微藻的提取

摘要

本发明提供一种从微藻生物质提取含脂质产物的方法，所述方法包括：(i)用微波辐射处理包含微藻生物质的含水混合物，及(ii)从经过处理的微藻生物质回收含脂质产物。

权利要求

1.一种用于从微藻生物质提取含脂质产物的方法，所述方法包括：(i)用微波辐射处理由微藻生物质、水以及任选地提取缓冲液组成的含水混合物，及(ii)从所述经过处理的微藻生物质回收含脂质产物，和如果所述方法包括用溶剂提取的步骤，在用微波辐射处理之后进行溶剂提取。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述微藻生物质是包含高达90％的水的湿生物质。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述微藻生物质包含以重量计10％到90％的水。

4.一种用于从微藻生物质提取含脂质产物和含碳水化合物产物的方法，所述方法包括：(i)提供含有所述微藻生物质的含水混合物；(ii)将所述含水混合物的pH值调到pH<7；

(iii)加热含有所述微藻生物质的所述含水混合物；及(iv)从所述生物质中分离出所述含脂质产物和所述含碳水化合物产物。

5.根据权利要求4所述的方法，其中在步骤(ii)中形成的含水混合物的pH值在0.5到2的范围内。

6.一种用于从微藻生物质提取含脂质产物和含蛋白质产物的方法，所述方法包括：(i)提供含有所述微藻生物质的含水混合物；(ii)将所述含水混合物的pH值调到pH>7；(iii)用微波辐射加热含有所述微藻生物质的所述含水混合物；及(iv)从所述生物质中分离出所述含脂质产物和所述含蛋白质产物，和如果所述方法包括用溶剂提取的步骤，在用微波辐射处理之后进行溶剂提取。

7.一种用于从微藻生物质提取含脂质产物、含碳水化合物产物及含蛋白质产物的方法，所述方法包括：(i)提供含有所述微藻生物质的初始含水混合物；

(ii)将所述初始含水混合物的pH值调到pH<7；

(iii)加热含有所述微藻生物质的所述酸性初始含水混合物以提供第一经过处理的混合物；

(iv)从所述第一经过处理的混合物分离固体和液体，以提供第一固体和含碳水化合物的液体；

(v)将所述第一固体与含水混合物组合以形成第二含有微藻生物质的含水混合物；

(vi)将所述第二含水混合物的pH值调到pH>7；

(vii)加热含有所述微藻生物质的所述碱性第二含水混合物以提供第二经过处理的混合物；

(viii)从所述第二经过处理的混合物分离固体和液体，以提供第二固体和含蛋白质的液体；

(ix)任选地，使用所述第二固体重复步骤(v)到(viii)，以提供第三固体和另外的含蛋白质的液体；

(x)将所述第二固体或所述第三固体与含水混合物组合，以形成最终的含水混合物；

(xi)用溶剂处理所述最终的含水混合物；

(xii)从所述最终含水混合物中分离所述溶剂，以提供含有脂质产物的溶剂。

8.根据权利要求7所述的方法，其中在步骤(ii)中形成的所述混合物的pH值在0.5到2的范围内。

9.根据权利要求8所述的方法，其中在步骤(ii)中形成的所述混合物的pH值为1。

10.根据权利要求7所述的方法，其中在步骤(vi)中形成的所述混合物的pH值在11到14的范围内。

11.根据权利要求10所述的方法，其中在步骤(vi)中形成的所述混合物的pH值为13。

12.根据权利要求8到11中任一权利要求所述的方法，其中加热含有所述微藻生物质的酸性或碱性含水混合物的步骤是通过用微波辐射处理所述混合物来进行。

13.根据权利要求8到11中任一权利要求所述的方法，其中所述加热步骤中的任一个或多个是在大气压下进行的。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述加热步骤中的任一个或多个是在大气压下进行的。

15.根据权利要求8到11中任一权利要求所述的方法，其中所述加热步骤中的任一个或多个是在高于大气压的压力下进行的。

16.根据权利要求12所述的方法，其中所述加热步骤中的任一个或多个是在高于大气压的压力下进行的。

说明书

微藻的提取

[0001] 优先权文件

[0002] 本申请要求2011年10月20日提交的题为“微藻的提取(MICROALGAL EXTRACTION)”的澳大利亚临时专利申请第2011904343号的优先权，该案内容以全文引用的方式并入本文中。

技术领域

[0003] 本发明涉及用于从微藻生物质提取材料的方法。

背景技术

[0004] 从长远来看，化石燃料不能作为一种运输用燃料。这一点结合化石燃料燃烧的负面环境影响引起了对于可以提供不可再生化石燃料的替代选择的可再生能源的研究。生物燃料是一种此类可再生能源。生物燃料是由可再生有机来源或原料制造的燃料。此术语一般是指运输用燃料并且包括乙醇和生物柴油。截至目前，用于制造生物柴油的油的主要来源是粮食作物。然而，使用粮食作物也会存在负面环境影响，并且其未必能够供应足够的运输用燃料。生物质，例如草、来自谷类作物、林业产品或荒地的残留物等，可用于制造生物燃料，但其一般被用于制造生物乙醇。然而，生物乙醇并非燃料来源的最佳选择。

[0005] 使用藻类作为再生有机原料当与使用其它可再生有机来源相比较时具有若干益处，所述有机原料可用于制造适于生物柴油制造的油。一些藻类产生相当大量的油或脂质。举例来说，一些藻类含有以重量计高达80％的油，并且因此，这些藻类可以提供丰富的油来源用于制造生物柴油。此外，藻类生长迅速，并且在一年内产生的质量可为陆生植物的10到
100倍，并且其将在许多环境条件中生长。

[0006] 从藻类提取的油是三酸甘油酯与各种亲脂性颜料的混合物。油可以直接地或经由转酯作用转化成生物柴油而间接地用作燃料。

[0007] 不幸的是，已经证实，在工业规模上，由藻类制造油是一个困难和/或昂贵的工艺。通常，将微藻生物质从生长池、槽或容器中抽吸到离心机或倾析器中，在其中，将浆料的体积降低到初始体积的约80％。接着，通常进行进一步干燥的步骤，随后是油提取步骤。干燥步骤需要时间和大量的能量输入，并因此增加了所述工艺的总体成本。

[0008] 由藻类制造油需要从生物质中提取油，并且优选地，从其它有机污染物中纯化出脂质部分。在一些工艺中，使用有机溶剂，通过溶剂提取来提取油。举例来说，美国专利第6,166,231号描述了一种从生物质提取油的两阶段溶剂提取。美国专利第5,458,897号公开了用于从植物材料、动物及土壤提取挥发性油的方法，所述方法是通过将植物材料、动物及土壤与非水性溶剂混合并将混合物曝露于微波辐射来实现。

[0009] 干燥和/或溶剂提取步骤需要时间并增加了提取工艺的成本。

[0010] 需要用于从藻类提取油和其它产品并且克服了与现有技术工艺相关的一个或多个问题的方法。

[0011] 本说明书中提到的所有出版物都以引用的方式并入本文中。有关本说明书中所包括的文献、操作、材料、装置、物品等的任何论述仅仅出于提供本发明的上下文的目的。而不能视为承认这些内容中的任一项或全部形成了现有技术基础的一部分或是与本发明相关的领域中的一般常识，因为其在所述申请的每一权利要求项的优先权日期之前存在于澳大利亚或者别处中。

发明内容

[0012] 本发明提供了一种经济上可行的由微藻制造油的新方法。具体地说，本发明源自于有关从微藻生物质提取并分级分离商业产品的方法的研究，并且特别是发现使湿微藻生物质曝露于微波辐射引起油产物的释放，所述油产物可以得到回收，无需中间干燥步骤。

[0013] 在一个方面，本发明提供一种从微藻生物质提取含脂质产物的方法，所述方法包括：(i)用微波辐射处理包含微藻生物质的含水混合物，及(ii)从经过处理的微藻生物质回收含脂质产物。

[0014] 有利的是，所述微藻生物质可以是“湿”生物质。所述微藻生物质可以包含高达90％的水。从“湿”生物质提取含脂质产物意味着无需从微藻生物质去除任何水，并且此举使得提取工艺相当高效，因为通常需要的单独干燥步骤是耗时并且耗能的。

[0015] 在一些实施例中，微藻生物质包含以重量计约10％到约90％的水。

[0016] 也已经发现，通过降低包含微藻生物质的含水混合物的pH值，可以从所述生物质中选择性提取碳水化合物材料。因此，本发明还提供一种从微藻生物质提取含脂质产物和含碳水化合物产物的方法，所述方法包括：(i)提供含有所述微藻生物质的含水混合物；(ii)将所述含水混合物的pH值调到pH<7；(iii)加热含有所述微藻生物质的含水混合物；及(iv)从所述生物质中分离出含脂质产物和含碳水化合物产物。

[0017] 此外，已经发现，通过增加包含微藻生物质的含水混合物的pH值，可以从所述生物质中选择性提取蛋白质材料。因此，本发明还提供一种从微藻生物质提取含脂质产物和含蛋白质产物的方法，所述方法包括：(i)提供含有所述微藻生物质的含水混合物；(ii)将所述含水混合物的pH值调到pH>7；(iii)加热含有所述微藻生物质的含水混合物；及(iv)从所述生物质中分离出含脂质产物和含蛋白质产物。

[0018] 本文所描述的方法可以依序进行。因此，本发明提供一种从微藻生物质选择性提取含脂质产物、含碳水化合物产物及含蛋白质产物的方法。出于若干原因，这是有益的。首先，所获得的含脂质产物实质上不含碳水化合物材料和蛋白质材料。其次，碳水化合物材料和蛋白质材料是附加值产品，提供了额外的收益流。

[0019] 在一些实施例中，所述方法包括在pH<7下进行第一次提取，随后在pH>7下进行一次或多次提取，随后回收含脂质产物。因此，本发明提供一种从微藻生物质提取含脂质产物、含碳水化合物产物及含蛋白质产物的方法，所述方法包括：

[0020] (i)提供含有所述微藻生物质的初始含水混合物；

[0021] (ii)将所述初始含水混合物的pH值调到pH<7；

[0022] (iii)加热含有所述微藻生物质的所述酸性初始含水混合物以提供第一经过处理的混合物；

[0023] (iv)从所述第一经过处理的混合物分离固体和液体，以提供第一固体和含碳水化合物的液体；

[0024] (v)将所述第一固体与含水混合物组合以形成第二含有微藻生物质的含水混合物；

[0025] (vi)将所述第二含水混合物的pH值调到pH>7；

[0026] (vii)加热含有所述微藻生物质的所述碱性第二含水混合物以提供第二经过处理的混合物；

[0027] (viii)从所述第二经过处理的混合物分离固体和液体，以提供第二固体和含蛋白质的液体；

[0028] (ix)任选地，使用所述第二固体重复步骤(v)到(viii)，以提供第三固体和另外的含蛋白质的液体；

[0029] (x)将所述第二固体或所述第三固体与含水混合物组合，以形成最终的含水混合物；

[0030] (xi)用溶剂处理所述最终的含水混合物；

[0031] (xii)从所述最终含水混合物中分离所述溶剂，以提供含有脂质产物的溶剂。

[0032] 在一些实施例中，步骤(ii)中形成的混合物的pH值在约0.5到约2的范围内。在一些特定实施例中，步骤(ii)中形成的混合物的pH值为约1。

[0033] 在一些实施例中，步骤(vi)中形成的混合物的pH值在约11到约14的范围内。在一些特定实施例中，步骤(vi)中形成的混合物的pH值为约13。

[0034] 加热含有所述微藻生物质的酸性或碱性含水混合物的步骤可以使用任何适合的加热源进行。加热步骤可以在大气压下或在高于大气压下进行。在一些实施例中，加热含有所述微藻生物质的酸性或碱性含水混合物的步骤是通过用微波辐射处理所述混合物来进行的。

