一种猪akirin2基因启动子及其应用

摘要

本发明公开了一种猪akirin2基因启动子及其应用，其核苷酸序列如SEQ：ID：1所示。本发明所述的猪akirin2基因启动子在外源基因真核表达、转基因猪中的应用。本发明确定了200bp的最小启动子片段的活性最强。本发明提供寡核苷酸引物序列、克隆载体、表达载体、转化的宿主、外源蛋白表达的方法。这些为进一步开展猪akirin2基因在猪的肌卫星细胞及其他相关细胞中调控的研究提供了基础，同时可用于哺乳动物细胞中进行外源蛋白的表达及转基因研究。

权利要求

1.一种猪akirin2基因启动子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ：ID：1所示。

2.权利要求1所述的猪akirin2基因启动子在外源基因真核表达、转基因猪中的应用。

说明书

一种猪akirin2基因启动子及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物化学技术领域，涉及一种猪akirin2基因启动子及其应用。

背景技术

[0002] 生物体在生长、发育过程中，能够根据环境的改变以及自身的需要适时地表达出合适的蛋白质分子。这往往是需要通过一定的程序来调控基因的表达。真核生物基因的表达调控可以分为几个层次和水平，包括DNA水平、RNA水平和蛋白质水平。RNA水平包括了转录起始、转录后加工及降解(RNAi就是在该水平的基因表达调控)。一般认为转录起始的调控是基因表达调控的关键点，最主要和重要的调控发生在转录的起始阶段。真核生物通过顺式作用元件和反式作用因子以及反式作用因子之间的相互作用来影响RNA聚合酶的活性，进而调控目的基因的表达。真核生物的启动子就是包含了增强子和沉默子在内的顺式作用元件之一。

[0003] 启动子是位于结构基因上游的一段DNA序列，也是RNA聚合酶辨认、识别、结合并起始转录的一段DNA序列。这就意味着，其下游基因是否将被转录，以及转录的频次都与这段DNA有关，正因为如此，启动子是基因表达调控的重要顺式作用元件之一。随着基因工程技术的发展，人们逐渐认识到启动子对外源目的基因表达的重要作用。传统的组成型启动子在启动外源基因表达的同时，也使目的基因在其他组织器官造成了累计和浪费甚至危及到转基因个体。随后陆续出现了组织特异性启动子、诱导型启动子等等。因此，克隆基因的启动子，探讨基因启动子区域的结构及与之相互结合的可能的转录因子，将有助于从理论上揭示基因表达的关键调控位点并有可能应用于细胞表达及转基因的研究中。目前还未见有关猪的akirin2基因启动子的报道。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种猪akirin2基因启动子的核苷酸序列及其应用，为了研究猪akirin2基因启动子的活性区域，本发明克隆了猪akirin2基因上游的核苷酸序列(-1036bp至+34bp)，并与载体pGL3-basic连接构建了一系列的缺失体，采用双荧光素酶报告试剂盒，对启动子的不同区域的活性进行了分析。本发明的结果提供了猪akirin2启动子核苷酸序列及其主要的顺式作用元件，含引物载体及细胞，并验证了不同 核苷酸片段的启动效率。本发明的猪akirin2启动子可用于猪akirin2基因的转录调控机制的研究并用于哺乳动物细胞中进行蛋白的表达及转基因研究。

[0005] 其具体技术方案为：

[0006] 一种猪akirin2基因启动子，其核苷酸序列如SEQ：ID：1所示。

[0007] 本发明所述猪akirin2基因启动子在外源基因真核表达、转基因猪中的应用。

[0008] 本研究克隆获得了猪akirin2基因启动子序列，并采用在线分析软件对该序列进行了预测分析，推测判定了猪akirin2基因启动子的转录起始位点及部分转录因子及结合位点；采用双荧光素酶报告基因载体，通过转染细胞，研究了启动子的活性，结果显示转染了重组荧光素酶的载体pGL3-F1.0、pGL3-F0.7、pGL3-F0.4和pGL3-F0.2组的相对荧光素酶活性均比转染空载体pGL3-basic组有所升高，而且差异具有统计学意义，确定了200bp的最小启动子片段的活性最强。这些为进一步开展猪akirin2基因在猪的肌卫星细胞及其他相关细胞中的应用及对akirin2基因的调控研究提供了基础，同时该启动子序列还可应用于哺乳动物细胞中进行蛋白的表达及转基因研究。

