一种海水鱼内生吗啡的检测方法及其检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种海水鱼内生吗啡的检测方法及其检测试剂盒，主要采用直接竞争酶联免疫测定法，将以前酶联免疫法中繁琐的操作步骤进行精简、优化，检测快速、灵敏、准确，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品。

权利要求

1.一种海水鱼内生吗啡的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）样品前处理

取海水鱼的脑部神经节，用甲醇清洗，沥干，然后将脑部神经节撕碎，称取0.2±0.05g撕碎的脑部神经节，加入0.5-2mL甲醇，70-75℃水浴2-3小时，冷却至室温，离心，取上清液于冷冻离心浓缩机中离心直至液体挥发完全，残渣用100-200μL样品稀释液稀释，振荡器上振荡充分溶解得样品溶液；

（2）试剂盒检测

包被有吗啡特异性抗体的酶标板上的微孔编号：将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品做两孔平行，并记录样品孔和标准品孔所在位置；

将样品溶液和吗啡标准品溶液均按照每孔20-30μL的量加到对应微孔中，然后加入吗啡抗原酶标记物100-120μL/孔，室温孵育30-35分钟后倒去孔内液体，用洗涤液

250-300μL/孔洗涤3-5次，加入显色剂100-120μL/孔，室温孵育10-15分钟，然后加终止液100-120μL/孔终止，酶标仪450nm下测定每孔的吸光度值；

（3）结果分析

以标准品百分吸光率为纵坐标，以吗啡标准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线图，将样品的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样品所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样品中内生吗啡的实际含量。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述样品稀释液为pH7.4、0.01mol/L 的磷酸盐缓冲液。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：所述吗啡抗原酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶。

4.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：所述显色剂为四甲基联苯胺。

5.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：所述终止液为浓度为2mol/L的硫酸溶液或浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：包被有吗啡特异性抗体的酶标板制备方法为：用包被缓冲液将吗啡单克隆抗体稀释至1μg/mL得包被液，酶标板每孔加入

100μL包被液，37℃孵育2h或者4℃过夜，倒去包被液，用洗涤液洗涤3次，拍干，然后每孔中加入200μL封闭液，37℃温育2h，倒去孔内液体，干燥后得包被有吗啡特异性抗体的酶标板。

7.根据权利要求1或6所述的检测方法，其特征在于：所述洗涤液为含有体积分数

0.5%吐温-20的pH7.4、0.01mol/L 的磷酸盐缓冲液稀释10倍后所得。

8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述包被缓冲液为pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液；所述封闭液为含有3wt%的聚乙二醇、1 wt %的酪蛋白、4 wt %的甘氨酸、1 wt %的卵清蛋白及1 wt %的明胶的磷酸盐缓冲液。

9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述吗啡单克隆抗体的制备方法为：A、吗啡抗原的合成

称取吗啡原料500mg，加入50mL苯和1g琥珀酸酐，加热回流8h，蒸发除去苯，残留物分别用无水乙醚、无水乙醇洗涤，然后真空干燥，即得到粉末状的6-琥珀酸-吗啡，称取6-琥珀酸-吗啡20mg溶于10mL PBS缓冲液中，加入30μL三乙胺，再加入30μL氯甲酸异丁酯，反应半小时得反应液；称取20mg BSA溶解于10mLPBS缓冲液中，加入上述反应液，搅拌反应过夜，透析3天，离心，收集上清液，得到吗啡抗原；

B、取 6-8 周龄雌性 BALB/c 小鼠六只，将PBS 缓冲液与等体积弗氏完全佐剂混合，充分乳化后，采用腹腔注射的方法进行免疫，按1mg/kg体重的量进行首次免疫，用弗氏不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，采用与首次免疫相同的方法每隔两周加强免疫一次，共加强免疫四次，从第三次免疫开始，每次免疫后7天，小鼠尾静脉取血1mL，进行抗体效价检测，选择经ELISA检测效价最高的BALB/c小鼠用于制备脾细胞，3 天后取效价最高的BALB/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选获得杂交瘤细胞；另一批BALB/c小鼠腹腔注射 0.5mL 6

液体石蜡致敏，7-14 天后向小鼠腹腔内注射 1×10个杂交瘤细胞， 7-10 天后开始用注射器从小鼠腹腔抽取腹水，之后每隔 1-3 天抽取腹水 1次，离心，收集上清液，-20℃保存，进一步采用辛酸-硫酸铵法纯化上清液获得吗啡单克隆抗体。