[0035] 用溶剂处理所述最终的含水混合物的步骤中使用的溶剂可以是任何非水性溶剂。

[0036] 在另一方面，本发明提供一种由本文所描述的方法制造的产物。

附图说明

[0037] 图1是绘示在酸性和碱性条件下通过不同微波照射时间得到的碳水化合物提取产率的比较的图。

[0038] 图2是绘示在酸性和碱性条件下通过不同微波照射时间得到的蛋白质提取产率的比较的图。

[0039] 图3是绘示仅在酸性条件下六次重复微波提取的碳水化合物提取产率的图。

[0040] 图4是绘示仅在酸性条件下六次重复微波提取的蛋白质提取产率的图。

[0041] 图5是绘示仅在碱性条件下六次重复微波提取的碳水化合物提取产率的图。

[0042] 图6是绘示仅在碱性条件下六次重复微波提取的蛋白质提取产率的图。

[0043] 图7是绘示在碱性到酸性条件下六次重复微波提取的碳水化合物提取产率的图。

[0044] 图8是绘示在碱性到酸性条件下六次重复微波提取的蛋白质提取产率的图。

[0045] 图9是绘示在酸性到碱性条件下六次重复微波提取的碳水化合物提取产率的图。

[0046] 图10是绘示在酸性到碱性条件下六次重复微波提取的蛋白质提取产率的图。

[0047] 图11是绘示通过外加葡萄糖进行的提取的碳水化合物回收率测试的图。

[0048] 图12是绘示通过外加BSA进行的提取的碳水化合物回收率测试的图。

[0049] 图13是提取的微藻脂质漂浮在提取缓冲液的表面上的照片。

[0050] 图14是绘示在酸性到碱性条件下从2.5g生物质和25g生物质六次重复微波提取所提取的碳水化合物产率的比较的图。

[0051] 图15是绘示在酸性到碱性条件下从2.5g生物质和25g生物质六次重复微波提取所提取的碳水化合物产率的比较的图。

[0052] 图16是绘示通过微量劳里法(micro-lowry method)六次重复微波提取的蛋白质提取效率的图。

[0053] 图17是绘示通过微量劳里法六次重复微波提取的蛋白质提取效率的图。

[0054] 图18是绘示以1:10的生物质与缓冲液比率和1:5的生物质与缓冲液比率进行的提取工艺之间的蛋白质提取产率的比较的图。

[0055] 图19是绘示使用湿生物质进行的七次重复微波提取的蛋白质提取效率的图。

[0056] 图20是绘示使用湿生物质进行的七次重复微波提取的碳水化合物提取效率的图。

[0057] 图21是绘示湿生物质、冷冻干燥的生物质及烘箱干燥的生物质的脂质含量分析的图。

[0058] 图22是绘示藻类生物质的化学特征的图。

[0059] 图23是绘示用于优化湿藻类生物质的微波提取条件的实验设计的流程图。

[0060] 图24是绘示使用湿藻类生物质的无灰分蛋白质提取效率的比较的图。

[0061] 图25是绘示使用湿藻类生物质的无灰分还原糖提取效率的比较的图。

[0062] 图26是绘示使用湿藻类生物质的无灰分碳水化合物提取效率的比较的图。

[0063] 图27是绘示利用三次微波提取的无灰分蛋白质提取效率的比较的图。

[0064] 图28是绘示利用三次微波提取的无灰分碳水化合物提取效率的比较的图。

[0065] 图29是绘示利用三次微波提取的蛋白质和碳水化合物回收率的比较的图。

[0066] 图30是绘示微波提取工艺的材料质量平衡的图。

[0067] 图31是绘示微波提取工艺的脂质回收率和损失率的图。

[0068] 图32是绘示在不同pH值下利用微波提取的无灰分碳水化合物提取效率的图。

[0069] 图33是绘示在不同pH值下利用微波提取的无灰分蛋白质提取效率的图。

[0070] 图34是绘示在不同pH值下利用微波提取的无灰分还原糖提取效率的图。

[0071] 图35是绘示在不同pH值下利用微波提取的总碳水化合物和蛋白质回收率的图。

[0072] 图36是绘示使用不同加热方法的无灰分蛋白质提取效率的图。

[0073] 图37是绘示使用不同加热方法的无灰分碳水化合物提取效率的图。

[0074] 图38是绘示总碳水化合物、蛋白质、脂质及灰分含量的图。

[0075] 图39是绘示在不同微波提取温度和时间下无灰分蛋白质提取效率的比较的图。

[0076] 图40是绘示在不同微波提取温度和时间下无灰分总碳水化合物提取效率的比较的图。

[0077] 图41是绘示在不同提取温度和时间下基于微波提取的功率消耗得到的总蛋白质和碳水化合物生产率的比较的图。

[0078] 图42是绘示不同提取条件的总功率消耗的比较的图。

[0079] 图43是绘示在25mL样品规模下基于利用不同提取条件的功率消耗得到的总蛋白质和碳水化合物生产率的比较的图。

[0080] 图44是绘示在不同样品规模下基于微波提取的功率消耗得到的总蛋白质和碳水化合物生产率的比较的图。

具体实施方式

[0081] 在第一方面，本发明提供一种从微藻生物质提取含脂质产物的方法，所述方法包括：(i)用微波辐射处理包含微藻生物质的含水混合物，及(ii)从经过处理的微藻生物质回收含脂质产物。

[0082] 如本文中所使用，术语“微藻”、“微藻的”和相关术语意思指任何单细胞的光合微生物。微藻又称为浮游植物、微植物或浮游藻类。典型的微藻包括绿藻(绿藻门)和蓝绿藻(蓝绿藻门)。

[0083] 如本文中所使用，术语“生物质”意思指来自活生物体或目前存活的生物体的生物材料。

[0084] 如本文中所使用，术语“脂质”意思指不可溶于水中但可溶于非极性有机溶剂中并且有油滑触感的任何有机化合物，例如脂肪、油、蜡、固醇或三酸甘油酯。

[0085] 如本文中所使用，术语“碳水化合物”意思指用作动物饮食中的主要能量来源的任何有机化合物，例如糖、淀粉、纤维素或胶质。

[0086] 如本文中所使用，术语“蛋白质”意思指含有碳、氢、氧、氮并且通常含有硫，并且由一条或多条氨基酸链构成的任何复杂有机大分子。

[0087] 用于提取含脂质产物以及任选地含碳水化合物产物和/或含蛋白质产物的微藻生物质是一种含水悬浮液。含水悬浮液可以通过使干燥的生物质发生水合作用来制备。水合作用可以通过使干燥的微藻生物质与水在足以使生物质再水合的温度下和时间内接触来进行。举例来说，可以将干燥的生物质浸入水中，保持约60分钟，来提供微藻生物质的含水悬浮液。

[0088] 或者，微藻生物质的含水悬浮液可以是先前未经历干燥步骤的“湿”生物质。如先前所提到的，在从微藻提取脂质时通常使用的干燥步骤是耗时并且耗能的，并且出于这一原因，从“湿”生物质直接提取含脂质产物可能特别有益。

[0089] 或者，微藻生物质的含水悬浮液可以是先前经历过部分干燥步骤的浓缩的藻类糊浆。

[0090] 微藻生物质的含水悬浮液包含以重量计约10％到约90％的水。

[0091] 微藻生物质可以源自于任何适合的微藻种类。特定微藻种类可以基于将源自于生物质的特定产物进行选择。举例来说，生物燃料可以源自于海洋微藻微拟球藻属(Nanochloropsis sp.)。微藻可以使用已知适合于特定种类的条件培养。举例来说，微拟球藻属(一种海洋藻类种类)可以在补充有适合培养基的海水池中培养。微藻还可以在光生物反应器系统中培养，其中包括温度和光强度在内的许多参数可以在无菌条件下进行控制。

[0092] 含脂质产物一旦从生物质释放，就会在含水悬浮液的顶部上形成油层。接着，可以通过物理方式从含水悬浮液分离这些脂质。任选地，可以在微波照射后对含水悬浮液进行离心，以帮助将悬浮液中的油层与水层和任何固体材料分离。任选地，可以在微波照射后用溶剂提取含水悬浮液，以从悬浮液中的水层和任何固体材料中提取含脂质产物。当脂质产物结合于生物质中时，溶剂提取可以是特别有用的。适合的溶剂包括非水性溶剂。适合的非水性溶剂包括非极性有机液体。烃类，例如己烷或石油醚，是适合此目的的非极性有机液体。其它适合的溶剂包括酯类、醚类、酮类以及硝化烃和氯化烃。

[0093] 除提取脂质外，还可以通过降低微藻生物质的含水悬浮液的pH值，从微藻生物质中选择性提取碳水化合物材料。因此，本发明提供一种从微藻生物质提取含脂质产物和含碳水化合物产物的方法，所述方法包括：(i)提供微藻生物质的含水悬浮液；(ii)将所述含水悬浮液的pH值调到pH<7；(iii)加热微藻生物质的含水悬浮液；及(iv)从所述生物质中分离出所述含脂质产物和所述含碳水化合物产物。

[0094] 含水悬浮液的pH值可以使用适合的酸来降低。酸可以是有机酸或无机酸。在一些实施例中，酸是无机酸。无机酸可以选自由硫酸、硝酸、盐酸及氢氟酸组成的群组。在一些特定实施例中，酸是硫酸。

[0095] 含水悬浮液的pH值可以降到低于pH6。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值降到低于约pH5。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值降到低于约pH4。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值降到低于约pH3。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值降到低于约pH2。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值可以降到介于约0.5与约3之间。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值可以降到介于约0.5与约2之间。

[0096] 加热微藻生物质的含水悬浮液的步骤可以使用任何适合的加热源进行。本领域技术人员已知许多加热源并且都可以用于此目的。实例包括热浴、高压釜及微波烘箱。加热步骤可以在大气压下或在高于大气压的压力下进行。在后一情形中，可以使用高压釜。

[0097] 已经发现，通过用微波辐射处理微藻生物质的含水悬浮液来进行加热步骤是特别有益的。使用微波辐射的一个益处是缩短了此步骤所花费的时间。

[0098] 使微藻生物质的含水悬浮液曝露于微波辐射的步骤可以包括将含有微藻生物质的含水悬浮液的容器放到微波烘箱中。或者，可以使微藻生物质的含水悬浮液通过微波烘箱，所述微波烘箱具有连续流管定位于其中。微藻生物质的含水悬浮液可以曝露于微波辐射，持续使得从含水悬浮液中分离出含脂质产物的任何时间段。在一些实施例中，使微藻生物质曝露于微波辐射一段约1分钟到约30分钟的时间。在一些实施例中，使微藻生物质曝露于微波辐射一段约10分钟的时间。微藻生物质曝露于微波辐射的时间段将至少部分取决于微波烘箱的输出功率。

[0099] 在一些实施例中，使微藻生物质的含水悬浮液曝露于微波辐射的步骤包括使用第一微波功率照射所述悬浮液，直到温度升到介于约80℃与约110℃之间，接着使用第二微波功率使所述悬浮液在约80℃和约110℃下保持介于约1分钟与约30分钟之间的时间，所述第二微波功率低于第一微波功率。在一些特定实施例中，使微藻生物质的含水悬浮液曝露于微波辐射的步骤包括在约1000瓦特(Watt)的微波功率下照射所述悬浮液，直到悬浮液的温度升到约100℃，接着使用约200瓦特的微波功率输入使悬浮液在约100℃下保持约10分钟。

[0100] 在如先前所描述进行加热之后，可以在含水悬浮液顶部上的油层中发现含脂质产物，而可以在水溶液中发现含碳水化合物产物。若情况就是如此，那么可以通过离心将油层和含水液体与固体生物质分离。由此提供适合直接或间接用于燃料目的的油以及含碳水化合物的水溶液。必要时，可以使用例如溶剂蒸发、结晶、色谱法等标准技术从水溶液中回收碳水化合物。或者，可以在所述工艺的后续阶段(如下文更详细地描述)使用溶剂提取从含水悬浮液中提取含脂质产物。

