一种鉴别蛙病毒属病毒的三重实时荧光PCR引物、探针和试剂盒

摘要

本发明公开了一种鉴别蛙病毒属病毒的三重实时荧光PCR引物、探针和试剂盒。所述引物如序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：2所示，所述探针如序列SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：5所示。本发明试剂盒灵敏、快速、准确，能同时对13种蛙病毒属病毒进行检测，这项技术在外来重大水生疫病蛙病毒属病毒的监控中具有非常大的应用前景。

权利要求

1.一组鉴别蛙病毒属病毒的三重实时荧光PCR引物和探针，其特征在于，所述引物如序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：2所示，所述探针如序列SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：5所示；其中，所述序列SEQ ID NO：3为鉴别沼泽绿牛蛙虹彩病毒、中华鳖虹彩病毒、虹彩病毒3型、饰纹汀蟾（穴居蛙）虹彩病毒、虎纹蛙病毒、大鲵虹彩病毒、流行性造血器官坏死症病毒、欧洲鮰鱼病毒和欧鲶病毒的探针，并且5′端标记FAM荧光报告基团，3′端标记BHQ1淬灭基团；

所述序列SEQ ID NO：4为鉴别大口黑鲈病毒、裂唇鱼病毒和孔雀鱼病毒6型的探针，并且5′端标记HEX荧光报告基团，3′端标记BHQ1淬灭基团；

所述序列SEQ ID NO：5为鉴别新加坡石斑鱼虹彩病毒的探针，并且5′端标记CY5荧光报告基团，3′端标记BHQ3淬灭基团。

2.如权利要求1所述的鉴别蛙病毒属病毒的三重实时荧光PCR引物和探针在制备鉴别蛙病毒属病毒的实时荧光PCR试剂盒中的应用。

3.一种鉴别蛙病毒属病毒的三重实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，其包括以下组分：（1）DNA提取试剂；

（2）PCR反应液：包括如序列表SEQ ID NO:1至SEQ ID NO：2所示的用于鉴别蛙病毒属病毒的引物，如序列表SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：5所示的探针；其中，所述序列SEQ ID NO：3为鉴别沼泽绿牛蛙虹彩病毒、中华鳖虹彩病毒、虹彩病毒3型、饰纹汀蟾（穴居蛙）虹彩病毒、虎纹蛙病毒、大鲵虹彩病毒、流行性造血器官坏死症病毒、欧洲鮰鱼病毒和欧鲶病毒的探针，并且5′端标记FAM荧光报告基团，3′端标记BHQ1淬灭基团；

所述序列SEQ ID NO：4为鉴别大口黑鲈病毒、裂唇鱼病毒和孔雀鱼病毒6型的探针，并且5′端标记HEX荧光报告基团，3′端标记BHQ1淬灭基团；

所述序列SEQ ID NO：5为鉴别新加坡石斑鱼虹彩病毒的探针，并且5′端标记CY5荧光报告基团，3′端标记BHQ3淬灭基团；

（3）Taq DNA聚合酶；

（4）无菌双蒸水；

（5）阴性对照；

（6）阳性对照。

4.根据权利要求3所述的鉴别蛙病毒属病毒的三重实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液还包括缓冲液、MgCl2和dNTP。

说明书

一种鉴别蛙病毒属病毒的三重实时荧光PCR引物、探针和

试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及一种鉴别蛙病毒属病毒的三重实时荧光PCR引物、探针和试剂盒，可同时筛查13种蛙病毒属病毒，属于检验检疫领域。

背景技术

[0002] 近年来，由虹彩病毒科蛙病毒属引起的鱼类、两栖类和爬行类的疾病遍布全球，涉及许多组织系统性感染疾病，出现病症后的宿主动物死亡率高达100％，给水产业造成了非常大的经济损失。在亚洲、大洋洲、欧洲、北美洲和南美洲等地区从自然生存、养殖、健康以及死亡的蛙中均分离到了蛙病毒属病毒，蛙病毒属已被世界动物卫生组织(OIE)规定为必须申报的水生动物疫病之一。