10.一种用于权利要求1所述检测方法的海水鱼内生吗啡检测试剂盒，其特征在于，包括如下组分：

1、吗啡标准品溶液，浓度分别为：0 ng/mL，1.25 ng/mL，2.5 ng/mL，5 ng/mL，10 ng/mL，

20 ng/mL；

2、包被有吗啡特异性抗体的酶标板；

3、吗啡抗原酶标记物；

4、显色剂：四甲基联苯胺；

5、浓缩洗涤液10×：含有体积分数0.5%吐温-20的pH7.4、0.01mol/L 的磷酸盐缓冲液；

6、终止液：浓度为2mol/L的硫酸溶液或浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液；

7、样品稀释液：pH7.4、0.01mol/L 的磷酸盐缓冲液。

说明书

一种海水鱼内生吗啡的检测方法及其检测试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及生化检测技术领域，特别涉及一种海水鱼内生吗啡的检测方法及其检测试剂盒。

背景技术

[0002] 人们通常认为吗啡对高等哺乳动物而言是剧烈的毒品，仅能从植物中提取。但是经过深入研究表明，在低等软体动物和高等哺乳动物中，除神经肽，氨基酸及其他小分子神经介质传递机制外，还存在以内生吗啡类物质为介质的神经传递机制。人们的痛觉、精神上的愉快和抑郁以及生理上的快感，在一定程度上取决于大脑产生内生吗啡的多少，因此，内生吗啡的产生、增加及减少，在一些特定的情况下对疼痛有着不同的反应和感觉。

[0003] 之前的研究发现贻贝、龙虾等海洋软体动物神经节自身可产生微量的内生吗啡；在大白鼠大脑区的杏仁核区内存在内生吗啡，而且内生吗啡可使杏仁核区产生一氧化氮；
在人的白细胞中也能检测到微量的内生吗啡。目前报道用于检测内生吗啡的方法主要高效液相色谱 (HPLC)、高效液相色谱-质谱联用法 (HPLC/MS)。色谱法是目前国际上普遍采用的检测方法，灵敏度高、准确性好，常作为药物残留检测的确认方法，但其对仪器和操作人员要求都较高，成本也比较高，一个样品检测要几百元，检测时间也很长，不利于在基层单位推广使用。免疫分析法是国际上通用的一种生化方法。目前常用的胶体金法受所用的生物制剂的影响，假阳性出现的概率很高，而且由于胶体金法灵敏度低，颜色判断有人为因素致使准确性差。

[0004] 因此建立一种快速、灵敏、准确，并可以大批量应用于内生吗啡检测的方法是具有非常重要的现实意义。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种海水鱼内生吗啡的检测方法，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品，主要采用直接竞争酶联免疫测定法，将以前酶联免疫法中繁琐的操作步骤进行精简、优化，检测快速、灵敏、准确。

[0006] 本发明还提供了一种海水鱼内生吗啡检测试剂盒，试剂盒具有保存时间长、自动化程度高、成本低、无放射性同位素污染、快速简便、灵敏度高、准确可靠等特点。

[0007] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

[0008] 一种海水鱼内生吗啡的检测方法，包括以下步骤：

[0009] （1）样品前处理

[0010] 取海水鱼的脑部神经节，用甲醇清洗，沥干，然后将脑部神经节撕碎，称取0.2±0.05g撕碎的脑部神经节，加入0.5-2ml甲醇，70-75℃水浴2-3小时，冷却至室温，离心，取上清液于冷冻离心浓缩机中离心直至液体挥发完全，残渣用100-200μl样品稀释液稀释，振荡器上振荡充分溶解得样品溶液。

[0011] 现有高效液相色谱的处理样品的方法用于本发明的检测样品的处理，无法检测到内生吗啡，因此，本发明首先改进了样品的前处理方法，以适合于下一步的试剂盒的检测。

[0012] （2）试剂盒检测

[0013] 包被有吗啡特异性抗体的酶标板上的微孔编号：将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品做两孔平行，并记录样品孔和标准品孔所在位置；

[0014] 将样品溶液和吗啡标准品溶液均按照每孔20-30μl的量加到对应微孔中，然后加入吗啡抗原酶标记物100-120μl/孔，室温孵育30-35分钟后倒去孔内液体，用洗涤液250-300μl/孔洗涤3-5次，加入显色剂100-120μl/孔，室温孵育10-15分钟，然后加终止液100-120μl/孔终止，酶标仪450nm下测定每孔的吸光度值。

[0015] （3）结果分析

[0016] 以标准品百分吸光率为纵坐标，以吗啡标准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线图，将样品的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样品所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样品中内生吗啡的实际含量。

