一种木薯多倍体的诱导方法

摘要

本发明公开了一种木薯多倍体的诱导方法，属于农业繁殖方法领域。该方法包括以下步骤：（1）取无菌木薯组培苗作为多倍体诱导的基础材料；（2）木薯多倍体的诱导；（3）倍性嵌合体分离；（4）多倍体材料倍性鉴定；（5）对木薯多倍体纯系材料扩繁、壮苗生根及移栽成活。本发明克服了传统木薯多倍体诱导周期长、诱导效率低、预见性差等问题，可通过在组培条件下连续多次继代培养快速分离倍性嵌合体，大大缩短倍性嵌合体分离时间，流式细胞仪快速准确鉴定多倍体，提高了木薯多倍体育种效率，具有诱导周期短、诱导效率高、可预见性强等特点。

权利要求

1.一种木薯多倍体的诱导方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)取无菌木薯组培苗作为多倍体诱导的基础材料；

(2)木薯多倍体的诱导：剪切木薯组培苗成2～3cm长单芽茎段，转接到预先配置并灭菌好的培养基A中，再将盛装培养基A的三角瓶置入恒温摇床中，在1000～2000r/min条件下黑暗震荡培养36～48h，培养温度为27±1℃，其中所述培养基A为MS+0.075～0.1mg/L秋水仙素的液体培养基，pH＝5.8；

(3)倍性嵌合体分离：剪取上述培养基处理后2～3cm长的单芽茎段，转入配方为MS+

0.01～0.02mg/L BA+0.01～0.02mg/L NAA+30g/L蔗糖的半固体培养基上培养，培养基pH＝

5.8，培养周期为40d，进行4～6次的连续继代培养，对倍性嵌合体进行分离；

(4)多倍体材料倍性鉴定：剪取上述经过4～6次的连续继代培养获得的组培苗的整株叶片，采用流式细胞仪进行倍性鉴定，鉴定筛选出多倍体纯系材料；

(5)对木薯多倍体纯系材料扩繁、壮苗生根及移栽成活。

2.如权利要求1所述的一种木薯多倍体的诱导方法，其特征在于：所述步骤(3)中培养条件为27±1℃的培养温度，1500～2000lx的光照强度，12h/d光照时间。

3.如权利要求1所述的一种木薯多倍体的诱导方法，其特征在于：步骤(5)中所述木薯多倍体纯系材料扩繁、壮苗生根及移栽成活：将多倍体纯系材料通过继代增殖培养进行扩繁，再将继代增殖培养后的材料处理后进行壮苗生根培养，生根培养30d后，从培养室移入温室大棚炼苗7～10d，然后取出炼苗后的组培苗并洗净，移栽至栽培基质中，移栽7～10d内通风保湿，并在移栽30d后统计移栽成活率。

说明书

一种木薯多倍体的诱导方法

技术领域

[0001] 本发明涉及农业繁殖方法领域，具体为木薯的繁殖方法领域，尤其涉及一种木薯多倍体的诱导方法。

背景技术

[0002] 木薯(Manihot esculenta Crantz)又名树薯，树番薯，木番薯，是大戟科(Euphorbiaceae)木薯属(Manihot)植物，是三大薯类作物之一，是全球第六大粮食作物，热区第三大粮食作物，可食用、饲用和工业用，在我国具有巨大的市场开发空间。

[0003] 生产上高产稳产木薯品种缺乏、单产低比较经济效益低、加工原料短缺已成为制约我国木薯产业发展的主要因素，高产稳产木薯品种选育显得尤为必要。由于木薯是一种高度杂合的作物，这种杂合性造成F1代分离严重，变异范围大。用传统的育种方法来进行品种选育，育种周期长、效率低、预见性差。多倍体育种为木薯品种选育提供了一个重要途径。秋水仙素诱导多倍体是木薯多倍体诱导的主要技术方法之一。

[0004] 尽管国内外在大田或离体培养条件下开展了一些秋水仙素诱导木薯多倍体的技术研究，但是秋水仙素诱导木薯多倍体与诱变处理方法、倍性嵌合体分离、多倍体鉴定等有关，通常存在倍性嵌合体分离时间长、获得多倍体纯系育种周期长(大田条件下通常需要2～4年分离嵌合体)、多倍体诱导效率低等问题。因此，需要建立一套简单高效的秋水仙素诱导木薯多倍体的技术方法，以提高木薯育种效率。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于：针对上述存在的问题，提供一种木薯多倍体的诱导方法，克服传统木薯育种周期长、效率低、预见性差等问题，获得多倍体纯系育种周期短、多倍体诱导效率高，以提高木薯多倍体育种效率。