附图说明

[0009] 图1是猪基因组DNA，M为DNAmaker DL15000，泳道1为猪的基因组DNA，M：DNAmaker DL15000；

[0010] 图2是akirin2promoter PCR扩增产物；

[0011] 图3是酶切鉴定，其中，M：DL5000；1-4：pGL3-F0.2(DraI)：2120bp，1099bp，1056bp，692bp，19bp；5-7：pGL3-F0.4(KpnI)：5131bp，55bp；8-12：pGL3-F0.7(Kpn I)：5078bp，
408bp；13-17：pGL3-F1.0(Kpn I)：5079bp，486bp，221bp；

[0012] 图4是质粒转染Hela细胞的效率分析，A：正常光；B：绿色荧光。

[0013] 图5是猪akirin2基因启动子的活性分析

具体实施方式

[0014] 下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

[0015] 本发明涉及的遗传资源大白猪和长白猪杂交的二元健康猪采集于中国河南省。

[0016] 1材料与方法

[0017] 1.1样品采集

[0018] 取健康猪的肌肉组织，用锡箔纸包好迅速冷冻于液氮中，置于-80℃低温冰箱保存备用。

[0019] 主要仪器

[0020] 台式高速离心机(Eppendorf，Germany)；温度梯度PCR仪(Sensoquest，Germany)；凝 胶成像系统(AlphaImager HP，USA)；微量核酸蛋白检测仪NanoDrop-1000(Thermo，USA)；二氧化碳培养箱(MCO-5AC，三洋)；倒置显微镜(Leica，Germany)；智能荧光细胞分析仪(JuLi，Korea)；Fluroskan Ascent FL荧光和化学发光检测仪(Thermo，USA)。

[0021] 1.2主要试剂

[0022] 质粒pGL3-basic和pRL-TK为本室保存；双荧光素酶检测试剂Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega，USA)；pMD19-T试剂盒；T4DNA连接酶；大肠杆菌E.Coli DH5a菌株为本室保；Hale细胞株；DMED培养基；胎牛血清(四季青，杭州)；0.25％胰酶(含EDTA)DMSO(sigma，USA)；Turbofect转染试剂(Thermo，USA)。

[0023] 1.4配制的溶液

[0024] 1)Digestion Buffer

[0025] 分别取SDS(10％)3mL、NaCl(3M)2mL、EDTA(0.5M)3mL、Tris-HCl(1M pH8.0)0.6mL，混匀后定容至60mL。

[0026] 2)蛋白酶K

[0027] 称取10mg的蛋白酶K，加入1mL灭菌的蒸馏水至完全溶解。

[0028] 1.5方法

[0029] 1.5.1基因组DNA的提取

[0030] 采用蛋白酶K消化和酚/氯仿抽提，从猪的肌肉组织中提取基因组DNA。具体操作如下：

[0031] (1)从-80℃取出组织，放入液氮研磨，并转移至一干净的2.0mL的离心管中。

[0032] (2)加入0.5mL的digestion buffer和6μL蛋白酶K混匀。

[0033] (3)55℃水浴锅中消化过夜(12-18h)。

[0034] (4)加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(24∶25∶1)，轻轻颠倒混匀，室温静置30min。

[0035] (5)4℃1,700g离心10min，此时，溶液分三层。

[0036] (6)转移上清至一新的离心管中，加入1/2体积的10M乙酸铵和2倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃放置10min。

[0037] (7)4℃1,700g离心2min，弃上清，将离心管倒扣在吸水纸上，尽可能除去上清。

[0038] (8)加入1mL75％乙醇，4℃12,000g离心5min，弃上清。

[0039] (9)加入适量的TE进行溶解。

[0040] 0.5％的琼脂糖凝胶电泳检测所提取基因组DNA的质量。

[0041] 1.5.2引物设计

[0042] 根据已经克隆出来的猪akirin2的mRNA序列，在NCBI数据库的Gene中搜索akirin2(Sus scrofa)的5′端的上游调控序列。在转录起始位点上游-1036和+34处设计上游和下游引物。为了后续能将获得的片段连入载体pGL3-basic，分别在上游引物和下游引物的5′端加上KpnI和Hind III酶切位点。同时，为了确定最佳的启动子片段，在转录起始位点上游的-180、-384和-737处分别设计了3条引物，并在引物的5′端也加上Kpn I酶切位点。引物序列见表1， 引物由上海生工合成。

[0043] 表1扩增不同片段大小的akirin2启动子的引物序列

[0044] Table1Primers for the cloning of akirin2 promoter

[0045]

