米尔贝霉素类似物、其制备方法和应用

摘要

本发明涉及两个新的米尔贝霉素(milbemycin)类似物，即化合物1和化合物2。所述两个新的米尔贝霉素类似物比现有产业化的米尔贝霉素A3∕A4具有更强的杀虫活性，对小菜蛾、蚜虫及红蜘蛛都有很好的防治作用。本发明还涉及化合物1和化合物2的制备方法，包括如下步骤：发酵培养阿维链霉菌Streptomyces avermitilis strain NEAU1069，得到含有化合物1和化合物2的发酵液，然后从发酵液中分离得到化合物1和化合物2。本发明还涉及含有化合物1和/或化合物2的农药组合物，以及化合物1和/或化合物2在制备用于防治农作物病虫害的农药组合物中的用途。

权利要求

1.一种具有如下结构式的化合物：

其中，

X-----Y-----Z为CH＝C-CH3，其为如下结构式的化合物1：或者

X-----Y-----Z为CH2-C＝CH2，其为如下结构式的化合物2：

2.一种制备权利要求1所述的化合物1和化合物2的方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：(1)将保藏编号为CGMCC NO.2946的阿维链霉菌Streptomyces avermitilis strain NEAU1069在培养基中进行发酵培养，得到含有化合物1和化合物2的发酵液；和(2)从步骤(1)所得发酵液中分离出化合物1和化合物2。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述培养基含有以下组分：玉米淀粉10-20％(W/W)，淀粉酶0.001-0.005％(W/W)，黄豆饼粉1-5％(W/W)，酵母粉0.5-2％(W/W)。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括：将步骤(1)所得发酵液经预处理后得到粗提物，粗提物进行硅胶柱层析，分别得到含有化合物1的流分和含有化合物2的流分。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：将含有化合物1的流分和含有化合物2的流分进行反相制备柱层析，用含有水和有机溶剂的洗脱液进行洗脱，分别得到化合物1和化合物2。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述反相制备柱层析的填料为C18反相填料。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂选自甲醇、乙腈、丙酮或它们的任意比混合溶剂。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂选自甲醇和乙腈的混合溶剂。

9.一种药物组合物，含有权利要求1所述的化合物1和/或化合物2，以及一种或者多种常规载体和/或稀释剂。

10.权利要求1所述的化合物1和/或化合物2在制备用于防治农作物病虫害药物中的用途。

11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述农作物病虫害包括小菜蛾、蚜虫和红蜘蛛。

说明书

米尔贝霉素类似物、其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及两种新的米尔贝霉素类似物，即化合物1和化合物2，其制备方法以及作为杀虫剂在防治农作物病虫害中的应用。

背景技术

[0002] 米尔贝霉素是由日本科学家首先从土壤放线菌Streptomyces hygroscopicus subsp.aureolacrimosus发酵培养液中分离得到的十六元大环内酯类化合物。美国专利US3,950,360首次公开了米尔贝霉素A3和A4，其结构式如下所示：

[0003]

[0004] 米尔贝霉素与目前最广泛使用的生物农药阿维菌素比较，用量相当，但米尔贝霉素安全性更高，安全剂量范围更大(张宝新等，世界农药，2009，31，11-12)。

[0005] 2002年，美国EPA认定米贝尔霉素A3/A4是在草莓、西瓜、桃、梨、茄子、家庭观赏植物等中使用最安全的农药之一，日本、台湾还登记用于茶叶。2006年，米尔贝霉素A3/A4半合成的新化合物Lepimectin也已登记用于防治蔬菜、水果害虫。相对于米贝尔霉素主要用于防治螨、蚜虫、蓟马、卷叶螟等，Lepimectin对鳞翅目、同翅目害虫都具有很高的杀虫活性。米尔贝霉素类抗生素由于其高效的杀虫能力和低毒特性，其越来越受到国内外科学家的重视。因此，开发用量少、超高效、极低毒性、安全可靠、易降解、无环境污染的米尔贝霉素类驱虫药具有极具重要的现实意义。