[0003] 蛙病毒属属于虹彩病毒科，为裸露或有囊膜的二十面体病毒粒子，病毒直径约150～170nm，基因组是单一线状双链DNA，全长为150～170kb，GC含量为49％～55％，在细胞核和细胞质中都能复制。其结构蛋白主衣壳蛋白(major capsid protein，MCP)占整个病毒粒子多肽的40～45％，具有高度的保守性，又具有足够的变异性，氨基酸同源性达
65.9％，是虹彩病毒进化和分类的重要依据，所以本发明利用MCP的同源性差异进行蛙病毒属病毒的鉴别和区分，该方法是可靠的。

[0004] 由于蛙病毒属病毒的基因序列相似性达90％以上，所以设计特异的引物和探针对于区分和鉴别蛙病毒属病毒非常关键。目前，研究者们建立了虹彩病毒蛙病毒属实时荧光PCR的检测方法、虎纹蛙病毒(tiger frog virus，TFV)的普通PCR方法、大口黑鲈虹彩病毒(Largemouth bass virus，LMBV)的双重PCR检测方法以及大鲵虹彩病毒ADIV(Andrias davidiamus iridovirus)TaqMan实时荧光定量PCR的检测方法，上述方法，对于同一个检测样本，最多能鉴别和区分2种蛙病毒属病毒，而本发明第一次建立了蛙病毒属病毒的三重实时荧光PCR方法，对于同一个检测样本，可同时鉴别和区分13种蛙病毒属病毒，降低了检测成本，节省了检测时间，实现了高通量处理样本的简便性，该方法具有快速性、准确性和高灵敏性的特点。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种简便、快速、灵敏、特异和高效的鉴别蛙病毒属病毒的三重实时荧光PCR引物、探针和试剂盒。该方法检测覆盖蛙病毒属病毒种类多，是一种特异性强，准确性高、灵敏性高的检测方法。

[0006] 为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

[0007] 本发明提供一组鉴别蛙病毒属病毒的三重实时荧光PCR引物和探针，其中，采用一对通用引物，正向引物为5′-ATGGTGCARAACGTCA-3′(SEQ ID NO：1)，反向引物为5′-GCTCCAKSACSGTGTT-3′(SEQ ID NO：2)。

[0008] 所述探针如下所示：

[0009] 探针1：5′-CTTCCGTCGGCTCCAATTACACC-3′(SEQ ID NO：3)

[0010] 探针2：5′-CCAACAACAGGAGTGACGCAAGTG-3′(SEQ ID NO：4)

[0011] 探针3：5′-CTGTGGGTTCAAATTATACGTGTGT-3′(SEQ ID NO：5)

[0012] 其中，所述序列SEQ ID NO：3为鉴别沼泽绿牛蛙虹彩病毒RGV(Rana grylio virus)、中华鳖虹彩病毒STIV(Soft-shelled Turtle iridovirus)、虹彩病毒3型FV3(frog virus3)、饰纹汀蟾(穴居蛙)虹彩病毒BIV(Limnodynastes ornatus or bohel iridovirus)、虎纹蛙病毒TFV(tiger frog virus)、大鲵虹彩病毒ADIV(Andrias davidiamus iridovirus)、流行性造血器官坏死症病毒EHNV(Epizootie hematopoietie necrosis virus)、欧洲鮰鱼病毒ECV(European catfish iridovirus)和欧鲶病毒ESV(European sheetfish iridovirus)的探针，并且5′端标记FAM荧光报告基团，3′端标记BHQ1淬灭基团。

[0013] 所述序列SEQ ID NO：4为鉴别大口黑鲈病毒LMBV(Largemouth bass virus)、裂唇鱼病毒DFV(doctor fish virus)和孔雀鱼病毒6型GV6(guppy virus6)的探针，并且5′端标记HEX荧光报告基团，3′端标记BHQ1淬灭基团；LMBV、DFV和GV6统称为SCRV(Santee-Cooper ranavirus)。

[0014] 所述序列SEQ ID NO：5为鉴别新加坡石斑鱼虹彩病毒SGIV(Singapore grouper iridovirus)的探针，并且5′端标记CY5荧光报告基团，3′端标记BHQ3淬灭基团。