[0046] 下划线部分为酶切位点

[0047] 1.5.3 PCR扩增及目的片段的回收纯化

[0048] PCR反应体系：

[0049]

[0050] 混匀，瞬时离心。立即置于PCR仪上。

[0051] 反应程序：

[0052] 95℃预变性5min

[0053]

[0054]

[0055] 反应结束后，取5μL PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测。

[0056] PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测初步确认后，剩余的PCR样品经1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行切胶纯化，电压100V，电泳时间40min。目的条带切下来后，用上海生工SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒进行回收纯化，操作方法略有改动，如下：

[0057] (1)将整块琼脂糖凝胶置于紫外透射/反射仪中，在紫外灯下，用刀片将含有目的DNA的琼脂糖凝胶小心切下(尽可能减少凝胶的体积，以提高DNA的回收率)，然后将切下来的凝胶块儿其放入一干净的1.5ml离心管中(切胶时注意尽量避免紫外灯长时间照射，以减少DNA损伤)。

[0058] (2)置于电子天平上称重，按照每100mg琼脂糖(如凝胶块不足100mg则用水补充至100mg)加400μL的比例加入Buffer B2，上下颠倒几次。

[0059] (3)将离心管置于水浴锅中50℃10min，期间观察并混匀，直到凝胶完全融化为止(注意，胶块融化要充分，否则严重影响DNA的回收率，但是过长时间的处理可能导致DNA损伤)。

[0060] (4)目的片段小于500bp时，加入所使用的Buffer B2体积1/3的异丙醇，混匀。大于500bp的DNA片段的回收，此步可以省略。

[0061] (5)将溶化好的溶液全部移入吸附柱，8,000g离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中。

[0062] (6)向吸附柱中加入500μLWash Solution，9,000g离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中。

[0063] (7)重复操作步骤(6)一次。

[0064] (8)将空吸附柱和收集管放入离心机，9,000g离心1min。

[0065] (9)在吸附膜中央加入15-40μLElution Buffer，60℃烘箱中静置2min，然后9,000g离心1min。

[0066] 回收的DNA置于-20℃保存，或直接进行下面的反应。

[0067] 将回收的目的片段PF1.0kb、PF0.7kb、PF0.4kb、PF0.kb2分别与pMD19-T载体进行连接，构建成形成新的载体pMD19-T-PF1.0、pMD19-T-PF0.7、pMD19-T-PF0.4和 pMD19-T-PF0.2。按照摩尔比约为3～5∶1的比例，将回收纯化的PCR产物分别与pMD19-T载体DNA进行混合，连接反应按照试剂盒操作说明进行。将连接产物转化至感受态细胞DH5α。在含有amp的LB平板上进行阳性克隆的筛选。经酶切初步鉴定后，随机选取3-5个阳性克隆送上海Sangon测序。

[0068] 1.5.4 生物信息学分析

[0069] 在NCBI上运行BLAST，对测序结果进行比对分析，检验序列的正确性。在线运行BDGP(http：//www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)，预测分析akirin2基因核心启动子序列及转录起始位点。采用Primer5.0软件中的Motif模块，进行转录因子结合位点分析及顺式作用元件的分析。

[0070] 1.5.5猪akirin2基因启动子的荧光素酶报告载体的构建

[0071] 将pMD19-T-PF1.0、pMD19-T-PF0.7、pMD19-T-PF0.4、pMD19-T-PF0.2重组质粒和pGL3-basic质粒分别用KpnI和Hind III两种限制性内切酶进行双酶切，经1.2％的琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收酶切所得的启动子DNA片段和线性化的pGL3-basic载体。按照插入片段与载体的摩尔比3∶1的比例，将两者混合在一起，加入T4DNA连接酶Buffer2μL，T4DNA连接酶1μL，灭菌的蒸馏水补齐至总体积20μL，离心混匀后，置于恒温孵育器中25℃孵育2h。将连接产物转化至感受态细胞DH5a中，涂布在含有Amp的固体培养基上进行筛选，第二天挑选阳性克隆，用DraI和KpnI进行酶切鉴定，随机挑选3-5个经酶切初步鉴定为阳性的克隆送上海生工测序。测序结果与GenBank数据库中的序列进行比对，将构建好的质粒命名为：pGL3-F1.0、pGL3-F0.7、pGL3-F0.4和pGL3-F0.2。将测序正确的克隆进行扩大培养，并提取无内毒素质粒，质粒提取按照QIAGEN公司的QIAGEN Plasmid Midi Kits操作说明进行。

