 量(克)
环丁砜 440
三乙醇胺 440
N-丁基硫代磷酰三胺 100
2-硝基苯基磷酰三胺 10
Terwet 245 10
总质量 1000

[0076] 根据实施例1描述的方法制备以上制剂。

[0077] 实施例5

[0078] 根据本发明制备制剂。

[0079]组分 量(克)
环丁砜 500
单乙醇胺 290
N-丁基硫代磷酰三胺 200
Terwet 245 10
总质量 1000

[0080] 根据实施例1描述的方法制备以上制剂。

[0081] 实施例6

[0082] 根据本发明制备制剂。

[0083]组分 量(克)
环丁砜 300
三乙醇胺 640
N-环己基磷酰三胺 50
Terwet245 10
总质量 1000

[0084] 根据实施例1描述的方法制备以上制剂。

[0085] 实施例7

[0086] 根据本发明制备制剂。

[0087]组分 量(克)
环丁砜 390
三乙醇胺 400
N-丁基硫代磷酰三胺 200
Terwet245 10
总质量 1000

[0088] 根据实施例1描述的方法制备以上制剂。

[0089] 实施例8

[0090]组分 量(克)
环丁砜 470
三乙醇胺 470
2-硝基苯基磷酰三胺 50
Terwet245 10
总质量 1000

[0091] 根据实施例1描述的方法制备以上制剂。

[0092] 实施例9

[0093] 该实施例研究由根据本发明的制剂处理的尿素颗粒产生的铵的量。

[0094] 方法

[0095] 通过在21℃下储存土壤-水悬浮物14天来进行孵育实验。每天，提取小等分(0.5ml)的上层水相并采用流动注射分析(FIA)来分析铵离子。土壤-水悬浮物由以下组成：

[0096]土壤样品,60％持水量 40克
水 200克
尿素 400mg
N-丁基硫代磷酰三胺 400μg
溶剂 1600μg

[0097] 该实验中所用的溶剂是以上实施例5和7所用的。

[0098] 试验溶液含有400μg NBPT/200ml水。结果示于表2。

[0099] 表2

[0100]试验溶液 NH4+(mg/1) ％抑制作用 尿素水解(mg)
对照(无抑制剂) 29.9 --- 256
AgrotainＴＭ 8.2 73 70
实施例7 8.4 72 72
实施例5 8.9 70 76

[0101] 没有尿素酶抑制剂的尿素的对照溶液，在14天的孵育后示出了29.9mg/l的NH4+。根据稀释因子(1:20)转换后，在200ml溶液中水解的尿素的量经计算为256mg。这表示添加至水相中的尿素损失了初始质量(400mg)的64％。

[0102] 相反，根据本发明的制剂仅形成了8.4和8.9mg/l的NH4+。这表示在14天的孵育后仅损失了72和76mg的尿素。使用等式中NH4+的浓度，％抑制作用经计算分别为72％和70％：

[0103]

[0104] 通过比较，作为商品化的尿素酶抑制剂广泛使用的标准产品“AgrotainＴＭ”在以上实验中产生了73％的抑制作用。

[0105] 这些结果表明根据本发明制备的制剂(实施例5和7)至少相当于根据现有技术制备的标准制剂AgrotainＴＭ。

[0106] 实施例10

[0107] 该实施例研究由根据本发明的制剂处理的尿素颗粒产生的铵的量。

[0108] 方法

[0109] 通过在21℃下储存土壤-水悬浮物17天来进行孵育实验。产生的铵按照实施例9测量。所得结果示于表3。孵育混合物包含：

[0110]土壤样品 40克
水 200克
尿素 400mg
溶剂 1600μg
尿素酶抑制剂 50-400μg

[0111] 该实验中所用的溶剂和尿素酶抑制剂是以上实施例5和8所用的。

[0112] 表3

[0113]

[0114] 以上结果显示实施例5看起来比标准产品AgrotainＴＭ表现地更有效(17天后，分别为84％和73％的抑制作用)。

[0115] 当与NBPT相比时，尿素酶抑制剂2-NPT(2-硝基苯基磷酰三胺)性能更优异。即使为50pg/200ml水时，(实施例8)活性2-NPT产生了72％的抑制作用，与400pg/200ml时的NBPT相似。这表明2-NPT的活性是NBPT约8倍。因此，按照目前的标准操作规程，在商品化制剂中，与
20％w/w的NBPT相比，2-NPT可以以2.5％w/w的浓度使用。