[0015] 我们采用TaqMan荧光PCR检测技术建立了鉴别蛙病毒属病毒的三重实时荧光PCR2+
方法，对反应的各种条件进行了优化，其中包括引物探针的筛选，Mg 浓度的优化，引物和探针浓度的优化，得到以下试剂盒。

[0016] 鉴别蛙病毒属病毒的三重实时荧光PCR试剂盒，由以下组分组成：

[0017] 1)DNA提取试剂：可以使用现有技术中已知的提取试剂，也可以采用商业化的提取试剂盒，本发明的DNA提取试剂购自天根生化科技有限公司。

[0018] 2)PCR反应液，表1为优化后的PCR反应液配方。

[0019] 表1PCR反应液配方

[0020]组分 终浓度
10×recreation buffer 1×recreation buffer
25mM MgCl2 3.0mM
10mM dNTP 0.2mM
正向引物 0.8μM
反向引物 0.8μM
探针1 0.25μM
探针2 0.25μM
探针3 0.25μM

[0021] 10×recreation buffer，25mM MgCl2购于Promega公司；10mM dNTP购自生工生物工程(上海)股份有限公司，引物和探针均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

[0022] 3)Taq DNA聚合酶5U/μL，购自Promega公司。

[0023] 4)无菌双蒸水：用自来水两次蒸馏，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS纯水仪纯5
化，收取电阻率≥18.0MΩ.cm的水，15l bf/in2(1.034×10Pa)高压蒸汽灭菌15分钟。

[0024] 5)阴性对照：无菌双蒸水。

[0025] 6)阳性对照：灭活的病毒培养液。

[0026] 一种鉴别蛙病毒属病毒的三重实时荧光PCR检测方法，其步骤如下：

[0027] 1)用DNA提取试剂同时提取试剂盒中的阳性对照、阴性对照以及待测样本中的核酸DNA作为PCR检测模板；

[0028] 2)PCR反应体系配置：加入上述表1中的荧光定量PCR反应液；Taq DNA聚合酶2.5U；模板10μL；用无菌双蒸水补足总体积至25μL；

[0029] 3)PCR扩增参数设置：

[0030] 我们针对Roche Light Cycler480Ⅱ荧光PCR检测仪，扩增参数如下：第一阶段：94℃/3min；第二阶段：94℃/15s，54℃/15s，60℃/30s，40个循环，60℃延伸时收集荧光；

[0031] 4)质控标准：阴性对照无Ct值并且无扩增曲线；阳性对照的Ct≤30.0，并出现典型的“S”型扩增曲线。如阴性对照和阳性对照条件不满足以上条件，此次实验视为无效。

[0032] 5)结果的判定：在FAM通道内荧光PCR扩增曲线呈典型的“S”型曲线且Ct≤30.0，判断为RGV、STIV、FV3、BIV、TFV、ADIV、EHNV、ECV和ESV病毒中的某一种为阳性，如图2，具体鉴定到种可通过PCR或酶切等方法进行进一步鉴定；在HEX通道内荧光PCR扩增曲线呈典型的“S”型曲线且Ct≤30.0，判断为LMBV、DFV和GV6病毒中某一种为阳性，如图3，具体鉴定到种可通过PCR或酶切等方法进行进一步鉴定；在CY5通道内荧光PCR扩增曲线呈典型的“S”型曲线且Ct≤30.0，判断为SGIV病毒阳性，如图4；无典型的“S”型扩增曲线或Ct﹥30.0判断为蛙病毒属病毒阴性。

[0033] 本发明的试剂盒采用三重荧光PCR技术，设计了3种特异性探针，在同一反应体系中实现同时鉴别13种蛙病毒属病毒。引物和探针的设计采用oligo6生物软件设计，将设计的引物和探针在NCBI的GenBank中进行Blast比对，检测引物和探针的特异性。