[0006] 根据专利CN200910071629.4公开的信息，菌株Streptomyces avermitilis strain NEAU1069在发酵过程中添加环己烷基羧酸可以产生多拉菌素类抗生素。除此之外，该菌还具有产米尔贝霉素类化合物的能力(Wang Ming,et al.The Journal of Antibiotics,2009,62,587–591.)但上述研究均未发现本专利所要保护的米尔贝霉素类化合物。

[0007] 本发明主要涉及由Streptomyces avermitilis strain NEAU1069得到的新的米尔贝霉素类化合物，及它们的制备方法和应用。

发明内容

[0008] 本发明提供了一种具有如下结构式的化合物：

[0009]

[0010] 其中，

[0011] X-----Y-----Z为CH＝C-CH3，其为如下结构式的化合物1：

[0012]

[0013] 或者

[0014] X-----Y-----Z为CH2-C＝CH2，其为如下结构式的化合物2：

[0015]

[0016] 本发明还提供了一种制备如前所述的化合物1和化合物2的方法，包括如下步骤：

[0017] (1)将保藏编号为CGMCC NO.2946的阿维链霉菌Streptomyces avermitilis strain NEAU1069在培养基中进行发酵培养，得到含有化合物1和化合物2的发酵液；和[0018] (2)从步骤(1)所得发酵液中分离出化合物1和化合物2。

[0019] 其中，步骤(1)所述培养基含有以下组分：玉米淀粉10-20％(W/W)，淀粉酶0.001-0.005％(W/W)，黄豆饼粉1-5％(W/W)，酵母粉0.5-2％(W/W)。在一个具体实施例中，将阿维链霉菌Streptomyces avermitilis strain NEAU1069在pH7.2-7.4，28℃下，在发酵培养基中培养6-10天，得到含有化合物1和化合物2的发酵液，所述发酵培养基包括玉米淀粉10-20％(W/W)，淀粉酶0.001-0.005％(W/W)，黄豆饼粉1-5％(W/W)，酵母粉0.5-2％(W/W)，沸石粉0.1-0.5％(W/W)，MnSO40.001-0.005％(W/W)，Na2MoO40.001-0.005％(W/W)，CoCl2·6H2O0.001-0.005％(W/W)。

[0020] 其中，在步骤(1)之前，还包括种子培养的步骤。在一个具体实施例中，将阿维链霉菌Streptomyces avermitilis strain NEAU1069单菌落接种于种子培养基中，于pH7.2-7.4，28℃，250rpm下培养30-50小时，得到种子培养液，其中种子培养基含有：玉米淀粉1-5％(W/W)，黄豆饼粉0.5-2％(W/W)，花生饼粉0.5-2％(W/W)，酵母粉0.5-2％(W/W)，CoCl20.001-0.005％(W/W)。

[0021] 其中，步骤(2)包括：将步骤(1)所得发酵液经预处理后得到粗提物，粗提物进行硅胶柱层析分别得到含有化合物1的流分和含有化合物2的流分。接着，将含有化合物1的流分和含有化合物2的流分进行反相制备柱层析，用含有水和有机溶剂的洗脱液进行洗脱，分别得到化合物1和化合物2。

[0022] 其中，硅胶柱层析采用石油醚：丙酮＝90-75/10-25(v/v)的混合溶剂进行洗脱，优选石油醚：丙酮＝80/20(v/v)洗脱，分别得到含有化合物1的流分和含有化合物2的流分。

[0023] 其中，所述反相制备柱的填料为C18反相填料。

[0024] 其中，所述反相制备柱层析洗脱液中有机溶剂选自甲醇、乙腈、丙酮或它们的任意比混合溶剂，优选甲醇和乙腈的混合溶剂。优选的，用于纯化化合物1的反相制备柱层析的洗脱液为甲醇/乙腈/水(10-80/5-65/15-25)三者组成100的混合液；用于纯化化合物2的反相制备柱层析的洗脱液为甲醇/乙腈/水(10-80/10-75/5-10)三者组成100的混合液。