[0101] 通过增加微藻生物质的含水悬浮液的pH值，可以从微藻生物质选择性提取蛋白质材料。因此，在第三个方面，本发明提供了一种从微藻生物质提取含脂质产物和含蛋白质产物的方法，所述方法包括：(i)提供微藻生物质的含水悬浮液；(ii)将所述含水悬浮液的pH值调到pH>7；(iii)加热微藻生物质；及(iv)从所述生物质中分离出所述含脂质产物和所述含蛋白质产物。

[0102] 含水悬浮液的pH值可以使用适合的碱来增加。碱可以是有机碱或无机碱。在一些实施例中，碱是无机碱。无机碱可以选自由氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化铵组成的群组。在一些特定实施例中，碱是氢氧化钠。

[0103] 含水悬浮液的pH值可以增加到大于pH8。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值可以增加到大于pH9。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值可以增加到大于pH10。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值可以增加到大于pH11。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值可以增加到大于pH12。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值可以增加到介于约10与约13.5之间。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值可以增加到介于约11与约13.5之间。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值可以增加到介于约12与约13.5之间。

[0104] 加热微藻生物质的含水悬浮液的步骤可以使用任何适合的加热源进行。本领域技术人员已知许多加热源并且都可以用于此目的。实例包括热浴、高压釜及微波烘箱。加热步骤可以在大气压下或在高于大气压的压力下进行。在后一情形中，可以使用高压釜。

[0105] 使微藻生物质的含水悬浮液曝露于微波辐射的步骤可以包括将含有微藻生物质的含水悬浮液的容器放到微波烘箱中。或者，可以使微藻生物质的含水悬浮液通过微波烘箱，所述微波烘箱具有连续流管定位于其中。微藻生物质的含水悬浮液可以曝露于微波辐射，持续使得从含水悬浮液中分离出含脂质产物的任何时间段。在一些实施例中，使微藻生物质曝露于微波辐射一段约1分钟到约30分钟的时间。在一些实施例中，使微藻生物质曝露于微波辐射一段约10分钟的时间。微藻生物质曝露于微波辐射的时间段将至少部分取决于微波烘箱的输出功率。

[0106] 在一些实施例中，使微藻生物质的含水悬浮液曝露于微波辐射的步骤包括使用第一微波功率照射所述悬浮液，直到温度升到介于约80℃与约110℃之间，接着使用第二微波功率将所述悬浮液在约80℃和约110℃下保持介于约1分钟与约30分钟之间的时间，所述第二微波功率低于第一微波功率。在一些特定实施例中，使微藻生物质的含水悬浮液曝露于微波辐射的步骤包括在约1000瓦特的微波功率下照射所述悬浮液，直到悬浮液的温度升到约100℃，接着使用约200瓦特的微波功率输入使悬浮液在约100℃下保持约10分钟。

[0107] 在如先前所描述进行加热之后，可以在含水悬浮液顶部上的油层中发现含脂质产物，而可以在含水液体中发现含蛋白质产物。若情况就是如此，那么可以通过离心将油层和含水液体与固体生物质分离。由此提供适合直接或间接用于燃料目的的油以及含蛋白质的水溶液。必要时，可以使用例如溶剂蒸发、结晶、色谱法等标准技术从水溶液中回收蛋白质。或者，可以在所述工艺的后续阶段(如下文更详细地描述)使用溶剂提取从含水悬浮液中提取含脂质产物。

[0108] 酸性和碱性提取可以依序进行。因此，可以降低含水悬浮液的pH值，加热悬浮液，对混合物离心以提供油层和含碳水化合物的水层以及生物质团粒。接着，可以使生物质团粒悬浮于pH>7的水溶液中，以形成第二含水悬浮液，可以对所述第二含水悬浮液进行加热，接着对混合物离心，以提供含脂质层(如果存在的话)、含蛋白质的水层及生物质团粒。必要时，可以重复所述工艺。

[0109] 在一些实施例中，所述方法包括在pH<7下进行第一次提取，随后在pH>7下进行一次或多次提取，随后回收含脂质产物。因此，本发明提供一种从微藻生物质提取含脂质产物、含碳水化合物产物及含蛋白质产物的方法，所述方法包括：

[0110] (i)提供含有所述微藻生物质的初始含水混合物；

[0111] (ii)将所述初始含水混合物的pH值调到pH<7；

[0112] (iii)加热含有所述微藻生物质的酸性初始含水混合物以提供第一经过处理的混合物；

[0113] (iv)从所述第一经过处理的混合物分离固体和液体，以提供第一固体和含碳水化合物的液体；

[0114] (v)将所述第一固体与含水混合物组合以形成第二含有微藻生物质的含水混合物；

[0115] (vi)将所述第二含水混合物的pH值调到pH>7；

[0116] (vii)加热含有所述微藻生物质的碱性第二含水混合物以提供第二经过处理的混合物；

[0117] (viii)从所述第二经过处理的混合物分离固体和液体，以提供第二固体和含蛋白质的液体；

[0118] (ix)任选地，使用所述第二固体重复步骤(v)到(viii)，以提供第三固体和另外的含蛋白质的液体；

[0119] (x)将所述第二固体或所述第三固体与含水混合物组合，以形成最终的含水混合物；

[0120] (xi)用溶剂处理所述最终的含水混合物；

[0121] (xii)从所述最终的含水混合物中分离所述溶剂，以提供含有脂质产物的溶剂。

[0122] 含水悬浮液的pH值可以降到低于pH6。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值降到低于约pH5。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值降到低于约pH4。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值降到低于约pH3。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值降到低于约pH2。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值可以降到介于约0.5与约3之间。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值可以降到介于约0.5与约2之间。在一些实施例中，步骤(ii)中形成的混合物的pH值在约0.5到约2的范围内。在一些特定实施例中，步骤(ii)中形成的混合物的pH值为约1。

[0123] 含水悬浮液的pH值可以增加到大于pH8。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值增加到大于pH9。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值增加到大于pH10。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值增加到大于pH11。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值增加到大于pH12。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值可以增加到介于约10与约13.5之间。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值可以增加到介于约11与约13.5之间。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值可以增加到介于约12与约13.5之间。在一些实施例中，步骤(vi)中形成的混合物的pH值在约11到约14的范围内。在一些特定实施例中，步骤(vi)中形成的混合物的pH值为约13。

[0124] 加热含有所述微藻生物质的酸性或碱性含水混合物的步骤可以使用任何适合的加热源进行。加热步骤可以在大气压下或在高于大气压下进行。在一些实施例中，加热含有所述微藻生物质的酸性或碱性含水混合物的步骤是通过用微波辐射处理所述混合物来进行的。

[0125] 使微藻生物质的含水悬浮液曝露于微波辐射的步骤可以包括将含有微藻生物质的含水悬浮液的容器放到微波烘箱中。或者，可以使微藻生物质的含水悬浮液通过微波烘箱，所述微波烘箱具有连续流管定位于其中。微藻生物质的含水悬浮液可以曝露于微波辐射，持续使得从含水悬浮液中分离出含脂质产物的任何时间段。在一些实施例中，使微藻生物质曝露于微波辐射一段约1分钟到约30分钟的时间。在一些实施例中，使微藻生物质曝露于微波辐射一段约10分钟的时间。微藻生物质曝露于微波辐射的时间段将至少部分取决于微波烘箱的输出功率。

[0126] 在一些实施例中，使微藻生物质的含水悬浮液曝露于微波辐射的步骤包括使用第一微波功率照射所述悬浮液，直到温度升到介于约80℃与约110℃之间，接着使用第二微波功率将所述悬浮液在约80℃和约110℃下保持介于约1分钟与约30分钟之间的时间，所述第二微波功率低于第一微波功率。在一些特定实施例中，使微藻生物质的含水悬浮液曝露于微波辐射的步骤包括在约1000瓦特的微波功率下照射所述悬浮液，直到悬浮液的温度升到约100℃，接着使用约200瓦特的微波功率输入使悬浮液在约100℃下保持约10分钟。

[0127] 用溶剂处理所述最终的含水混合物的步骤中使用的溶剂可以是任何非水性溶剂。

[0128] 源自于微藻生物质的含脂质产物(油)、碳水化合物及蛋白质可以用于许多应用中。微藻油是由具有许多不同功能的不同类型的脂肪酸制成。中性脂质三酰基甘油(triacylglycerol，TAG)可以用于生物柴油；多不饱和脂肪酸(例如-3-脂肪酸DHA和EPA)可以用作保健食品；膜脂质可以用作生物表面活性剂和生物润滑剂。必要时，可以对含脂质产物进行进一步分级分离和/或纯化以提供特定脂质用于进一步使用。

[0129] 微藻来源的蛋白质可以用作人类和动物的食品或饲料蛋白质补充。微藻蛋白质还可以是用于生物催化和生物转化的新型酶的极为重要的来源。此外，这些蛋白质水解可以提供功能性多肽和寡肽，其可以用于食品应用、保健食品产品及药品。

[0130] 微藻来源的碳水化合物可以用作生物聚合物、粗糖以用于发酵生产生物化学品，例如生物乙醇、乳酸、抗生素。微藻碳水化合物可以被水解以产生功能性多糖或寡糖，其可以用作人类营养和健康产品。

[0131] 下文将借助以下非限制性实例描述本发明。

[0132] 实例

[0133] 微藻生物质是从海洋微藻微拟球藻属获得。在装有20ppt海水并补充有F/2培养基的3000L户外跑道池中培育微拟球藻属。pH值一般用1-5％CO2控制在7.9到8.2。在户外条件下，温度和照明未加控制。

[0134] 微藻还可以在光生物反应器系统中培养，其中包括温度和光强度在内的许多参数可以在无菌条件下进行控制。

[0135] 实例1—在酸性和碱性条件下微波提取干微藻生物质

[0136] 材料

[0137] 批号29的干微藻生物质是从南澳大利亚研发中心(South Australian Research and Development Institute，SARDI)获得。

[0138] 设备

[0139] 微波提取是在麦顿(Milestone)的Start Synth微波合成试验站进行。

[0140] 程序

[0141] 将干生物质(2.5g)添加到50mL圆形平底烧瓶中。向样品添加25mL的0.5M H2SO4溶液或25mL的0.5M NaOH。接着，在室温下培育样品约1小时，然后在100℃下微波照射2、5、10或30分钟。

[0142] 接着以10,000g将样品离心10分钟，并分别收集顶(脂质)层和中间(碳水化合物和蛋白质)层。

[0143] 通过重量分析法来分析脂质提取物，通过DNS法分析碳水化合物提取物，并通过BCA法分析蛋白质提取物。

[0144] 结果

[0145] 脂质提取

[0146] 在酸性或碱性条件下通过微波提取所提取的脂质的量很难分析。通过收集2mL顶层并通过重量分析法进行分析，从2.5g干生物质提取的脂质的量低于10mg。然而，通过大规模提取可以解决这一问题。

[0147] 优化碳水化合物和蛋白质提取的微波照射时间

[0148] 微波照射进行2分钟、5分钟、10分钟及30分钟时间，以便优化提取碳水化合物和蛋白质所需的加工条件。

[0149] 结果显示于图1中。碱性条件不适于碳水化合物提取。基于2、5、10及30分钟提取所计算的碳水化合物含量全部低于0.2％。另一方面，基于在酸性条件下的2、5、10及30分钟提取所计算的碳水化合物含量为约4％到5％，并且最大值是在30分钟照射之后获得，而最小值是在2分钟照射之后获得。在基于5分钟与10分钟照射所计算的碳水化合物含量之间仅存在较小差异。

[0150] 如图2中可见，对于蛋白质提取，碱性条件优于酸性条件。基于在碱性条件下的2、5、10及30分钟提取所计算的蛋白质含量为4％到6％，并且最大值是通过10分钟照射获得。
基于在酸性条件下的2、5、10及30分钟提取所计算的蛋白质含量为2％到3％。最大值是在30分钟照射之后获得，并且第二最大值是在10分钟照射之后获得。

[0151] 此外，比较在不同照射时间之后所获得的碳水化合物和蛋白质含量值，差异较小。然而，为了实现碳水化合物和蛋白质的高提取产率并且节省能量和时间，选择10分钟提取进行进一步实验。