[0116] 实施例11

[0117] 该实施例研究根据本发明的制剂的储存稳定性。将尿素酶抑制剂的浓溶液在40℃下储存8周。每隔一定时间，提取样本并通过HPLC分析尿素酶抑制剂含量。测量为以％w/w表示的NBPT浓度的储存稳定性的结果示于表4。

[0118] 表4

[0119]溶液 0周 2周 6周 8周
AgrotainＴＭ 19.8 19.7 19.6 20.1
实施例1 19.9 19.6 19.3 19.8
实施例2 19.5 19.6 19.9 20.2

[0120] 这些结果示出在实验误差范围内，浓缩液在40℃下8周是稳定的，NBPT的浓度没有改变。这些储存条件相当于在环境温度下约12个月的储存。

[0121] 实施例12

[0122] 该实施例研究由根据本发明的制剂处理的尿素颗粒的稳定性。

[0123] 方法

[0124] 使涂覆的尿素样品在40℃下储存8周。以克/kg尿素显示NBPT浓度的结果示于表5。以5ml/kg尿素的比例将浓缩的抑制剂溶液(AgrotainＴＭ，实施例1和实施例2)施加至尿素颗粒。尿素颗粒中存在的剩余抑制剂以克NBPT/kg尿素示于表5。

[0125] 表5

[0126]溶液 0周 2周 6周 8周
AgrotainＴＭ 0.93 0.70 0.55 0.54
实施例1 0.89 0.72 0.57 0.50
实施例2 0.94 0.77 0.69 0.65

[0127] 基于以上结果，涂覆至尿素颗粒上的最稳定的制剂为实施例2。在40℃下储存8周后，仅约35％的尿素酶抑制剂自实施例2中损失，而其他两种制剂损失的尿素酶抑制剂在46-50％之间。

[0128] 对在20℃下储存8周的尿素样品进行进一步的实验。该实验中，尿素颗粒损失的尿素酶抑制剂仅在4-10％之间。最佳结果由实施例2获得，其显示出在20℃下储存8周后仅有4％的损失。

[0129] 这些结果证明了实施例2的尿素颗粒涂覆表面优异的稳定性。基于在40℃下储存8周后仅损失35％的NBPT，在正常工业储存条件下，处理的尿素的保存期限将会持续至少12个月。根据现有技术(AgrotainＴＭ)的常规处理，具有3个月的半衰期。

[0130] 实施例13

[0131] 该实施例研究用根据本发明的制剂处理的尿素颗粒的压碎强度。

[0132] 识别具有均匀尺寸的基本为球形的尿素颗粒。将个体尿素颗粒置于两个板之间并使其经受试验板上的增加的压力直至颗粒破裂。用测力计(如Digital Force Gauge DFE-050,Chatillon,Ametek)记录需要引起碎裂所需的力。每批尿素记录十次试验的平均值。

[0133] 平均硬度(表示为kg/颗粒)的结果示于表6。

[0134] 表6

[0135]样品 新鲜的样品 在20℃下8周后 在40℃下8周后
AgrotainＴＭ 3.01 2.01 2.95
实施例1 3.26 1.99 2.98
实施例2 3.19 2.16 2.78
尿素(未处理的) 3.21 2.28 3.02

[0136] 这些结果示出尿素颗粒在20℃下储存8周后变得较软，平均压碎强度从约3.2降低至2.14kg/克。然而，在40℃下储存8周后压碎强度变化不大，平均值降低至3.0kg/克。

[0137] 这些结果表明与未处理的对照相比，涂覆有实施例1和2的尿素颗粒机械强度损失不明显。该特性对在储料仓或储料斗中大规模储存处理的尿素是重要的，因为这些地方尿素灰尘的形成对人类健康有害。

[0138] 实施例14

[0139] 该实施例研究用根据本法的制剂处理的尿素颗粒的吸水性。在70％或75％湿度、30℃下进行储存实验。

[0140] 以临界相对湿度(CRH)来测量吸水性，其为在相对湿度70％和75％下各储存3小时后的重量增加％。以5ml/kg尿素的比例用抑制剂溶液处理尿素颗粒。

[0141] 表7

[0142]

[0143] 这些结果显示所有处理的尿素颗粒(AgrotainＴＭ,实施例1和2)就在70％和75％湿度下从空气吸收水分而言表现相似。尽管这些结果高于未处理的尿素对照，但它们在正常的工业储存条件下仍是可接受的。过量的水分吸收会引起尿素颗粒变得软和粘滞，并因此难以大规模的输送和处理。