[0025] 所述的预处理方法可以采用本领域技术人员熟知的一些常规技术手段来处理，非限制性的，本发明所述的预处理可以采用如下步骤进行：过滤发酵液中的菌丝体，用甲醇浸泡，然后浓缩甲醇浸泡液，用乙酸乙酯萃取浓缩液，将乙酸乙酯相浓缩至干得到油状的粗提物。

[0026] 本发明使用的阿维链霉菌Streptomyces avermitilis strain NEAU1069已于2009年03月11日保藏于“中国生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏登记号为：
CGMCCNO.2943，命名为NEAU1069(Streptomyces avermitilis)。

[0027] 本发明进一步提供了如前所述的化合物1和化合物2的结构确认。分离得到的化合物1和化合物2，经过广泛的波谱研究分别确证了它们的结构。

[0028] 化合物鉴定涉及仪器如下：

[0029] 核磁谱采用Bruker公司的超导核磁共振仪(Bruker DRX-400)测定；

[0030] 质谱及高分辨质谱采用Waters公司的Q-TOF Micro LC-MS-MS质谱仪测定；

[0031] 紫外光谱采用Varian公司的Varian Cary300Bio spectrophotometer光谱仪测定；

[0032] 旋光采用Perkin-Elmer公司的Perkin-Elmer341Polarimeter测定仪测定。

[0033] 化合物具体数据如下：

[0034] 化合物1结构:

[0035]

[0036] 性状:无色油状物

[0037] 溶解性:易溶解于氯仿、丙酮、甲醇，不溶于水

[0038] 比旋度: 43.3(c0.03,EtOH)

[0039] 分子式:C31H42O8

[0040] 质谱(ESIMS)m/z:565[M+Na]+

[0041] 高分辨质谱(High-resolution ESIMS):565.2759(计算值：C31H42NaO8,565.2772)[0042] 紫外吸收光谱(UV absorption spectrum)λmax(EtOH)nm(log ε):245(4.01)[0043] 氢谱(1H NMR)和碳谱(13C NMR)数据见表1

[0044] 化合物2结构:

[0045]

[0046] 性状:无色油状物

[0047] 溶解性:易溶解于氯仿、丙酮、甲醇，不溶于水

[0048] 比旋度: 73.3(c0.03,EtOH)

[0049] 分子式:C31H42O8

[0050] 质谱(ESIMS)m/z:565[M+Na]+

[0051] 高分辨质谱(High-resolution ESIMS):565.2743(计算值：C31H42NaO8,565.2772)[0052] 紫外吸收光谱(UV absorption spectrum)λmax(EtOH)nm(logε):245(4.29)[0053] 氢谱(1H NMR)和碳谱(13C NMR)数据见表1

[0054] 表1：化合物1和化合物2在CDCl3中的核磁数据(氢谱，400MHz；碳谱，100MHz)[0055]

[0056]

[0057]

[0058] *氢谱数据中括号内的为耦合常数，单位为Hz

[0059] 本发明进一步提供了含有如前所述的化合物1和/或化合物2的农药组合物，所述组合物还含有一种或者多种常规载体和/或稀释剂。所述农药组合物的剂型可以为水分散粒剂、乳油、水悬浮剂、油悬浮剂、微乳剂或片剂。

[0060] 本发明进一步提供了如前所述的化合物1和/或化合物2在制备用于防治农作物病虫害药物中的用途。所述农作物病虫害包括小菜蛾、蚜虫和红蜘蛛。

[0061] 实验数据证明，本发明提供的化合物1和化合物2，与现有产业化的米尔贝霉素A3/A4相比，对小菜蛾、蚜虫和红蜘蛛等农作物害虫具有更强的杀灭活性，而且其安全性更高，易降解，具有非常好的市场应用前景。