[0152] 在酸性条件下重复微波提取

[0153] 在酸性条件下重复进行微波提取六次，以测试从干微藻生物质提取碳水化合物和蛋白质的效率。

[0154] 如图3中所示，在六次重复酸性提取之后，从2.5g干微藻生物质提取的总碳水化合物为约6.5％。第一次提取从干微藻生物质回收到约4％的碳水化合物，占总提取的碳水化合物的58.35％，并且第二次提取回收到总提取的碳水化合物的23.91％。因此，通过在酸性条件下进行的第一次和第二次微波提取可以提取到约85％的碳水化合物。

[0155] 然而，在酸性条件下蛋白质提取的提取效率不同于碳水化合物提取。基于第一次提取所计算的干微藻生物质的蛋白质含量为约2.6％，占在6次重复提取之后所提取的总蛋白质的33.85％。从第二次到第六次提取获得的值是类似的。这表明，在酸性条件下进行微波提取的效率可能不足以从干微藻生物质提取蛋白质。

[0156] 在碱性条件下重复微波提取

[0157] 在碱性条件下重复进行微波提取六次，以测试从干微藻生物质提取碳水化合物和蛋白质的效率。

[0158] 在碱性条件下进行的微波提取不适于从干微藻生物质提取碳水化合物。在6次重复提取之后，从干微藻生物质提取的总碳水化合物以重量计(g碳水化合物/g干生物质)低于0.2％。然而，如在图6中所示，在六次连续碱性提取之后，从2.5g干微藻生物质提取的总蛋白质为约0.28g，占干生物质的11％。第一次提取回收到总提取蛋白质的约52.72％，并且第二次提取回收到总提取蛋白质的20.93％。因此，通过在碱性条件下进行的第一次和第二次微波提取可以提取到约74％的蛋白质。

[0159] 在碱性到酸性条件下重复微波提取

[0160] 在碱性到酸性条件下重复进行微波提取六次，以测试从干微藻生物质提取碳水化合物和蛋白质的效率。第一次提取是在碱性条件下并且第二次和第三次提取变为酸性条件。第四次和第五次提取又是在碱性条件下并且第六次提取变为酸性条件。

[0161] 结果显示于图7中。碳水化合物在碱性到酸性重复提取下的提取结果不同于仅在酸性和碱性条件下的提取。在第一次碱性提取之后，从干生物质提取的碳水化合物低于0.2％，与从仅碱性提取获得的结果相同。然而，在变为酸性条件之后，第二次和第三次提取显示出低得多的碳水化合物提取效率。在仅酸性条件下，第一次和第二次提取提供约4％和
1.5％的碳水化合物。在碱性变为酸性提取之后，第二次和第三次提取都是在酸性条件下，并且从这两次提取获得的碳水化合物含量仅为约1.5％和1％。此外，在六次重复酸性提取之后计算的总碳水化合物含量为约6.5％并且在六次重复碱性到酸性提取之后计算的总碳水化合物含量为约3％。

[0162] 蛋白质提取结果显示于图8中。基于六次重复碱性到酸性提取所计算的总蛋白质含量为约14％，高于从六次重复仅碱性提取所获得的结果。此外，第一碱性提取占干微藻生物质的约6％并且占所提取的总蛋白质的42.15％。第二次和第三次提取(酸性)总计占干微藻生物质的约4％并且此类似于第一次和第二次仅酸性提取(图4)。与第二次和第三次提取(酸性)相比较，通过第四次提取(碱性)提取到更多蛋白质。

[0163] 在酸性到碱性条件下重复微波提取

[0164] 在酸性到碱性条件下重复进行微波提取六次，以测试从干微藻生物质提取碳水化合物和蛋白质的效率。第一次提取是在酸性条件下，第二次和第三次提取变为碱性条件，第四次和第五次提取又是在酸性条件下，并且第六次提取变为碱性条件。

[0165] 结果显示于图9中。通过在酸性条件下重复提取从干生物质中提取碳水化合物的性能类似于从仅碱性和酸性条件得到的结果(图6)。大部分碳水化合物都是通过第一次、第四次及第五次提取(酸性)所提取，占通过六次提取所提取的总碳水化合物的约95％。然而，即使第二次、第三次及第六次提取(碱性)仅占干生物质的约5％，由这三次提取所计算的实际碳水化合物含量也比从仅碱性提取获得的结果高得多(图5)。

[0166] 然而，基于六次重复酸性到碱性提取所计算的总蛋白质含量为约10％，高于从六次重复仅碱性提取所获得的结果(图6)并且类似于由碱性到酸性提取得到的结果(图8)。此外，对于蛋白质来说，碱性提取显示的性能优于酸性提取。通过第二次、第三次及第六次提取(碱性)获得约65％的提取蛋白质。

[0167] 通过向干生物质外加已知量的脂质、碳水化合物和蛋白质来测试脂质、碳水化合物和蛋白质的回收率

[0168] 向干微藻生物质外加4mg标准蛋白质BSA、125mg葡萄糖及0.260g芥花油。接着使用“酸性-碱性-碱性-酸性-酸性-碱性”方案进行多次提取。同时进行不添加蛋白质、葡萄糖或油的对照提取。

[0169] 脂质回收率仍难以测量。甚至在外加0.26克油情况下，在处理之后所提取的脂质量仍太少而无法分析。

[0170] 对于碳水化合物回收率，外加的材料的第一次酸性提取得到213.64mg葡萄糖当量。这比得到78.08mg的对照提取高出135.56mg(图11)。这一值与外加葡萄糖125mg相当接近。此结果证实，在第一次酸性提取中回收到所有添加的葡萄糖。添加的BSA蛋白质和芥花油可贡献从外加生物质回收的额外的10mg葡萄糖当量。

[0171] 应注意，在标准条件(如关于对照物所使用)下提取的总葡萄糖为107.23mg，低于先前数轮(图9)在相同条件下的平均值131.05mg。

[0172] 对于蛋白质回收率，外加的材料的第一次酸性提取得到51.5mg BSA当量。这比得到38.25mg的对照提取高出13.25mg(图12)。然而，与在提取之间添加的BSA的量4mg相比较，测试值高得多。此外，根据从六次提取回收的总蛋白质，外加的样品显示23.5g的BSA当量，高于对照样品。这可能是因为外加蛋白质的量太少而无法覆盖重复实验之间的差异。

[0173] 实例2—在选定条件下的提取的按比例放大

[0174] 为了在微波提取期间回收大部分的碳水化合物和蛋白质，选择酸性到碱性(酸性-碱性-碱性-酸性-酸性-碱性)重复条件。根据图9和10，通过六次提取从干微藻生物质提取的总碳水化合物含量为至多5％，并且通过六次提取从干微藻生物质提取的蛋白质含量为至多10％。此外，根据图9，所提取的大多数碳水化合物能够通过第一次酸性提取来提取，并且仅极少量的提取的碳水化合物是由第二次和第三次提取提供。对于蛋白质，第一次酸性提取占总提取蛋白质的约25％，并且第二次和第三次提取分别占总提取蛋白质的约30％和20％。因此，酸性到碱性条件不仅使碳水化合物和蛋白质提取效率最大化，而且还实现了成品产物的分离。在第一次酸性提取之后，移出了大部分的提取的碳水化合物。因此，来自第二次和第三次碱性提取的提取物几乎不含碳水化合物。

[0175] 材料

[0176] 批号29的干微藻生物质是从南澳大利亚研发中心(SARDI)获得。

[0177] 设备

[0178] 微波提取是在麦顿的Start Synth微波合成试验站进行。

[0179] 程序

[0180] 将干生物质(25g)添加到500mL平底烧瓶中。添加0.5M H2SO4(250mL)，并且在室温下培育样品约1小时。接着，在微波烘箱中于100℃下照射样品10分钟。

[0181] 接着以10,000g将混合物离心10分钟，并分别收集顶(脂质)层和中间(碳水化合物和蛋白质)层以提供第一次提取产物。

[0182] 将团粒再悬浮于250mL的0.5M NaOH中并重复微波照射、离心和产物分离工艺，以提供第二次提取产物。

[0183] 将团粒再次再悬浮于250mL的0.5M NaOH中并重复微波照射、离心和产物分离工艺，以提供第三次提取产物。

[0184] 将团粒再次再悬浮于250mL的0.5M H2SO4中并重复微波照射、离心和产物分离工艺，以提供第四次提取产物。

[0185] 将团粒再次再悬浮于250mL的0.5M H2SO4中并重复微波照射、离心和产物分离工艺，以提供第五次提取产物。

[0186] 最后，将团粒再次再悬浮于250mL的0.5M NaOH中并重复微波照射、离心和产物分离工艺，以提供第六次提取产物。

[0187] 通过重量分析法来分析脂质提取物，通过DNS法分析碳水化合物提取物，并通过BCA法分析蛋白质提取物。

[0188] 结果

[0189] 脂质提取物

[0190] 在每次提取之后未观察到脂质层。因此，收集每次提取的上清液并合并在一起，由此增加提取物中脂质的总量。然而，使样品在室温下静置过夜之后，未观察到脂质层。相当大量的生物质漂浮在样品中，并且推测这使得不太可能观察到所提取的脂质。因此，从样品的顶层收集100mL样品，并通过重量分析法对此物质进行脂质分析。

[0191] 所提取的脂质的不可见性也可能是由容器的形状所致。在常规烧杯中，很难在大量水的顶部上辨识少量的油。因此，为了在不减少样品中的水量的情况下浓缩所提取的油，使用了容量瓶。根据样品的体积，将可能含有脂质的提取物放入可观测的容量瓶中。静置过夜之后，少量的油显示在瓶壁上(图13)。

[0192] 碳水化合物和蛋白质提取物

[0193] 较大规模的碳水化合物提取的结果与小规模提取相当(图14)。因此，碳水化合物提取的按比例放大是成功的。然而，如图15中所示，在较大规模上蛋白质提取的效率类似于小规模提取。

[0194] 实例3—不同批次干微藻生物质的提取

[0195] 材料

[0196] 微藻生物质是从南澳大利亚研发中心(SARDI)获得并且在60到80℃下烘箱干燥。

[0197] 设备

[0198] 微波提取是在麦顿的Start Synth微波合成试验站进行。

[0199] 程序

[0200] 将微藻粉(2.5g)添加到50mL平底烧瓶中(一式两份)。添加0.5M H2SO4(25mL)并混合样品，接着在室温下培育约1小时以使生物质再水合。测量样品的pH值，接着在微波烘箱中，在以下条件下加工样品：

[0201] ·在1000瓦特微波功率下照射每一样品，直到样品温度升到100℃(对于25mL样品体积，此通常花费约30秒)；

[0202] ·在200W微波功率输入下，使样品在100℃保持10分钟。

[0203] 接着，在水浴中冷却样品3到5分钟，之后将其转移到离心管中并以10,000g离心10分钟。

[0204] 接着将上清液转移到25mL量筒中以测量体积。将1mL上清液转移到1.5mL离心管中以进行碳水化合物和蛋白质分析。

[0205] 将第一次提取之后获得的团粒悬浮于25mL的0.5M NaOH溶液中并且重复第一次提取的工艺进行第二次提取。

[0206] 接着，将第二次提取之后获得的团粒悬浮于25mL的0.5M NaOH溶液中并且重复第一次提取的工艺进行第三次提取。

[0207] 接着，将第三次提取之后获得的团粒悬浮于25mL的0.5M H2SO4溶液中并且重复第一次提取的工艺进行第四次提取。

[0208] 将第四次提取之后获得的团粒悬浮于25mL的0.5M H2SO4溶液中并且重复第一次提取的工艺进行第五次提取。

[0209] 将第五次提取之后获得的团粒悬浮于25mL的0.5M NaOH溶液中并且重复第一次提取的工艺进行第六次提取。

[0210] 结果

[0211] 如表1中所示，pH值随在不同条件下进行的每一次提取而变化。第一次提取的pH值为1.2。这是因为生物质是在强碱性条件下收集，并且所添加的酸部分被碱性生物质中和。在第一次提取之后，通过添加0.5M NaOH溶液作为第二次和第三次提取缓冲液，pH值升高到
13。第四次和第五次提取是在酸性条件下，并且pH值降到约0.7，显著低于第一次提取的pH值。最后，通过添加0.5M NaOH溶液将第六次提取的pH值增加到13.6。