[0006] 本发明采用的技术方案为：

[0007] 一种木薯多倍体的诱导方法包括以下步骤：

[0008] (1)取无菌木薯组培苗作为多倍体诱导的基础材料；

[0009] (2)木薯多倍体的诱导：剪切木薯组培苗成2～3cm长单芽茎段，转接到预先配置并灭菌好的培养基A中，再将盛装培养基A的三角瓶置入恒温摇床中，在1000～2000r/min条件下黑暗震荡培养36～48h，培养温度为27±1℃，其中所述培养基A为MS+0.075～0.1mg/L秋水仙素的液体培养基，pH＝5.8；

[0010] (3)倍性嵌合体分离：剪取上述培养基处理后2～3cm长的单芽茎段，转入配方为MS+0.01～0.02mg/L BA+0.01～0.02mg/L NAA+30g/L蔗糖的半固体培养基上培养，培养基pH＝5.8，培养周期为40d，进行4～6次的连续继代培养，对倍性嵌合体进行分离；

[0011] (4)多倍体材料倍性鉴定：剪取上述经过4～6次继代培养获得的组培苗的整株叶片，采用流式细胞仪进行倍性鉴定，鉴定筛选出多倍体纯系材料；

[0012] (5)对木薯多倍体纯系材料扩繁、壮苗生根及移栽成活。

[0013] 进一步地，所述步骤(3)中培养条件为27±1℃的培养温度，1500～2000lx的光照强度，12h/d光照时间。

[0014] 作为本发明的优选方案，步骤(5)中所述木薯多倍体纯系材料扩繁、壮苗生根及移栽成活：将多倍体纯系材料通过继代增殖培养进行扩繁，再将继代增殖培养后的材料处理后进行壮苗生根培养，生根培养30d后，从培养室移入温室大棚炼苗7～10d，然后取出炼苗后的组培苗并洗净，移栽至栽培基质中，移栽7～10d内通风保湿，并在移栽30d后统计移栽成活率。

[0015] 本发明木薯多倍体纯系材料扩繁、壮苗生根及移栽成活具体步骤如下：将多倍体纯系植株成剪成2～3cm长单芽茎段，转入MS+0.01～0.02mg/L BA+0.01～0.02mg/L NAA+30g/L蔗糖的半固体培养基(pH＝5.8)进行继代培养，培养温度为27±1℃，光照强度为1500～2000lx，光照时间为12h/d，培养周期为40d。再将继代培养后材料剪成2～3cm长单芽茎段，转入MS(或1/2MS)+0.01～0.02mg/L NAA+40～50g/L蔗糖的半固体培养基(pH＝5.8)进行壮苗生根培养，培养温度为27±1℃，光照强度为1500～2000lx，光照时间为12h/d，生根培养30d后，从培养室移入温室大棚炼苗7～10d，然后取出炼苗后的组培苗并洗净，移栽至栽培基质中，移栽7～10d内要控温通风保湿。

[0016] 综上所述，本发明的有益效果是：与现有技术现比，采用本发明的木薯多倍体诱导方法，可通过在组培条件下连续多次继代培养快速分离倍性嵌合体，在大田条件下通常需要2～3年分离倍性嵌合体，而本方案可在1年内完全分离倍性嵌合体，大大缩短倍性嵌合体分离时间，且采用流式细胞仪快速鉴定多倍体效率高，也可以提高木薯多倍体育种效率。

具体实施方式

[0017] 下面结合具体实施方式对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。

[0018] 实施例1

[0019] 木薯多倍体的诱导方法，包括以下步骤：

[0020] (1)取无菌木薯组培苗作为多倍体诱导的基础材料；

[0021] (2)木薯多倍体的诱导：剪切木薯组培苗成2cm长单芽茎段，转接到预先配置并灭菌好的培养基A中，再将盛装培养基A的三角瓶置入恒温摇床中，在1500r/min条件下黑暗震荡培养48h，培养温度为27±1℃，其中所述培养基A为MS+0.075mg/L秋水仙素的液体培养基，pH＝5.8；

[0022] (3)倍性嵌合体分离：剪取上述培养基处理后2～3cm长的单芽茎段，转入配方为MS+0.01mg/L BA+0.01mg/L NAA+30g/L蔗糖的半固体培养基上培养，培养基pH＝5.8，培养条件为27±1℃的培养温度，1500lx的光照强度，12h/d光照时间，40d的培养周期，进行5次的连续继代培养，对倍性嵌合体进行分离；

[0023] (4)多倍体材料倍性鉴定：剪取上述经过4～6次继代培养获得的组培苗的整株叶片，采用流式细胞仪进行倍性鉴定，鉴定筛选出多倍体纯系材料；

[0024] (5)对木薯多倍体纯系材料扩繁、壮苗生根及移栽成活：将多倍体纯系材料通过继代增殖培养进行扩繁，再将继代增殖培养后的材料处理后进行壮苗生根培养，生根培养30d后，从培养室移入温室大棚炼苗7d，然后取出炼苗后的组培苗并洗净，移栽至栽培基质中，移栽7内通风保湿，并在移栽30d后统计移栽成活率。