附图说明

[0062] 图1实施例2所得化合物1的高分辨质谱；

[0063] 图2实施例2所得化合物1的氢谱；

[0064] 图3实施例2所得化合物1的碳谱；

[0065] 图4实施例2所得化合物1的DEPT135谱；

[0066] 图5实施例2所得化合物1的紫外光谱；

[0067] 图6实施例2所得化合物2的高分辨质谱；

[0068] 图7实施例2所得化合物2的氢谱；

[0069] 图8实施例2所得化合物2的碳谱；

[0070] 图9实施例2所得化合物2的DEPT135谱；

[0071] 图10实施例2所得化合物2的紫外光谱。

具体实施方式

[0072] 以下通过实施例对本发明进行进一步说明。必须指出，这些实施例是用于说明本发明，而不是对本发明的限制。

[0073] 实施例1：发酵生产含有化合物1和化合物2的发酵液

[0074] 将Streptomyces avermitilis strain NEAU1069单菌落接种于种子培养基(重量比(W/W)：玉米淀粉2.5％，黄豆饼粉0.8％，花生饼粉1％，酵母粉0.95％，CoCl20.003％，pH7.2-7.4)中，28℃，250rpm，摇床培养40小时得到种子液。以6％的接种量将种子液转接于30kg发酵培养基(重量比(W/W)：玉米淀粉14％，淀粉酶0.003％，黄豆饼粉2.0％，酵母粉1％，沸石粉0.2％，MnSO40.0024％，Na2MoO40.0024％，CoCl2·6H2O0.002％，pH7.2-7.4)中，28℃，250rpm，发酵罐中培养8天，得到含有化合物1和化合物2的发酵液。

[0075] 实施例2：化合物1和化合物2的提取分离

[0076] 取实施例1得到的发酵液30kg，过滤得到菌丝体并用水洗涤两次，滤液弃之，水洗涤后菌丝体用10L甲醇浸泡，甲醇浸泡液浓缩至2L后，用2L乙酸乙酯萃取，重复三次，将得到的乙酸乙酯相浓缩至干得到26g油状粗提物。

[0077] 前述油状粗提物用硅胶柱(青岛海洋化学集团,青岛,中国；100–200目的硅胶)层析进行分离，分别得到三个流分，流份AI(95/5洗脱部分)，流份AII(90/10和85/15洗脱部分)和流份AIII(80/20和75/25洗脱部分)，其中流分AIII再用硅胶柱层析进行分离纯化，用石油醚/丙酮(80/20,v/v)洗脱，分段收集洗脱流分，TLC检测，合并洗脱液，得到流分I和流分II。

[0078] 进一步将流分I进行反相制备柱色谱纯化，条件如下：

[0079] 液相系统：Agilent1100半制备高压液相色谱仪(Agilent,Palo Alto,CA,USA)[0080] 柱 子 :ZORBAX.Eclipse XDB-C18(5μm,250×9.4mm i.d.；Agilent,Palo Alto,CA,USA)

[0081] 洗脱剂：甲醇/乙腈/水＝72：7：21(v/v/v)

[0082] 流速：1.5mL/min

[0083] 检测波长：λ＝254nm

[0084] 收集保留时间为17.3min的峰，得到12mg化合物1。

[0085] 进一步将流分II进行反相制备柱色谱纯化，条件如下：

[0086] 液相系统：Agilent1100半制备高压液相色谱仪(Agilent,Palo Alto,CA,USA)[0087] 柱 子 :ZORBAX.Eclipse XDB-C18(5μm,250×9.4mm i.d.；Agilent,Palo Alto,CA,USA)

[0088] 洗脱剂：甲醇/乙腈/水＝69：24：7(v/v/v)