[0144] 实施例15

[0145] 该实施例研究储存在40℃下的用根据本发明的制剂处理的尿素颗粒的尿素酶抑制性能。

[0146] 方法

[0147] 采用基于土壤溶液中由实施例9描述的尿素水解形成的铵离子(NH4+)的方法来进行尿素酶抑制试验。测试以下样品：

[0148] ·涂覆有AgrotainＴＭ的尿素(1.0克NBPT活性/kg尿素)；

[0149] ·涂覆有实施例1的尿素(1.0克NBPT活性/kg尿素)；和

[0150] ·涂覆有实施例2的尿素(1.0克NBPT活性/kg尿素)。

[0151] 采用新制备的样品以及在20℃和40℃下储存的样品来进行以上样品试验。使用与实施例9相同的实验条件。表8给出了土壤溶液中的铵浓度和20天孵育后的％抑制作用的结果。

[0152] 表8

[0153]

[0154] 这些结果显示出新制备的实施例1的样品在21℃下孵育20天期间对尿素水解产生了82％的抑制作用。相比较，在20℃和40℃下储存的样品分别产生了81％和78％的抑制作用。这表明抑制剂NBPT在该储存期后仍稳定并有活性。

[0155] 相似地，实施例2对新鲜样品以及在20℃和40℃下储存的样品分别产生了82、82和81％的抑制作用。这些稳定性试验优于由AgrotainＴＭ(其分别产生了77、72和78％的抑制作用)获得的结果(表8)。

[0156] 实施例16

[0157] 该实施例研究用根据本发明的制剂处理的尿素颗粒的效率。

[0158] 方法

[0159] 随机分组设计，按序进行重复现场实验，以测量使用对照尿素和使用根据本发明的制剂处理的尿素施肥的冬黑麦草的干物质生产、N-吸收和N-吸收效率的改善。

[0160] 尿素施肥量为100kg/Ha，相当于46kg氮/Ha。使尿素颗粒每kg尿素涂覆2、3或5ml的ＴＭ实施例1。以5ml/kg尿素的比例使用Agrotain 。

[0161] 一组试验的结果示于表9。

[0162] 表9

[0163]

[0164] 基于以上结果，以2或5ml施加的实施例1处理明显比尿素对照更有效地生产黑麦草干物质。相比于AgrotainＴＭ处理的尿素，实施例1的处理在干物质产量和N-吸收方面没有表现出统计学上明显的改善。然而有偏向实施例1的处理的趋势(即使添加至尿素的比例更低)。实施例1的处理实现了大约80-90％的N-吸收％效率，优于未处理尿素的约50％的效率。使用AgrotainＴＭ的常规处理具有约60％的效率。

[0165] N-吸收效率＝(样品吸收–空白吸收)×100/46

[0166] 这些结果显示出与用AgrotainＴＭ的常规处理相比，用根据本发明的制剂处理的尿素具有优异的N-吸收％效率。

[0167] 实施例17

[0168] 该实施例研究根据本发明的尿素酶抑制剂制剂涂覆至尿素颗粒时的稳定性。

[0169] 进行15吨尿素的工业规模生产，该尿素用标准抑制剂制剂AgrotainＴＭ或用如实施例3描述的根据本发明的尿素酶抑制剂制剂处理。

[0170] 以3升/吨尿素的比例施加液体产品AgrotainＴＭ；而以2升/吨的较低比例施加实施例3的液体抑制剂。

[0171] 将这两批处理的尿素在澳大利亚的Wagga Wagga，NSW，Charles Sturt大学于环境温度和湿度下从2011年3月17日起储存8周的时间。

[0172] 对在以下条件储存的样品进行稳定性试验：

[0173] >散装尿素-十四(14)吨置于制造厂的干燥区域，大量堆积在混凝土地板上。

[0174] >一吨袋-处理的尿素也储存于通常用于储存和运输散装尿素的一吨“散装袋”中。

[0175] >25Kg袋-处理的尿素也储存于通常用于储存干肥的25Kg编制塑料袋中。

[0176] 每隔一定时间通过HPLC分析各样品的剩余活性组分NBPT，如表示10所示。

[0177] 表10：处理的尿素在储存后的剩余NBPT(％w/w)