[0017] 作为优选，所述样品稀释液为pH7.4、0.01mol/L 的磷酸盐缓冲液。

[0018] 作为优选，所述吗啡抗原酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶。

[0019] 作为优选，所述显色剂为四甲基联苯胺。

[0020] 作为优选，所述终止液为浓度为2mol/L的硫酸溶液或浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液。

[0021] 作为优选，包被有吗啡特异性抗体的酶标板制备方法为：用包被缓冲液将吗啡单克隆抗体稀释至1μg/ml得包被液，酶标板每孔加入100μl包被液，37℃孵育2h或者4℃过夜，倒去包被液，用洗涤液洗涤3次，拍干，然后每孔中加入200μl封闭液，37℃温育2h，倒去孔内液体，干燥后得包被有吗啡特异性抗体的酶标板。

[0022] 作为优选，所述洗涤液为含有体积分数0.5%吐温-20的pH7.4、0.01mol/L 的磷酸盐缓冲液稀释10倍后所得。

[0023] 作为优选，所述包被缓冲液为pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液；所述封闭液为含有3wt%的聚乙二醇、1 wt %的酪蛋白、4 wt %的甘氨酸、1 wt %的卵清蛋白及1 wt %的明胶的磷酸盐缓冲液。

[0024] 作为优选，所述吗啡单克隆抗体的制备方法为：

[0025] A、吗啡抗原的合成

[0026] 称取吗啡原料500mg，加入50mL苯和1g琥珀酸酐，加热回流8h，蒸发除去苯，残留物分别用无水乙醚、无水乙醇洗涤，然后真空干燥，即得到粉末状的6-琥珀酸-吗啡，称取6-琥珀酸-吗啡20mg溶于10ml PBS缓冲液中，加入30μl三乙胺，再加入30μl氯甲酸异丁酯，反应半小时得反应液；称取20mg BSA溶解于10ml PBS缓冲液中，加入上述反应液，搅拌反应过夜，透析3天，离心，收集上清液，得到吗啡抗原；

[0027] B、取 6-8 周龄雌性 BALB/c 小鼠六只，将PBS 缓冲液与等体积弗氏完全佐剂混合，充分乳化后，采用腹腔注射的方法进行免疫，按1mg/kg体重的量进行首次免疫，用弗氏不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，采用与首次免疫相同的方法每隔两周加强免疫一次，共加强免疫四次，从第三次免疫开始，每次免疫后7天，小鼠尾静脉取血1ml，进行抗体效价检测，选择经ELISA检测效价最高的BALB/c小鼠用于制备脾细胞，3 天后取效价最高的BALB/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选获得杂交瘤细胞；另一批BALB/c小鼠腹腔6
注射 0.5mL 液体石蜡致敏，7-14 天后向小鼠腹腔内注射 1×10个杂交瘤细胞， 7-10 天后开始用注射器从小鼠腹腔抽取腹水，之后每隔 1-3 天抽取腹水 1次，离心，收集上清液，-20℃保存，进一步采用辛酸-硫酸铵法纯化上清液获得吗啡单克隆抗体。

[0028] 用弗氏不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，采用与首次免疫相同的方法每隔两周加强免疫一次即将PBS 缓冲液与等体积弗氏不完全佐剂混合，充分乳化后，采用腹腔注射的方法进行免疫，按1mg/kg体重的量进行加强免疫。

[0029] 根据本发明上述方法制备的吗啡单克隆抗体，特异性好，检测效果佳。

[0030] 一种海水鱼内生吗啡检测试剂盒，包括如下组分：

[0031] 1、吗啡标准品溶液，浓度分别为：0 ng/ml，1.25 ng/ml，2.5 ng/ml，5 ng/ml，10 ng/ml，20 ng/ml；

[0032] 2、包被有吗啡特异性抗体的酶标板；

[0033] 3、吗啡抗原酶标记物；

[0034] 4、显色剂：四甲基联苯胺；

[0035] 5、浓缩洗涤液10×：含有体积分数0.5%吐温-20的pH7.4、0.01mol/L 的磷酸盐缓冲液；

[0036] 6、终止液：浓度为2mol/L的硫酸溶液或浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液；

[0037] 7、样品稀释液：pH7.4、0.01mol/L 的磷酸盐缓冲液。

[0038] 本发明的有益效果是：

[0039] 1、本发明方法可以定性、定量检测海水鱼中内生吗啡的含量，对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品。

[0040] 2、主要采用直接竞争酶联免疫测定法，将以前酶联免疫法中繁琐的操作步骤进行精简、优化，主要试剂又以溶液的形式提供，可减少试剂盒的操作步骤，为使用者节省时间并降低因操作步骤繁琐而造成的误差。