[0212] 每次提取之后所收集的上清液体积不同。在第一次提取之后，收集到22.5mL上清液。这比所添加的用于提取的提取缓冲液的体积少约2.5mL。由于第一次提取是从干生物质开始，故提取缓冲液的一部分将与团粒中的生物质整合。从第二次到第六次提取，上清液的体积接近于所添加的体积。

[0213] 表1—每一提取工艺的上清液的pH值和体积

[0214]

[0215] 如图16中所示，在六次重复微波提取之后，所提取的蛋白质总量为实验中使用的生物质的AFDW的11％。与酸性条件下的第一次、第四次、第五次提取相比较，在碱性条件下的第二次和第三次提取显示较高的蛋白质提取产率。此外，从第四次和第五次提取(酸性条件)获得的蛋白质的提取产率较低。这可能是因为大部分可提取的蛋白质都在第一次酸性提取之后提取。

[0216] 实例4—通过将生物质的量从2.5克增加到5克来降低所用提取缓冲液的总量(生物质与提取缓冲液比率为1:5)。

[0217] 材料

[0218] 微藻生物质是从南澳大利亚研发中心(SARDI)获得并且在60到80℃下烘箱干燥。

[0219] 设备

[0220] 微波提取是在麦顿的Start Synth微波合成试验站进行。

[0221] 程序

[0222] 将微藻粉(5g)添加到50mL平底烧瓶中(一式两份)。添加1M H2SO4(25mL)并混合样品，接着在室温下培育约1小时以使生物质再水合。测量样品的pH值，接着在微波烘箱中，在以下条件下加工样品：

[0223] ·在1000瓦特微波功率下照射每一样品，直到样品温度升到100℃(对于25mL样品体积，此通常花费约30秒)；

[0224] ·在200W微波功率输入下，使样品在100℃保持10分钟。

[0225] 接着，在水浴中冷却样品3到5分钟，之后将其转移到离心管中并以10,000g离心10分钟。

[0226] 接着将上清液转移到25mL量筒中以测量体积。将1mL上清液转移到1.5mL离心管中以进行碳水化合物和蛋白质分析。

[0227] 将第一次提取之后获得的团粒悬浮于25mL的0.5M NaOH溶液中并且重复第一次提取的工艺进行第二次提取。

[0228] 接着，将第二次提取之后获得的团粒悬浮于25mL的0.5M NaOH溶液中并且重复第一次提取的工艺进行第三次提取。

[0229] 接着，将第三次提取之后获得的团粒悬浮于25mL的0.5M H2SO4溶液中并且重复第一次提取的工艺进行第四次提取。

[0230] 将第四次提取之后获得的团粒悬浮于25mL的0.5M H2SO4溶液中并且重复第一次提取的工艺进行第五次提取。

[0231] 将第五次提取之后获得的团粒悬浮于25mL的0.5M NaOH溶液中并且重复第一次提取的工艺进行第六次提取。

[0232] 结果

[0233] 表2—每一提取工艺的上清液的pH值和体积(生物质与提取缓冲液比率为1:5)[0234]

[0235] 即使所用提取缓冲液的量未改变，为了将生物质与提取生物质比率从1:10增加到1:5，使所用生物质的量加倍。因此，为了将第一次提取的pH值保持在约1，向5g干生物质中添加25mL的1M H2SO4溶液而非使用0.5M H2SO4。除第一次提取外，对于第二次到第六次提取使用相同的提取缓冲液。每次提取的pH值为约0.5到1或为约12到13。

[0236] 与以1:10的生物质与缓冲液比率进行的提取相比较，以1:5的生物质与缓冲液比率进行第一次提取之后出现较多的体积损失。在第一次提取之后仅收集到20mL上清液，由此表明5mL的提取缓冲液合并到生物质中。从第二次到第六次提取所收集的上清液的体积仍为约25mL。

[0237] 结果

[0238] 如图17中所示，在六次重复微波提取之后，所提取的蛋白质总量为所用生物质的AFDW的13％。碱性条件又再一次显示比酸性条件高得多的蛋白质提取产率。与从以1:10的生物质与缓冲液比率进行的提取所获得的蛋白质提取产率相比较，以1:5的生物质与缓冲液比率得到的蛋白质提取产率较高(图18)，但第一次和第二次提取除外。

[0239] 实例5—湿微藻生物质的直接微波提取

[0240] 材料

[0241] 微藻生物质是从南澳大利亚研发中心(SARDI)获得。

[0242] 设备

[0243] 微波提取是在麦顿的Start Synth微波合成试验站进行。

[0244] 程序

[0245] 将湿生物质(25g)添加到50mL平底烧瓶中(一式两份)。接着在微波烘箱中，在以下条件下加工每一样品：

[0246] ·在1000瓦特微波功率下照射每一样品，直到样品温度升到100℃(对于25mL样品体积，此通常花费约30秒)；

[0247] ·在200W微波功率输入下，使样品在100℃保持10分钟。

[0248] 接着，在水浴中冷却样品3到5分钟，之后将其转移到离心管中并以10,000g离心10分钟。

[0249] 接着将上清液转移到25mL量筒中以测量体积。将1mL上清液转移到1.5mL离心管中以进行碳水化合物和蛋白质分析。

[0250] 将第一次提取之后获得的团粒悬浮于12mL的1M H2SO4中并且重复第一次提取的工艺进行第二次提取。

[0251] 将第二次提取之后获得的团粒悬浮于15mL的0.5M NaOH中并且重复第一次提取的工艺进行第三次提取。

[0252] 接着，将第三次提取之后获得的团粒悬浮于13mL的0.5M NaOH中并且重复第一次提取的工艺进行第四次提取。

[0253] 接着，将第四次提取之后获得的团粒悬浮于12mL的1M H2SO4中并且重复第一次提取的工艺进行第五次提取。

[0254] 将第五次提取之后获得的团粒悬浮于16mL的1M H2SO4中并且重复第一次提取的工艺进行第六次提取。

[0255] 将第六次提取之后获得的团粒悬浮于17mL的0.5M NaOH中并且重复第一次提取的工艺进行第七次提取。

[0256] 结果

[0257] 表3—每一提取工艺的上清液的pH值和体积(湿生物质)

[0258]  条件 pH 所添加的提取缓冲液的体积(mL) 所收集的上清液的体积(mL)
1 未处理 7 0 8
2 1M H2SO4 0.63 12 15
3 0.5M NaOH 10.14 15 13
4 0.5M NaOH 13.09 13 12
5 1M H2SO4 0.68 12 16
6 1M H2SO4 0.67 16 17
7 0.5M NaOH 12.4 17 17

[0259] 为了将优化的微波提取技术应用于湿微藻生物质，对先前实例中所描述的方法进行修改。首先，湿生物质含有82.1％的水，并因此，无需任何调整，干物质与水接近于1比5，类似于使用干微藻生物质的提取方法的优化的条件。然而，很难调整湿生物质的pH值。因此，第一次提取是在不调整pH值情况下进行。在微波照射和离心之后，从生物质中分离出8mL的水。接着，有可能调整生物质的pH值进行第二次提取。测量每次提取之后提取物的体积，以便计算在每次提取之后提取的蛋白质和碳水化合物的量，并且也计算出有待添加以进行随后提取的提取缓冲液的体积。

[0260] 如图19和20中所示，每次提取的总蛋白质和碳水化合物回收率类似于使用干微藻生物质所获得的回收率。总提取蛋白质回收量占所用生物质总干重的约10％，并且总提取碳水化合物的回收量占所用生物质总干重的约7％。此外，添加到每次提取中的提取缓冲液的体积比用于提取干生物质的体积低得多。因此，每次提取的蛋白质和碳水化合物的浓度高得多。当比较使用干微藻生物质与湿微藻生物质之间的蛋白质和碳水化合物提取效率时，对于蛋白质和碳水化合物提取得到类似的提取效率。此外，通过直接使用微藻生物质，不涉及干燥工艺。这是有益的，因为这意味着在使用离心机来收集微藻生物质之后，由此获得的湿糊浆可以在不干燥的情况下直接进行加工。

[0261] 实例6—使用冷冻干燥法测定湿藻类生物质的水分含量。

[0262] 材料

[0263] 冷冻的湿藻类生物质是于2011年6月15日从SARDI接收的。

[0264] 程序

[0265] 称取约200g湿生物质到1L玻璃烧杯中

[0266] 实际重量：200.594g

[0267] 对空烧杯称重：81.980g

[0268] 使冷冻的生物质在室温下融化，持续30分钟，并在烧杯内使用液氮将其再冷冻，以形成薄冰壳

[0269] 将生物质冷冻干燥24小时

[0270] 对烧杯+干生物质称重：134.252g

[0271] 结果

[0272] 干物质的重量为52.272g。湿藻类生物质的干物质含量为26.06％。湿生物质的水分含量为73.94％。

[0273] 实例7—使用烘箱干燥法测定湿藻类生物质的水分含量。

[0274] 材料

[0275] 冷冻的湿藻类生物质是于2011年6月15日从SARDI接收的。

[0276] 程序

[0277] 称取约50g冷冻的湿藻类生物质于小玻璃烧杯中。生物质的实际重量：59.139g[0278] 对空烧杯称重：47.690g

[0279] 在烧杯内，在60℃下干燥生物质96小时

[0280] 对干生物质+烧杯称重：64.1174g

[0281] 结果

[0282] 干物质的重量为16.737g。湿藻类生物质的干物质含量为28.30％。湿生物质的水分含量为71.70％。

[0283] 实例8—湿藻类生物质、冷冻干燥的藻类生物质及烘箱干燥的藻类生物质的脂质含量的测定

[0284] 材料

[0285] 冷冻的湿藻类生物质是于2011年6月15日从SARDI接收的。冷冻干燥的藻类生物质和烘箱干燥的藻类生物质分别是根据实例6和7中陈述的方法制备。

[0286] 设备

[0287] 使用Allegra x-12R离心机(贝克曼库尔特公司(Backman Coulter))，使用FX6100转子(贝克曼库尔特公司)和耐氯仿离心管(50mL)进行离心。

[0288] 所用真空蒸发器为VirTis台式Benchtop K系列，并且冷冻干燥器为Labconco。

[0289] 程序

[0290] ·取出约6g冷冻的湿藻类生物质并在室温下融化，持续30分钟

[0291] ·称取约2.5g湿藻类生物质到50mL离心管中(一式两份)

[0292] 实际重量：a.2.5819g

[0293] b.2.5305g

[0294] ·称取约0.5g冷冻干燥的藻类生物质到50mL离心管中(一式两份)

[0295] 实际重量：a.0.4978g

[0296] b.0.5197g

[0297] ·称取约0.5g烘箱干燥的藻类生物质到50mL离心管中(一式两份)

[0298] 实际重量：a.0.4962g

[0299] b.0.5185g

[0300] ·将17.8mL溶剂(甲醇:氯仿:水2:1:0.8)添加到湿生物质样品中

[0301] ·将22.8mL溶剂(甲醇:氯仿:水2:1:0.8)添加到冷冻干燥和烘箱干燥的生物质样品中

[0302] ·涡旋所有样品并在室温下培育所有样品1小时(同时每5分钟手动振荡)[0303] ·向每一样品中再添加6mL氯仿和6mL水并涡旋

[0304] ·以3000g对所有样品离心5分钟，以实现相分离

[0305] ·将6mL的底部氯仿层收集到预先称重的玻璃试管中

[0306] 每个管的重量：

[0307] 湿藻类生物质：a.11.5835g

[0308] b.11.2718g

[0309] 冷冻干燥的藻类生物质：a.11.6648g

[0310] b.11.5558g

[0311] 烘箱干燥的藻类生物质：a.11.5857g

[0312] b.11.5481g

[0313] ·使用真空蒸发器蒸发氯仿，持续6小时

[0314] ·对管+脂质提取物称重

[0315] 结果

[0316] 结果显示于图21中。

[0317] 实例9—湿藻类生物质、冷冻干燥的藻类生物质及烘箱干燥的脂质提取物特征分析

[0318] 材料

[0319] 脂质提取物是从湿藻类生物质、冷冻干燥的藻类生物质及烘箱干燥的藻类生物质获得。

[0320] 程序

[0321] 由NCRIS使用气相色谱法进行脂质特征分析。结果显示于表4中。

[0322] 表4—生物质和提取物的脂质特征

[0323]