[0089] 流速：1.5mL/min

[0090] 检测波长：λ＝254nm

[0091] 收集保留时间为30.1min的峰，得到8mg化合物2。

[0092] 实施例3：化合物1和化合物2杀灭红蜘蛛活性测定

[0093] 采用浸虫法测定。选择室内饲养、生理状态一致的雌成螨虫。选取生长一致的蚕豆叶片，用打孔器做成直径2cm叶碟，叶背朝上置于培养皿中心的脱脂棉上，每皿3片叶蝶，用小号毛笔挑接雌成螨接种到叶碟上，每叶碟20-30头，并加适量水，放于(26±1)℃，光照强度3000～4500lx、14h/d，RH50％～75％的培养室内。2h后于体视显微镜下检查成螨数，每皿叶碟上螨的数量不低于50头。配制分别含有化合物1、化合物2和米尔贝霉素(色谱纯度95％，米尔贝霉素A3∕A4＝30∕70)的药液，其中每一种药液配成5份不同质量浓度的药液，其质量浓度分别为0.0005mg/L、0.001mg/L、0.0025mg/L、0.005mg/L、0.01mg/L。将带有螨的叶蝶依次浸入制备好的药液中并与用蒸馏水处理雌成螨进行对照，每个质量浓度浸入5s为一处理，每处理重复3次。

[0094] 将处理过的叶碟置于(26±1)℃，14h光周期的人工气候室培养24h，并在培养皿中加少量水保湿。24h后镜检并记录死亡及存活的螨数，检查时用毛笔轻触螨体，完全不动者判定为死亡。结果见表2：

[0095] 表2：化合物1和化合物2杀灭红蜘蛛活性

[0096]a

[0097] 米尔贝霉素A3：米尔贝霉素A4＝30:70(v/v)

[0098] 实施例4：化合物1和化合物2杀灭小菜蛾活性测定

[0099] 供试昆虫为小菜蛾3龄幼虫.在人工气候室条件下[(26±1)℃，RH(70±5)％，H/D14]用改良的蛭石白菜苗法继代饲养的品系。采用叶碟浸液法。分别将化合物1、化合物2和米尔贝霉素(色谱纯度95％，米尔贝霉素A3∕A4＝30∕70)配制成0.5％的制剂，兑水稀释成10、25、50、100、200个浓度梯度药液，置于烧杯中备用。

[0100] 将新鲜无污染的甘蓝叶片分别在各供试药液中浸渍约l0s。取出自然晾干后，放入铺有保湿滤纸的培养皿(d＝9cm)内，然后移入3龄小菜蛾幼虫，每处理重复3次，每皿20头试虫，并置于养虫室内恒温饲养。以清水处理为对照。检查48h试虫死亡情况并采用几-1率值法计算毒力回归方程及致死中浓度LC50(mg·L )值，结果见表3。

[0101] 表3：化合物1和化合物2杀灭小菜蛾活性

[0102]a

[0103] 米尔贝霉素A3：米尔贝霉素A4＝30:70(v/v)

[0104] 实施例5：化合物1和化合物2杀灭菜蚜活性测定

[0105] 菜蚜，从田间十字花科蔬菜上采集没有施过药剂的带蚜叶片，剔除若蚜和有翅蚜，使蚜虫大小基本一致、密度适中，于温室内培养。采用叶碟浸虫浸液法。分别将化合物1、化合物2和米尔贝霉素(色谱纯度95％，米尔贝霉素A3∕A4＝30∕70)配制成0.5％的制剂，兑水稀释成0.1、0.25、0.5、1、2个浓度梯度药液，置于烧杯中备用。

[0106] 将试虫叶片在药液中浸渍5s，取出晾干后放入垫有保湿滤纸的培养皿(d＝9cm)中。每个处理设3次重复，每个重复50头试虫，并置于养虫室内恒温饲养，以清水作对照。在室内条件下饲养24h后检查各浓度药液处理后的死亡虫数，并采用几率值法计算毒力回-1
归方程及致死浓度LC50(mg·L )值，结果见表4。

[0107] 表4：化合物1和化合物2杀灭菜蚜的活性

[0108]a

[0109] 米尔贝霉素A3：米尔贝霉素A4＝30:70(v/v)。