[0025] 实施例2

[0026] 本实施例2与实施例1不同之处在于：步骤(2)中木薯多倍体诱导，培养基A的配方为MS+0.08mg/L秋水仙素的液体培养基，其他步骤及条件不变。

[0027] 实施例3

[0028] 本实施例3与实施例1不同之处在于：步骤(2)中木薯多倍体诱导，培养基A的配方为MS+0.1mg/L秋水仙素的液体培养基，其他步骤及条件不变。

[0029] 实施例4

[0030] 本实施例4与实施例1～3不同之处在于：步骤(2)中木薯多倍体诱导，在1500r/min条件下黑暗震荡培养36h，其他步骤及条件不变。

[0031] 实施例5

[0032] 本实施例5与实施例1～4不同之处在于：步骤(2)中木薯多倍体诱导，在1500r/min条件下黑暗震荡培养42h，其他步骤及条件不变。

[0033] 实施例6

[0034] 本实施例6与实施例1～5不同之处在于：步骤(3)木薯倍性嵌合体分离，将培养后的单芽茎段，转入配方为MS+0.01mg/L BA+0.01mg/L NAA+30g/L蔗糖的半固体培养基(pH＝5.8)上培养进行4次的继代培养，对倍性嵌合体分离进行分离，其他步骤及条件不变。

[0035] 实施例7

[0036] 本实施例7与实施例1～6不同之处在于：步骤(3)木薯倍性嵌合体分离，将培养后的单芽茎段，转入配方为MS+0.01mg/L BA+0.01mg/L NAA+30g/L蔗糖的半固体培养基(pH＝5.8)上培养进行6次的继代培养，对倍性嵌合体分离进行分离，其他步骤及条件不变。

[0037] 实施例8

[0038] 本实施例8与实施例1～7不同之处在于：步骤(3)木薯倍性嵌合体分离，将培养后的单芽茎段，转入配方为MS+0.02mg/L BA+0.01mg/L NAA+30g/L蔗糖的半固体培养基(pH＝5.8)上，对倍性嵌合体分离进行分离，其他步骤及条件不变。

[0039] 实施例9

[0040] 本实施例9与实施例1～8不同之处在于：步骤(3)木薯倍性嵌合体分离，将培养后的单芽茎段，转入配方为MS+0.02mg/L BA+0.02mg/L NAA+30g/L蔗糖的半固体培养基(pH＝5.8)上，对倍性嵌合体分离进行分离，其他步骤及条件不变。

[0041] 实施例10

[0042] 本实施例10与实施例1～9不同之处在于：步骤(3)木薯倍性嵌合体分离，将培养后的单芽茎段，转入配方为MS+0.02mg/L BA+0.01mg/L NAA+30g/L蔗糖的半固体培养基(pH＝5.8)上，对倍性嵌合体分离进行分离，其他步骤及条件不变。

[0043] 为了更好的本发明木薯多倍体的诱导效果，进行以下试验：

[0044] 一、不同浓度的秋水仙素对木薯多倍体诱导效果的影响

[0045] 1、实验组处理

[0046] 以实施例1～3的方法对单芽茎段进行多倍体诱导，分别作为实验组1、实验组2、实验组3。

[0047] 2、对照组处理

[0048] 对照组1：选用的多倍体诱导培养基为MS+0.05mg/L秋水仙素的液体培养基(pH＝5.8)，对照组2：选用的多倍体诱导培养基为MS+0.15mg/L秋水仙素的液体培养基(pH＝
5.8)；其它其他步骤及条件与实施例一样。

[0049] 3、试验方法：以上每个处理设3个重复，每个重复30个单芽茎段外植体。单芽茎段继代培养30d后统计组培苗成活率。

[0050] 4、试验结果

[0051] 试验结果见表1。与实验组1～3对比，对照组1中秋水仙素使用浓度低于0.075mg/L时，处理茎段成活率高达73.3％，明显增加了后期多倍体鉴定群体数量，多倍体诱导效率明显降低；对照组2培养基中秋水仙素的浓度＞0.1mg/L，与实验组1～3对比，处理茎段死亡率高，存活率只有6.7％，多倍体诱导效率降低。

[0052] 表1 不同浓度的秋水仙素对木薯多倍体诱导效果的影响

[0053]

[0054] 二、不同继代次数对木薯多倍体诱导效率的影响

[0055] 1、实验组处理

[0056] 以实施例1、实施例6、实施例7分别作为实验组1、实验组2、实验组3。

[0057] 2、对照组处理

[0058] 对照组1：步骤(3)木薯倍性嵌合体分离，将培养后的单芽茎段，转入配方为MS+0.01mg/L BA+0.01mg/L NAA+30g/L蔗糖的半固体培养基(pH＝5.8)上培养进行3次的继代培养，对倍性嵌合体分离进行分离，其他步骤及条件与实施例1一样。