[0034] 我们发明的三重荧光定量PCR技术是在同一反应体系中同时加入3条不同荧光标记的探针(针对靶基因1的探针标记FAM，针对靶基因2的探针标记HEX，针对靶基因3的探针标记CY5)。PCR反应过程中，若待检样本包含靶基因1，则标记FAM的探针产生荧光信号；若待检样本包含靶基因2，则标记HEX的探针产生荧光信号；若待检样本包含靶基因3，则标记CY5的探针产生荧光信号。所以，同一管反应可确定3种靶基因(图2、图3、图4)，实现了高通量检测的简便性，解决了现有蛙病毒属病毒的检测方法中一管反应中只能检测一种病毒的问题。这项技术在外来重大水生疫病蛙病毒属病毒的监控中具有非常大的应用前景。

附图说明

[0035] 图1是蛙病毒属病毒的系统发育树；

[0036] 图2是FV3等病毒的三重荧光PCR扩增曲线图；

[0037] 图3是LMBV病毒的三重荧光PCR扩增曲线图；

[0038] 图4是SGIV病毒的三重荧光PCR扩增曲线图；

[0039] 图5是FV3病毒的灵敏度试验结果；

[0040] 图6是LMBV病毒的灵敏度试验结果；

[0041] 图7是SGIV病毒的灵敏度试验结果；

[0042] 图8是FV3病毒的特异性试验结果；

[0043] 图9是LMBV病毒的特异性试验结果；

[0044] 图10是SGIV病毒的特异性试验结果。

具体实施方式

[0045] 实施例1：三重荧光PCR Taqman探针和引物的设计

[0046] 根据Genbank中登陆的RGV、STIV、FV3、BIV、TFV、ADIV、EHNV、ECV、ESV、SCRV(LMBV、DFV、GV6)和SGIV的MCP基因保守区域，应用DNAMAN软件进行多重比对分析，应用oligo6软件设计能够鉴别13种蛙病毒属病毒的Taqman探针和引物，分别用FAM、HEX和CY5荧光报告基团标记5′端，淬灭基团用BHQ1和BHQ3标记。具体如上所述。

[0047] 引物和探针均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

[0048] 实施例2：三重实时荧光PCR的建立

[0049] (1)探针和引物浓度的优化

[0050] 将通用引物浓度从0.1μM至0.9μM以每0.1μM递增，探针浓度从0.025μM至0.4μM以每0.025μM递增。对引物和探针不同浓度进行了组合比较，进行多次重复试验，结果发现引物浓度为0.8μM，探针浓度为0.25μM时荧光增幅相对较高。

[0051] (2)镁离子浓度的优化

[0052] 将Mg2+的浓度从1mM至5.0mM以每0.5mM递增，对不同Mg2+浓度条件下的扩增进2+
行了比较，优化后的Mg 浓度为3.0mM。

[0053] (3)TaqDNA聚合酶用量的优化

[0054] 分别以1.25U、2.5U、3.75U和5U的TaqDNA聚合酶用量，进行重复试验，最终优化后聚合酶的用量为2.5U。

[0055] (4)我们针对Roche Light Cycler480Ⅱ荧光PCR检测仪，对该实验中对变性温度和时间、退火和延伸温度及时间进行了优化实验，在综合考虑特异性和灵敏性的前提下，最终确定的扩增参数如下：第一阶段：94℃/3min；第二阶段：94℃/15s，54℃/15s，60℃/30s，40个循环，60℃延伸时收集荧光。

[0056] 经过上述反应组分的优化，最终确定的优化反应体系组成见表2。

[0057] 表2优化反应体系组成

[0058]

[0059]

[0060] 实施例3：鉴别蛙病毒属病毒的荧光PCR检测试剂盒及其使用

[0061] 一、试剂盒的组成(保存于-20℃)

[0062] 1)DNA提取试剂：购自天根生化科技有限公司。

[0063] 2)PCR反应液见表3，每14.5μL荧光PCR反应液组成如下：

[0064] 表3荧光PCR反应液组成

[0065]组分 体积(μL)
10×recreation buffer 2.5
25mM MgCl2 3.0
10mM dNTP 0.5
正向引物(20μM)(SEQ ID NO：1) 1
反向引物(20μM)(SEQ ID NO：2) 1
探针(25μM)(SEQ ID NO：3) 0.25
探针(25μM)(SEQ ID NO：4) 0.25
探针(25μM)(SEQ ID NO：5) 0.25
无菌双蒸水 5.75