[0324] 实例10—藻类生物质的总碳水化合物含量分析

[0325] 材料

[0326] 冷冻干燥的藻类生物质是根据实例6制备。苯酚试剂是根据需要制备(苯酚:MilliQ水4:1w/v)

[0327] 程序

[0328] 标准曲线制备如下：

[0329] 通过将1mg葡萄糖溶解于100mL MilliQ水中来制备0.1g/L葡萄糖储备液。

[0330] 如下表中所详述的，在大玻璃试管中制备葡萄糖标准品：

[0331]葡萄糖储备液(0.1g/L)体积(ml) MilliQ水(ml) 葡萄糖浓度(g/l)
0.00 2.00 0.00
0.20 1.80 0.01
0.40 1.60 0.02
0.60 1.40 0.03
0.80 1.20 0.04
1.00 1.00 0.05

[0332] 通过将2mL MilliQ水添加到8g苯酚中来制备苯酚试剂(80％ w/w于MilliQ水中)。

[0333] 将2mL每一样品添加到大试管中。

[0334] 向每一标准品和样品添加0.05mL苯酚试剂。

[0335] 在涡旋器上进行混合。

[0336] 向每一标准品和样品添加5mL浓硫酸。硫酸试剂应迅速添加到试管中。将酸流对准液面而非对准试管的侧壁以便获得良好的混合。(这些反应是由向含水样品中添加H2SO4时所产生的热驱动的。因此，硫酸的添加速率必须标准化。)

[0337] 在涡旋器上进行混合。

[0338] 使管静置10分钟，接着放到25℃浸浴中，保持10分钟(即，用以将其冷却到室温)。

[0339] 再次涡旋试管，之后读取吸光度。

[0340] 将每一标准品和样品倒入石英比色皿中并使用0g/L的标准品作为空白。

[0341] 在490nm下读取吸光度。

[0342] 将废料丢入玻璃废料瓶中。

[0343] 总碳水化合物浓度可以使用从标准曲线获得的等式进行计算。

[0344] ·将0.1g冷冻干燥的生物质悬浮于1mL MilliQ水中(一式三份)

[0345] 实际重量：a.0.1021g

[0346] b.0.0999g

[0347] c.0.1005g

[0348] ·使用MilliQ水制备每一样品的1:1000稀释液，总体积为1mL

[0349] ·用力涡旋每一样品

[0350] ·将0.4mL每一样品转移到带有盖子的大玻璃试管中

[0351] ·将0.4mL MilliQ水转移到带有盖子的大玻璃试管中作为空白

[0352] ·向每一样品添加0.01mL苯酚试剂(80％)

[0353] ·用力涡旋每一样品

[0354] ·向每一样品添加1mL浓硫酸

[0355] ·使所有样品在室温下静置10分钟

[0356] ·在25℃下培育所有样品10分钟

[0357] ·将每一空白和样品倒入石英比色皿中并在490nm下读取OD

[0358] 总碳水化合物浓度可以使用从标准曲线获得的等式进行计算。

[0359] 结果

[0360] 测定藻类生物质的总碳水化合物含量为21.39％±1.67。

[0361] 实例11—藻类生物质的总蛋白质含量分析

[0362] 材料

[0363] 冷冻干燥的藻类生物质是根据实例6制备。

[0364] 程序

[0365] 将样品送到NCRIS以使用TKN分析仪进行总蛋白质含量分析。

[0366] 结果

[0367] 测定藻类生物质的总蛋白质含量为30.10％±1.66。

[0368] 实例12—藻类生物质的总灰分含量分析

[0369] 材料

[0370] 冷冻干燥的藻类生物质是根据实例6制备。

[0371] 程序

[0372] 将样品送到NCRIS以用于进行总灰分含量分析。

[0373] 结果

[0374] 测定藻类生物质的总灰分含量为16.96％±0.27。

[0375] 概述

[0376] 分别使用三种独立的分析方法，即，苯酚和硫酸法、TKN法以及布莱与戴尔法(Bligh and Dyer method)得到藻类生物质的总碳水化合物、蛋白质及脂质含量。此外，通过组合灰分含量的结果，总干内含物回收率为约95％(图22)。在此类较小差异下，能够得出结论，藻类生物质的化学表征得以完成并且结果的准确性是可信赖的。同时，当前藻类生物质的主要代谢物特征将直接用作提取效率的基线，以优化新颖的无溶剂微波提取技术。

[0377] 实例13—在湿藻类生物质下无溶剂微波提取条件的优化

[0378] 实验设计显示于图23中。

[0379] 根据先前的结果，所用湿藻类生物质的批次含有74％水分和26％干内含物。因此，湿生物质的固体与液体比率为约1:3.5。然而，在直接使用湿生物质进行几轮微波提取测试之后，高固体含量降低了提取工艺的混合效率以及能量转化。同时，其还在收集产物和重新开始随后的提取方面引起一定困难。为了解决这些技术难题并且使固体与液体比率标准化以进行进一步工艺研究，将生物质稀释成1:10的固体与液体比率。与初始的湿生物质相比较，稀生物质的混合和转移要容易得多。

[0380] 实例14—微波加热时间优化

[0381] 材料

[0382] 冷冻的湿藻类生物质是于2011年6月15日从SARDI接收的。

[0383] 设备

[0384] 所用微波提取单元为麦顿的Start Synth微波合成试验站。

[0385] 程序

[0386] ·准确地称取7×10g的湿生物质并将其放入50mL平底烧瓶中。

[0387] 每一样品的实际重量：a.2-1(在pH1下加热2分钟)：9.9565g

[0388] b.10-1(在pH1下加热10分钟)：9.9564g

[0389] c.20-1(在pH1下加热20分钟)：10.0357g

[0390] d.30-1(在pH1下加热30分钟)：10.0845g

[0391] e.2-13(在pH13下加热2分钟)：9.9564g

[0392] f.10-13(在pH13下加热10分钟)：10.0357g

[0393] g.20-13(在pH13下加热20分钟)：10.0845g

[0394] ·将18.6mL的0.5M H2SO4溶液添加到样品2-1、10-1、20-1及30-1中并充分混合(固体与液体比率将为1:10)。

[0395] ·使用10M KOH溶液将每一样品的pH值调到1。

[0396] ·将18.6mL的0.5M NaOH溶液添加到样品2-13、10-13及20-13中并充分混合(固体与液体比率将为1:10)。

[0397] ·使用5M H2SO4溶液将每一样品的pH值调到13。

[0398] ·在微波中，在以下条件下加工样品：

[0399] 在1000瓦特微波功率下照射每一样品，直到样品温度升到100℃

[0400] 在200W微波功率输入下，保持每一样品在100℃下照射2、10、20、30分钟。

[0401] ·在加工之后，在水浴中冷却样品3到5分钟。

[0402] ·将样品转移到离心管中并以8,000g离心10分钟。

[0403] ·将上清液倒入25mL量筒中以测量体积。

[0404] 上清液体积：a.2-1(在pH1下加热2分钟)：17.5mL

[0405] b.10-1(在pH1下加热10分钟)：17.0mL

[0406] c.20-1(在pH1下加热20分钟)：20.0mL

[0407] d.30-1(在pH1下加热30分钟)：19.0mL

[0408] e.2-13(在pH13下加热2分钟)：17.5mL

[0409] f.10-13(在pH13下加热10分钟)：19.0mL

[0410] g.20-13(在pH13下加热20分钟)：19.0mL

[0411] ·根据去除的上清液的体积，将样品2-1、10-1、20-1及30-1各自的团粒再悬浮于0.5M NaOH溶液中。

[0412] ·使用5M H2SO4溶液将每一样品的pH值调到13。

[0413] ·根据去除的上清液的体积，将样品2-13、10-13、20-13各自的团粒再悬浮于0.5M H2SO4溶液中。

[0414] ·使用10M KOH溶液将每一样品的pH值调到1。

[0415] ·在微波中，在以下条件下加工样品作为第二次提取：

[0416] 在1000瓦特微波功率下照射每一样品，直到样品温度升到100℃

[0417] 在200W微波功率输入下，保持每一样品在100℃下加热2、10、20、30分钟。

[0418] ·在加工之后，在水浴中冷却样品3到5分钟。

[0419] ·将样品转移到离心管中并以8,000g离心10分钟。

[0420] ·将上清液倒入25mL量筒中以测量体积。

[0421] ·上清液体积：a.2-1-13(在pH13下加热2分钟)：17.5mL

[0422] b.10-1-13(在pH13下加热10分钟)：17.0mL

[0423] c.20-1-13(在pH13下加热20分钟)：20.0mL

[0424] b.30-1-13(在pH13下加热30分钟)：19.0mL

[0425] e.2-13-1(在pH1下加热2分钟)：17.5mL

[0426] f.10-13-1(在pH1下加热10分钟)：19.0mL

[0427] g.20-13-1(在pH1下加热20分钟)：19.0mL

[0428] ·在-20℃下储存每一样品的团粒以供进一步分析

[0429] ·分析每一提取物的总碳水化合物、蛋白质及还原糖提取效率。

[0430] 实例14.1—使用微量劳里分析对从实例14获得的微波提取物进行的蛋白质提取效率分析

[0431] 材料

[0432] 微波提取物是来自实例14的样品2-1、10-1、20-1、30-1、2-1-13、10-1-13、20-1-13、2-13、10-13、20-13、2-13-1、10-13-1及20-13-1。

[0433] 使用总蛋白质试剂盒，微量劳里法的彼得森修改法(peterson's modification)，西格玛代码(Sigma code)：TP0300和L3540。

[0434] 程序

[0435] ·制备标准曲线：

[0436] 根据下表，在1.5mL离心管中，在水中稀释0.4mg/mL的BSA蛋白质标准溶液(一式三份)：

[0437]蛋白质标准溶液(mL) 水(mL) 蛋白质浓度(mg/mL)
0.05 0.35 0.05
0.1 0.3 0.1
0.2 0.2 0.2
0.3 0.1 0.3
0.4 0 0.4

[0438] 使用0.4mL MilliQ水作为空白

[0439] 向标准品和空白中添加0.4mL劳里试剂溶液。

[0440] 使溶液在室温下静置20分钟。

[0441] 在迅速并且即时的混合下，向每个管中添加0.2mL的福林-西奥卡图二氏酚试剂工作溶液(folin&ciocalteu's phenol reagent working solution)。

[0442] 显色30分钟。

[0443] 将0.3mL每一标准品和空白转移到96孔板中并在620nm下读取吸光度。

[0444] ·在1.5mL离心管中，制备由实验4中的微波提取工艺获得的每一样品的1:100稀释液，总体积为0.4mL。

[0445] 对于1:10稀释液：0.1mL样品+0.9mL MilliQ水

[0446] 对于1:100稀释液：0.04mL的10倍稀释的样品+0.36mL MilliQ水

[0447] ·使用0.4mL MilliQ水作为空白

[0448] ·向标准品和空白中添加0.4mL劳里试剂溶液。

[0449] ·使溶液在室温下静置20分钟。

[0450] ·在迅速并且即时的混合下，向每个管中添加0.2mL的福林-西奥卡图二氏酚试剂工作溶液。

[0451] ·显色30分钟。

[0452] ·将0.3mL每一标准品和空白转移到96孔板中并在620nm下读取吸光度。

[0453] ·根据标准品，可以计算出每一提取物的总蛋白质浓度；可以计算出所收集的还原糖的总量；可以计算出蛋白质提取效率。

[0454] 结果

[0455] 结果显示于图24中。结果显示，当第一次提取时使用碱性条件，总无灰分提取效率比当第一次提取时使用酸性条件的总提取效率低得多。当第一次提取时在酸性条件下提取20分钟总计从藻类生物质回收到约18％的有机物质。然而，当第一次提取时在碱性条件下提取20分钟总计仅从藻类生物质回收到约10％的有机物质。