[0072] 质粒提取步骤：

[0073] (1)4℃6,000g离心15min，收集菌体。

[0074] (2)加4mL Buffer P1(已加Rnase A)重悬菌体。

[0075] (3)加入4mL Buffer P2，上下颠倒4-6次，室温放置5min(如加入了LyseBlue试剂，此时溶液呈蓝色)。

[0076] (4)加入4mL预冷的Buffer P3，上下颠倒混匀4-6次，然后冰上放置15min(如果已经加了LyseBule试剂，充分混匀后应由蓝色变为无色)。

[0077] (5)4℃12,000g离心30min。

[0078] (6)在QIAGEN-tip100柱中加入4mL Buffer QBT，让Buffer QBT在重力作用下自然流尽。

[0079] (7)将离心后的上清加入到QIAGEN-tip100柱中，使其在重力作用下自然流过。

[0080] (8)用10mL的Buffer QC洗QIAGEN-tip100柱2次。

[0081] (9)用5mL Buffer QF洗脱DNA至一新的15mL离心管中。(注意，如果质粒长度大于45kb，事先将洗脱液Buffer QF加热至65℃，再进行洗脱可以提高回收率。)

[0082] (10)向离心管中加入3.5mL(0.7倍体积)的异丙醇(室温放置)，混匀。瞬时离心后，分装至6个1.5mL离心管中，4℃12,000g离心30min，弃上清。

[0083] (11)沉淀中加入300μL70％的乙醇(室温放置)，然后4℃12,000g离心10min，弃上清，留沉淀。

[0084] (12)自然干燥5-10min，用30μLTE溶解，-20℃保存。

[0085] 1.5.6Hale细胞的培养

[0086] 细胞复苏。从液氮管中取出冻存管，迅速放入37℃水浴锅中，为避免污染管口不能浸没在水中，使其融化，其间反复摇晃尽可能使其在1min左右融化。在超净台中，将细胞转移至一新的培养瓶中，用培养基(高糖DMEA加10％FBS)缓慢稀释至原来体积的10倍以上，放置于37℃，5％的CO2培养箱中进行培养。4-6h后倒置显微镜下观察细胞，待大部分细胞贴壁后吸去含有冻存液的培养基，换成含10％FBS的DMEA(高糖)培养基继续培养。

[0087] Hela细胞汇合度达到80％-90％时进行传代。细胞消化前用2mL的PBS洗一次，然后加1mL0.25％的胰酶进行消化。胰酶加入后旋紧细胞培养瓶瓶口，将培养瓶放置在二氧化碳培养箱中，37℃消化，时间不超过2分钟，至细胞能见到下沉、滑落。消化好后加入1mL含10％FBS的DMEA(高糖)培养基终止消化，反复吹打使细胞分散开，再加入培养基。按照1∶3的比例进行传代，将分装好的细胞置于37℃，5％的CO2培养箱中进行培养。

[0088] 1.5.7细胞转染

[0089] 将消化好的Hela细胞均匀地铺在12孔细胞培养板中，置于37℃，5％的CO2培养箱中进行培养，细胞汇合度达到70％-80％左右时进行转染。将构建好的4个载体pGL3-F1.0、pGL3-F0.7、pGL3-F0.4和pGL3-F0.2分别与载体pRL-TK共转染Hela细胞。转染质粒pEGFP-N1组设为阳性对照，以共转染空载体pGL3-basic和载体pRL-TK组为阴性对照，每组3个重复。

[0090] 转染方法按照Thermo(USA)公司的Turbofect转染试剂操作说明进行。

[0091] (1)分别取950ng的构建好的含目的启动子DNA片段的pGL3-F1.0、pGL3-F0.7、pGL3-F0.4和pGL3-F0.2质粒，以及50ng的pRL-TK质粒，加入100μL无血清的DMEM，轻弹以混匀，瞬时离心，室温静置5min。

[0092] (2)取2μL TurboFect转染试剂加入到上述溶液中，轻轻拨动离心管混匀，瞬时离心，将配好的转染试剂室温静置15-20min。

[0093] (3)在每孔中加入100μL上述转染试剂(原来孔中的培养基无需移除)。

[0094] (4)晃动细胞培养板，使之混匀。

[0095] (5)置于37℃，5％CO2培养箱中进行培养。

[0096] 1.5.8启动子活性的检测

[0097] 转染12h后，在荧光显微镜下通过对转染绿色荧光蛋白pEGFP-N1质粒的阳性组的观察，检测转染效率。转染18-20h后，收集细胞，加入裂解液，检测荧光素酶相对活性。