[0066] 10×recreation buffer，25mM MgCl2购于Promega公司；10mM dNTP购自宝生物工程(大连)有限公司，引物和探针均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

[0067] 3)Taq DNA聚合酶5U/μL，0.5μL/检测，购自Promega公司。

[0068] 4)无菌双蒸水：用自来水两次蒸馏，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS纯水仪纯5
化，收取电阻率≥8.0MΩ.cm的水，15l bf/in2(1.034×10Pa)高压蒸汽灭菌15分钟。

[0069] 5)阴性对照：无菌双蒸水。

[0070] 6)阳性对照：灭活的病毒培养液。

[0071] 二、试剂盒的应用

[0072] (1)提取样品的DNA，即模板DNA；

[0073] (2)进行实时荧光PCR反应，最适反应体系如下：

[0074] 表4实时荧光PCR反应体系组成

[0075]组分 体积(μL)
荧光PCR反应液(表3) 14.5
TaqDNA聚合酶(5U/μL) 0.5
模板DNA 10

[0076] (3)最适反应条件：

[0077] 针对Roche Light Cycler480Ⅱ荧光PCR检测仪，第一阶段：94℃/3min；第二阶段：94℃/15s，54℃/15s，60℃/30s，40个循环，60℃延伸时收集荧光。

[0078] (4)结果的判定：在FAM通道内荧光PCR扩增曲线呈典型的“S”型曲线且Ct≤30.0，判断为RGV、STIV、FV3、BIV、TFV、ADIV、EHNV、ECV和ESV病毒中的某一种为阳性，如图2，具体鉴定到种需要进一步的实验确认；在HEX通道内荧光PCR扩增曲线呈典型的“S”型曲线且Ct≤30.0，判断为LMBV、DFV和GV6病毒中某一种为阳性，如图3，具体鉴定到种需要进一步的实验确认；在CY5通道内荧光PCR扩增曲线呈典型的“S”型曲线且Ct≤30.0，判断为SGIV病毒阳性，如图4；无典型的“S”型扩增曲线或Ct﹥30.0判断为蛙病毒属病毒阴性。

[0079] 实施例4：三重荧光PCR的灵敏性试验

[0080] 采用实施例3试剂盒的方法，提取FV3、BIV、EHNV、ADIV、STIV、LMBV、SGIV等毒株的核酸DNA，十倍连续梯度稀释DNA，Ct值随DNA浓度梯度减少而呈梯度改变，如图5为FV32
核酸十倍连续梯度稀释后的PCR扩增曲线图，可检测到核酸的最低浓度为10拷贝/μl，病毒BIV、EHNV、ADIV和STIV的灵敏性试验结果与FV3的灵敏性试验结果一致，可检测到的最
2
低浓度均为10拷贝/μl；图6为LMBV核酸十倍连续梯度稀释后的PCR扩增曲线图，可检
2
测到核酸的最低浓度为10拷贝/μl；图7为SGIV核酸十倍连续梯度稀释后的PCR扩增曲
2
线图，可检测到核酸的最低浓度为10拷贝/μl。试验结果表明，本发明的试剂盒对于蛙病毒属病毒的诊断具有高度的灵敏性。

[0081] 实施例5：三重荧光PCR的特异性试验

[0082] 采用实施例3试剂盒的方法，为了进行特异性实验，提取其他水生动物病毒包括鱼类病毒IHN、VHS、ISA核酸RNA，然后反转录为cDNA作为三重荧光PCR扩增的模板，检测结果表明，FAM通道仅对FV3、BIV、EHNV、ADIV、STIV病毒进行扩增，如图8为FV3的特异性试验结果图，BIV、EHNV、ADIV和STIV的特异性试验结果与FV3的特异性试验结果一致；HEX通道仅对LMBV病毒进行扩增(图9)；CY5通道仅对SGIV病毒进行扩增(图10)。表明本发明检测试剂盒能对蛙病毒属病毒进行特异性扩增，不仅设计的3条探针无交叉反应，而且不与其他病毒核酸发生交叉反应。