[0456] 如图24中所示，无灰分蛋白质提取效率随着提取时间从2分钟延长到20分钟而明显增加，并且不仅第一次提取的效率增加，而且第二次提取的效率也增加。然而，在甚至更长的提取时间下，无灰分蛋白质提取效率略有降低，因为第一次酸性提取回收的蛋白质比在较短提取时间下的其它提取少得多。在此类较长加热时间、极低pH值条件及高提取温度下，蛋白质可能受损并且不稳定，以致无法通过蛋白质分析进行检测。

[0457] 实例14.2—使用DNS分析对从实例14获得的微波提取物进行的还原糖提取效率分析

[0458] 材料

[0459] 微波提取物是来自实例14的样品2-1、10-1、20-1、30-1、2-1-13、10-1-13、20-1-13、2-13、10-13、20-13、2-13-1、10-13-1及20-13-1。

[0460] 程序

[0461] ·制备标准曲线

[0462] 根据下表，在1.5mL离心管中，在水中稀释1mg/mL的葡萄糖储备液(一式三份)：

[0463]蛋白质标准溶液(mL) 水(mL) 葡萄糖浓度(mg/mL)
0.0 1.0 0.0
0.2 0.8 0.2
0.4 0.6 0.4
0.6 0.4 0.6
0.8 0.2 0.8
1.0 0.0 1.0

[0464] 使用MilliQ水作为空白。

[0465] 将0.1mL的每一标准溶液和空白转移到1.5mL离心管中。

[0466] 将所有标准品和空白加热到90℃。

[0467] 以30秒的时间间隔，添加0.05mL的0.5M KOH溶液和0.1mL的DNS试剂。

[0468] 在90℃下培育所有标准品和空白5分钟。

[0469] 在冰上冷却所有标准品和空白20分钟。

[0470] 向每一标准品和空白添加0.75mL的MilliQ水。

[0471] 在520nm下读取吸光度。

[0472] ·制备样品2-1、10-1、20-1、30-1、2-1-13、10-1-13、20-1-13、2-13、2-13-1、10-13-1及20-13-1的1:10稀释液。

[0473] 对于1:10稀释液：0.1mL样品+0.9mL MilliQ水

[0474] ·样品10-13、20-13不制备稀释液。

[0475] ·使用MilliQ水作为空白。

[0476] ·将0.1mL的每一标准溶液和空白转移到1.5mL离心管中。

[0477] ·将所有标准品和空白加热到90℃。

[0478] ·以30秒的时间间隔，添加0.05mL的0.5M KOH溶液和0.1mL的DNS试剂。

[0479] ·在90℃下培育所有标准品和空白5分钟。

[0480] ·在冰上冷却所有标准品和空白20分钟。

[0481] ·向每一标准品和空白添加0.75mL的MilliQ水。

[0482] ·在520nm下读取吸光度。

[0483] ·根据标准品，可以计算出每一提取物的总蛋白质浓度；可以计算出所收集的蛋白质的总量；可以计算出还原糖提取效率。

[0484] 结果

[0485] 结果显示于图25中。与蛋白质提取类似，当第一次提取时使用碱性条件，总无灰分提取效率比当第一次提取时使用酸性条件的总提取效率低得多。当第一次提取时在酸性条件下提取20分钟总计从藻类生物质回收到约11％的有机物质。然而，当第一次提取时在碱性条件下提取20分钟总计仅从藻类生物质回收到约5％的有机物质。如图25中所示，由于在碱性条件下还原糖的提取效率较低，故所提取的总无灰分还原糖实质上是由第一次酸性提取所贡献的。随着提取时间从2分钟延长到20分钟，无灰分还原糖提取效率明显增加。然而，在甚至更长的提取时间下，无灰分还原糖提取效率略有降低，因为第一次酸性提取回收的还原糖比在20分钟加热时间下的提取少得多。

[0486] 实例14.3—使用苯酚和硫酸分析对从实例14获得的微波提取物进行的总碳水化合物提取效率分析

[0487] 材料

[0488] 微波提取物是来自实例14的样品2-1、10-1、20-1、30-1、2-1-13、10-1-13、20-1-13、2-13、10-13、20-13、2-13-1、10-13-1及20-13-1。

[0489] 程序

[0490] 根据实例14.2中所述的方法，可以计算出每一提取物的总碳水化合物浓度；可以计算出所收集的碳水化合物的总量；可以计算出碳水化合物提取效率。

[0491] 结果

[0492] 结果显示于图26中。类似于由蛋白质和还原糖提取得到的结果，当第一次提取时使用碱性条件，总无灰分碳水化合物提取效率低于当第一次提取时使用酸性条件的总提取效率。当第一次提取时在酸性条件下提取20分钟总计从藻类生物质回收到约21％的有机物质。如图26中所示，由于在酸性条件下碳水化合物的提取效率较高，故所提取的总无灰分碳水化合物实质上也是由第一次酸性提取所贡献的。当第一次提取时使用碱性条件，提取到一些碳水化合物，但不如酸性条件那么多。随着提取时间从2分钟延长到20分钟，无灰分碳水化合物提取效率明显增加。然而，在甚至更长的提取时间下，无灰分碳水化合物提取效率略有降低，因为第一次酸性提取回收的还原糖比在20分钟加热时间下的提取少得多。蛋白质、还原糖及碳水化合物在不同提取时间和pH值条件下的提取效率不同。然而，如图24、25及26中所示，在酸性条件下第一次提取的20分钟提取显示出最高的蛋白质、还原糖及碳水化合物提取效率。在更长提取时间30分钟下，提取到较少蛋白质、还原糖及碳水化合物。在第一次提取时使用碱性条件及在第二次提取时使用酸性条件，除总碳水化合物外，蛋白质和还原糖提取效率均变低。因此，可以看出在酸性条件下进行第一次提取是有益的。这不仅使得回收到较多的碳水化合物，而且可能通过去除细胞壁的碳水化合物骨架而有助于增加蛋白质提取效率。

[0493] 实例15—通过使用第二次提取剩余的材料进行第三次提取来使无灰分蛋白质和碳水化合物提取效率最大。

[0494] 材料

[0495] 微波提取物是来自实例14的样品2-1-13、10-1-13及20-1-13。还使用了来自第二次微波提取的剩余材料。

[0496] 程序

[0497] ·根据第二次提取物的体积，向样品2-1-13、10-1-13及20-1-13的剩余材料中添加一定体积的0.5M NaOH溶液并充分混合。

[0498] ·使用5M H2SO4溶液将每一样品的pH值调到13。

[0499] ·在微波中，在以下条件下加工样品：

[0500] 在1000瓦特微波功率下照射每一样品，直到样品温度升到100℃

[0501] 在200W微波功率输入下，保持每一样品在100℃下加热2、10、20分钟。

[0502] ·在加工之后，在水浴中冷却样品3到5分钟。

[0503] ·将样品转移到离心管中并以8,000g离心10分钟。

[0504] ·将上清液倒入25mL量筒中以测量体积。

[0505] 上清液体积：a.2-1-13-13(在pH13下加热2分钟)：22.5mL

[0506] b.10-1-13-13(在pH13下加热10分钟)：19.0mL

[0507] c.20-1-13-13(在pH13下加热20分钟)：19.0mL

[0508] ·在-20℃下储存每一样品的团粒以供进一步分析

[0509] ·分析每一提取物的总碳水化合物和蛋白质提取效率。

[0510] 结果

[0511] 结果显示于图27、28及29中。使用第三次提取，总无灰分蛋白质提取效率从约17％的生物质有机物质增加到21％(图27)。然而，总无灰分碳水化合物提取效率未增加太多。此外，从在酸性条件下提取20分钟随后另外两次碱性提取所获得的总蛋白质和碳水化合物回收率(所回收的蛋白质或碳水化合物的克数/生物质中的实际蛋白质或碳水化合物的克数)较高(图28)。通过三次提取，收集到约70％蛋白质并且收集到约80％碳水化合物。此外，每次提取的选择性也良好。第一次酸性提取物主要含有碳水化合物和较少的蛋白质；第二次和第三次碱性提取物主要含有蛋白质和较少的碳水化合物。

[0512] 实例16—微波提取工艺的材料质量平衡分析和微波提取工艺的残留脂质分析[0513] 材料

[0514] 使用由实例15中第三次微波提取得到的剩余材料。

[0515] 程序

[0516] ·使用LN冷冻每一样品所有剩余材料(团粒)

[0517] ·使用冷冻干燥器将所有剩余材料冷冻干燥48小时

[0518] ·对每一干燥的团粒称重：

[0519] P2-1-13-13：1.13g

[0520] P10-1-13-13：1.15g

[0521] P20-1-13-13：0.76g

[0522] ·取0.1g每一样品以使用布莱与戴尔法分析脂质含量。

[0523] 结果

[0524] 结果显示于图30中。如图30中所示，利用不同提取时间进行的所有多次微波提取工艺显示出超过80％的材料回收率。在整个提取工艺中，仅15％到20％的生物质损失。在较长加热时间和较高的蛋白质与碳水化合物提取效率下，剩余材料的量也减少并且最终2分钟、10分钟及20分钟提取的总材料回收率彼此极为接近。

[0525] 由于在三次微波提取之后去除了大部分的蛋白质和碳水化合物，故预期在提取工艺期间观察到一些脂质释放。然而，很难测量释放到蛋白质或碳水化合物提取物中的脂质的量。为了确定在所述工艺期间脂质的损失量，对剩余材料内残留的脂质量进行测量。如图31中所示，最大脂质回收率为约83％，这是由利用10分钟加热时间进行的提取所获得的。最低脂质回收率为约43％，这是由利用20分钟加热时间进行的提取所获得的。在较长加热时间以及较高碳水化合物和蛋白质提取效率下，残留的脂质量应减少。在去除了碳水化合物之后，脂质应不再锁在细胞壁内，并且因此将更自由地可供释放到提取物中。然而，利用2分钟加热时间的提取工艺显示出的残留脂质少于利用10分钟加热时间的提取工艺，但仍高于利用20分钟加热时间的提取工艺。