[0098] (1)弃去每孔中的培养基，加入1mL PBS洗一次。

[0099] (2)每孔中加入200μL1×passive lysis Buffer，室温静置15-20min，其间晃动培养板，加速细胞的裂解。

[0100] (3)收集细胞裂解液至一新的1.5mL离心管中，4℃12,000g离心2min。

[0101] (4)取90μL上清转移至不透光的白色96孔板，每孔加入50μLLuciferase Assay Buffer II(避光)，用Fluroskan Ascent FL荧光和化学发光检测仪(Thermo，USA)测定萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)活性值。

[0102] (5)然后在机器运行至暂停时，取出96孔板，每孔再加入50μL stop glo buffer，再继续测定海参荧光素酶(renilla luciferase)活性值。

[0103] 1.5.9统计学分析

[0104] 启动子相对活性用荧光虫荧光素酶活性值与内参质粒海参荧光素酶活性值的比值标示。所有实验数据用GraphPad Prisim6.0统计学软件进行统计学分析。组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，P<0.05为差异显著，有统计学意义。

[0105] 2结果与分析

[0106] 2.1猪骨骼肌基因组DNA的提取

[0107] 所提取的猪肌肉组织中DNA，经0.5％的琼脂糖凝胶电泳及NanoDrop-1000检测DNA的质量，电泳显示基因组没有降解(图1)，OD260/OD280＝1.95，表明DNA的完整性和纯度 均很好，能满足扩增猪akirin2基因启动子区所需模板质量的要求。

[0108] 2.2猪akirin2基因启动子区PCR扩增结果

[0109] 取5μLPCR产物，经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，所扩增条带清晰单一，扩增条带大小与预期一致(图2)。

[0110] 2.3荧光素酶报告载体的构建及鉴定结果

[0111] 把经双酶切回收的目的片段PF1.0kb、PF0.7kb、PF0.4kb、PF0.kb2分别与载体pGL3-basic连接后构建成重组载体pGL3-F1.0、pGL3-F0.7、pGL3-F0.4和pGL3-F0.2，其中载体pGL3-F0.2经DraI酶切鉴定，其余新构建成的三个载体经KpnI酶切鉴定(图3)，pGL3-F0.2经DraI酶切后产生2120bp、1099bp、1056bp、692bp和19bp五个片段；pGL3-F0.4载体经KpnI酶切后产生5131bp和55bp两个片段；，pGL3-F0.7在KpnI酶切后产生两个片段一个5078bp，另一个为408bp；pGL3-F1.0酶切后会形成5079bp、486bp和221bp三个片段。经酶切鉴定正确的克隆送上海生工测序，测序结果经比对后证实与GenBank数据库中公布的猪akirin2基因上游的核苷酸序列一致，表明含猪akirin2基因上游序列的四个荧光素酶报告基因载体已构建成功。

[0112] 2.4细胞培养与转染效果

[0113] Hela细胞经复苏和培养后生长状态良好(图4)，当细胞的汇合度达到70％-80％左右时进行转染，从图4中可见，转染12小时后，转染质粒pEGFP-N1组的Hela细胞在荧光显微镜下可以观察到有绿色荧光蛋白的表达，转染效率在70％以上，而阴性对照组(即pGL3-Basic和pRL-TK共转染组)以及实验组则没有观察到绿色荧光蛋白的表达，说明在本试验的转染效率及转染条件下可以进行后续试验。

[0114] 2.5荧光素酶活性检测结果

[0115] 在Hela细胞中，pGL3-F1.0、pGL3-F0.7、pGL3-F0.4和pGL3-F0.2这四个载体及空载体pGL3-basic分别与pRL-TK瞬时共转染后，实验组的荧光素酶相对活性分别为2.694±0.282、2.855±0.342、5.227±0.214和8.372±0.306，对照组的荧光素酶相对活性值为
0.197±0.023。与对照组相比，实验组的荧光素酶相对活性均显著高于对照组(P＜0.05)。
pGL3-F0.2荧光素酶的相对活性最高，为基础活性的42.5倍，pGL3-F1.0荧光素酶的相对活性最低，为基础活性的13.7倍。而且，实验组中随着片段长度的减小，相对荧光素酶活性的数值逐渐增大，最小的启动子片段(200bp)的活性最强，高于400bp、700bp和1kb这三个启动子片段。