[0526] 实例17—在pH0.5、2、11及14下的微波pH值条件优化

[0527] 材料

[0528] 冷冻的湿藻类生物质是于2011年6月15日从SARDI接收的。

[0529] 程序

[0530] ·准确地称取4×10g的湿生物质并将其放入50mL平底烧瓶中。

[0531] 每一样品的实际重量：a.0.5a(在pH0.5下加热20分钟)：10.0357g

[0532] b.0.5b(在pH0.5下加热20分钟)：10.0427g

[0533] c.2a(在pH2下加热20分钟)：9.8774g

[0534] d.2b(在pH2下加热20分钟)：9.54475g

[0535] ·将18.6mL的0.5M H2SO4溶液添加到样品0.5a、0.5b、2a及2b中并充分混合(固体与液体比率将为1:10)。

[0536] ·使用5M H2SO4溶液将样品0.5a和0.5b的pH值调到0.5。

[0537] ·使用10M KOH溶液将样品2a和2b的pH值调到2。

[0538] ·在微波中，在以下条件下加工样品：

[0539] 在1000瓦特微波功率下照射每一样品，直到样品温度升到100℃

[0540] 在200W微波功率输入下，保持每一样品在100℃下加热2、10、20、30分钟。

[0541] ·在加工之后，在水浴中冷却样品3到5分钟。

[0542] ·将样品转移到离心管中并以8,000g离心10分钟。

[0543] ·将上清液倒入25mL量筒中以测量体积。

[0544] 上清液体积：a.0.5a(在pH0.5下加热20分钟)：20mL

[0545] b.0.5b(在pH0.5下加热20分钟)：17.5mL

[0546] c.2a(在pH2下加热20分钟)：19mL

[0547] d.2b(在pH2下加热20分钟)：19mL

[0548] ·根据去除的上清液的体积，将样品0.5a、0.5b、2a及2b各自的团粒再悬浮于0.5M NaOH溶液中。

[0549] ·使用5M H2SO4溶液将样品0.5a和2a的pH值调到11。

[0550] ·使用10M KOH溶液将样品0.5b和2b的pH值调到14。

[0551] ·在微波中，在以下条件下加工样品作为第二次提取：

[0552] 在1000瓦特微波功率下照射每一样品，直到样品温度升到100℃

[0553] 在200W微波功率输入下，保持每一样品在100℃下加热2、10、20、30分钟。

[0554] ·在加工之后，在水浴中冷却样品3到5分钟。

[0555] ·将样品转移到离心管中并以8,000g离心10分钟。

[0556] ·将上清液倒入25mL量筒中以测量体积。

[0557] 上清液体积：a.0.5a-11(在pH11下加热20分钟)：20mL

[0558] b.0.5b-14(在pH14下加热20分钟)：17.5mL

[0559] c.2a-11(在pH11下加热20分钟)：19mL

[0560] d.2b-14(在pH14下加热20分钟)：19mL

[0561] ·在-20℃下储存每一样品的团粒以供进一步分析

[0562] ·分析每一提取物的总碳水化合物、蛋白质及还原糖提取效率。

[0563] 结果

[0564] 为了比较先前实验中所使用的pH条件1和13，对较低和较高pH值进行研究。此外，根据先前的结果，选定20分钟加热时间作为最佳的加热时间。因此，提取pH值的优化是基于20分钟的加热时间。对于碳水化合物提取，在较低pH值(pH0.5)下，提取效率高于在pH2下的提取效率。然而，其还是低于先前研究中在pH1下的提取效率。在pH0.5和14下的提取得到最高的总碳水化合物提取效率。,

[0565] 对于蛋白质提取，在pH2和11下提取显示最低的提取效率。此外，在pH2和14下提取因在pH14下进行的第二次碱性提取而显示出高得多的提取效率。然而，先前研究中在pH1和13下进行的提取仍显示最高的蛋白质提取效率，即使是与在pH0.5和14的更强条件下进行的提取相比较。

[0566] 对于还原糖的提取，在pH2和11下提取及在pH2和14下提取显示最低的提取效率。这表明，超过某一pH值，将很难提取还原糖。此外，在pH11和14下，所提取的还原糖的量较低。最高的还原糖提取效率是从在pH0.5和14下进行的提取获得。

[0567] 就碳水化合物和蛋白质的回收率来说，截至目前所获得的最高蛋白质仍是从先前研究中在pH1和13下进行的提取得到。然而，根据在pH0.5和11下进行的提取，总碳水化合物回收率高于90％。

[0568] 实例18—加热方法的比较

[0569] 材料

[0570] 冷冻的湿藻类生物质是于2011年6月15日从SARDI接收的。

[0571] 程序

[0572] 使用先前实例的程序，在pH1(第一次提取)、pH13(第二次提取)及pH13(第三次提取)下提取样品。然而，研究三种不同的加热方法，即，在热板上加热20分钟、在高压釜中加热20分钟及在微波烘箱中加热20分钟。

[0573] 接着，使用先前陈述的程序测定无灰分蛋白质、无灰分碳水化合物及还原糖提取效率。

[0574] 结果

[0575] 结果显示于表5、6及7以及图36、37及38中。

[0576] 表5—无灰分蛋白质的提取效率

[0577]

[0578] 表6—无灰分总碳水化合物的提取效率

[0579]

[0580] 表7—还原糖的提取效率

[0581]提取方法 提取1(mg)
在pH1和pH13及pH13下热板加热20分钟 6.14
在pH1和pH13及pH13下高压釜加热20分钟 18.63
在pH1和pH13及pH13下微波加热20分钟 9.09

[0582] 在每一情形中，在热板上加热引起的提取效率低于在高压釜或微波烘箱中进行的加热。

[0583] 实例19—在较低温度和较长时间下微波温度和时间条件的优化

[0584] 材料

[0585] 冷冻的湿藻类生物质是于2011年6月15日从SARDI接收的。

[0586] 程序

[0587] ·准确地称取4×10g的湿生物质并将其放入50mL平底烧瓶中。

[0588] 每一样品的实际重量：a.60a(在pH1下在60℃下加热20分钟)：10.5987g[0589] b.60b(在pH1下在60℃下加热60分钟)：10.1785g

[0590] c.80a(在pH1下在80℃下加热20分钟)：10.5544g

[0591] d.80b(在pH1下在80℃下加热60分钟)：10.2584g

[0592] ·将18.6mL的0.5M H2SO4溶液添加到样品60a、60b、80a及80b中并充分混合(固体与液体比率将为1:10)。

[0593] ·使用5M H2SO4溶液将每一样品的pH值调到1。

[0594] ·在微波中，在以下条件下加工样品：

[0595] 在1000瓦特微波功率下照射样品60a，直到样品温度升到60℃并在200W微波功率输入下保持加热20分钟。

[0596] 在1000瓦特微波功率下照射样品60b，直到样品温度升到60℃并在200W微波功率输入下保持加热60分钟。

[0597] 在1000瓦特微波功率下照射样品80a，直到样品温度升到80℃并在200W微波功率输入下保持加热20分钟。

[0598] 在1000瓦特微波功率下照射样品80b，直到样品温度升到80℃并在200W微波功率输入下保持加热60分钟。

[0599] ·在加工之后，在水浴中冷却样品3到5分钟。

[0600] ·将样品转移到离心管中并以8,000g离心10分钟。

[0601] ·将上清液作为第一次提取物倒入25mL量筒中以测量体积。

[0602] 上清液体积：a.60a(在pH1下在60℃下加热20分钟)：20mL

[0603] b.60b(在pH1下在60℃下加热60分钟)：19mL

[0604] c.80a(在pH1下在80℃下加热20分钟)：20mL

[0605] d.80b(在pH1下在80℃下加热60分钟)：20mL

[0606] ·根据去除的上清液的体积，将样品60a、60b、80a及80b各自的团粒再悬浮于0.5M NaOH溶液中。

[0607] ·使用5M H2SO4溶液将每一样品的pH值调到13。

[0608] ·在微波中，在以下条件下加工样品作为第二次提取：

[0609] 在1000瓦特微波功率下照射样品60a，直到样品温度升到60℃并在200W微波功率输入下保持加热20分钟。

[0610] 在1000瓦特微波功率下照射样品60b，直到样品温度升到60℃并在200W微波功率输入下保持加热60分钟。

[0611] 在1000瓦特微波功率下照射样品80a，直到样品温度升到80℃并在200W微波功率输入下保持加热20分钟。

[0612] 在1000瓦特微波功率下照射样品80a，直到样品温度升到80℃并在200W微波功率输入下保持加热60分钟。

[0613] ·在加工之后，在水浴中冷却样品3到5分钟。

[0614] ·将样品转移到离心管中并以8,000g离心10分钟。

[0615] ·将上清液作为第二次提取物倒入25mL量筒中以测量体积。

[0616] 上清液体积：a.60a(在pH13下在60℃下加热20分钟)：21mL

[0617] b.60b(在pH13下在60℃下加热60分钟)：19mL

[0618] c.80a(在pH13下在80℃下加热20分钟)：20mL

[0619] d.80b(在pH13下在80℃下加热60分钟)：21mL

[0620] ·根据去除的上清液的体积，将样品60a、60b、80a及80b各自的团粒再悬浮于0.5M NaOH溶液中。

[0621] ·使用5M H2SO4溶液将每一样品的pH值调到13。

[0622] ·在微波中，在以下条件下加工样品作为第二次提取：

[0623] 在1000瓦特微波功率下照射样品60a，直到样品温度升到60℃并在200W微波功率输入下保持加热20分钟。

[0624] 在1000瓦特微波功率下照射样品60b，直到样品温度升到60℃并在200W微波功率输入下保持加热60分钟。

[0625] 在1000瓦特微波功率下照射样品80a，直到样品温度升到80℃并在200W微波功率输入下保持加热20分钟。

[0626] 在1000瓦特微波功率下照射样品80a，直到样品温度升到80℃并在200W微波功率输入下保持加热60分钟。

[0627] ·在加工之后，在水浴中冷却样品3到5分钟。

[0628] ·将样品转移到离心管中并以8,000g离心10分钟。

[0629] ·将上清液作为第三次提取物倒入25mL量筒中以测量体积。

[0630] 上清液体积：a.60a(在pH13下在60℃下加热20分钟)：20mL

[0631] b.60b(在pH13下在60℃下加热60分钟)：19mL

[0632] c.80a(在pH13下在80℃下加热20分钟)：20mL

[0633] d.80b(在pH13下在80℃下加热60分钟)：20mL

[0634] ·在-20℃下储存每一样品的团粒以供进一步分析

[0635] ·分析每一提取物的总碳水化合物、蛋白质及还原糖提取效率。

[0636] 结果

[0637] 如图39中所示，利用20分钟提取时间，在较低提取温度60℃和80℃下的无灰分蛋白质提取显示出类似的效率，均总计占生物质总重量的约15％。与在100℃下20分钟的提取相比较，在较低温度下的无灰分蛋白质提取效率较低。此外，在60分钟的较长提取时间下，在较低提取温度60℃下的无灰分蛋白质提取仍显示与在60℃下由20分钟提取获得的结果类似的提取效率。在80℃和60分钟提取时间下的无灰分蛋白质提取显示比在80℃下由20分钟提取所获得的结果低得多的效率。因此，通过增加提取时间及降低提取温度，无灰分蛋白质提取效率未得到改善。

[0638] 如图40中所示，利用20分钟和60分钟提取时间，在较低提取温度60℃和80℃下的无灰分总碳水化合物提取显示出类似的效率，均总计占生物质总重量的约2％。与在100℃下20分钟的提取相比较，在较低温度下的无灰分蛋白质提取效率要低得多。很明显，在较低温度下的第一次酸性提取显示较低的提取效率。因此，通过增加提取时间及降低提取温度，无灰分总碳水化合物提取效率未得到改善。

[0639] 基于在不同提取温度和时间下的功率消耗来计算蛋白质和总碳水化合物提取的生产率，并且结果显示于图41中。基于在较低提取温度及较长提取时间下的功率消耗的总碳水化合物提取的生产率由于总碳水化合物提取产率较低而比优化的条件低得多。此外，通过降低提取温度及增加提取时间，基于功率消耗的总计蛋白质提取的生产率仍未得到改善。

[0640] 实例20—功率消耗估算以及总蛋白质和碳水化合物生产率

[0641] 对如本文中所描述的使用湿微藻生物质、微波提取单元以及100℃的提取温度、20分钟的提取时间、pH1和13以及进行三次重复提取的工艺的功率消耗进行估算。计算显示，功率消耗主要归于离心机，而非微波。在离心期间消耗的功率占微波提取工艺总功率消耗的约90％。图42显示，微波提取2、10、20及30分钟的总功率消耗彼此相当接近。然而，微波加热工艺的功率消耗比常规热板加热工艺低得多。

[0642] 此外，基于在不同提取条件下的功率消耗来计算总蛋白质和碳水化合物的生产率，并且结果显示于图43和44中。

[0643] 本领域技术人员应理解，在不背离如概括地描述的本发明的精神或范围的情况下，可以对如在具体实施例中所示的本发明进行多种变更和/或修改。因此，本发明的实施例应在所有方面视为说明性而非限制性的。

[0644] 在本说明书通篇，“包含(comprise)”一词，或例如“包含了(comprises)”或“包含着(comprising)”等变化形式应理解为暗示包括所陈述的成分、整数或步骤，或者成分、整数或步骤的群组在内，但不排除任何其它成分、整数或步骤，或者成分、整数或步骤的群组。