[0041] 3、试剂盒保存时间长、自动化程度高、成本低、无放射性同位素污染等优点。

[0042] 4、具有高特异性、高灵敏度、高准确度等特点，将在内生吗啡检测中发挥重要作用。

附图说明

[0043] 图1是本发明吗啡标准品的标准曲线图。

具体实施方式

[0044] 下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

[0045] 本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

[0046] 一种海水鱼内生吗啡检测试剂盒，包括如下组分：

[0047] 1、吗啡标准品溶液，浓度分别为：0 ng/ml，1.25 ng/ml，2.5 ng/ml，5 ng/ml，10 ng/ml，20 ng/ml。

[0048] 2、包被有吗啡特异性抗体的酶标板，1块，96孔。

[0049] 3、吗啡抗原酶标记物，吗啡抗原酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶。

[0050] 4、显色剂：四甲基联苯胺（市售）。

[0051] 5、浓缩洗涤液10×：含有体积分数0.5%吐温-20的pH7.4、0.01mol/L 的磷酸盐缓冲液（PBS）。

[0052] 浓缩洗涤液10×的配制为：将0.5ml吐温-20与pH7.4、0.01mol/L 的磷酸盐缓冲液99.5ml混合均匀。

[0053] 6、终止液：浓度为2mol/L的硫酸溶液或浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液。

[0054] 7、样品稀释液：pH7.4、0.01mol/L 的磷酸盐缓冲液（PBS，市售）。

[0055] 洗涤液的配制为：用去离子水将浓缩洗涤液10×按1:9体积比进行稀释，即：1份浓缩洗涤液10×+9份去离子水；用于酶标板的洗涤，洗涤液在4℃环境可保存一个月。

[0056] 一、包被有吗啡特异性抗体的酶标板制备方法为：

[0057] 溶液准备：

[0058] 1、包被缓冲液为pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液（市售）。

[0059] 2、封闭液：3g聚乙二醇+1g酪蛋白+4g甘氨酸+1g卵清蛋白+1g明胶+90g磷酸盐缓冲液（pH7.4，0.01mol/L）混合而成得到含有3wt%的聚乙二醇、1 wt %的酪蛋白、4 wt %的甘氨酸、1 wt %的卵清蛋白及1 wt %的明胶的磷酸盐缓冲液。

[0060] 用包被缓冲液将吗啡单克隆抗体稀释至1μg/ml得包被液，酶标板每孔加入100μl包被液，37℃孵育2h或者4℃过夜，倒去包被液，用洗涤液洗涤3次，拍干，然后每孔中加入200μl封闭液，37℃温育2h，倒去孔内液体，干燥后得包被有吗啡特异性抗体的酶标板。

[0061] 二、吗啡单克隆抗体的制备方法为：

[0062] A、吗啡抗原的合成

[0063] 称取吗啡原料500mg，加入50mL苯和1g琥珀酸酐，加热回流8h，蒸发除去苯，残留物分别用无水乙醚、无水乙醇洗涤，然后真空干燥，即得到粉末状的6-琥珀酸-吗啡，称取6-琥珀酸-吗啡20mg溶于10ml PBS缓冲液（20 mmol/L NaH2PO4, 20 mmol/L Na2HPO4, 150 mmol/L NaCl; pH 7.2）中，加入30μl三乙胺，再加入30μl氯甲酸异丁酯，反应半小时得反应液；称取20mg BSA溶解于10ml PBS缓冲液（20 mmol/L NaH2PO4, 20 mmol/L Na2HPO4,
150 mmol/L NaCl; pH 7.2）中，加入上述反应液，搅拌反应过夜，透析3天，离心，收集上清液，得到吗啡抗原。

[0064] B、取 6-8 周龄雌性 BALB/c 小鼠六只（浙江大学实验动物中心提供），将PBS 缓冲液（20 mmol/L NaH2PO4, 20 mmol/L Na2HPO4, 150 mmol/L NaCl; pH 7.2）与等体积弗氏完全佐剂（市售）混合，充分乳化后，采用腹腔注射的方法进行免疫，按1mg/kg体重的量进行首次免疫，用弗氏不完全佐剂（市售）代替弗氏完全佐剂，采用与首次免疫相同的方法每隔两周加强免疫一次，共加强免疫四次，从第三次免疫开始，每次免疫后7天，小鼠尾静脉取血1ml，进行抗体效价检测，选择经ELISA检测（现有方法）效价最高的BALB/c小鼠用于制备脾细胞，3 天后取效价最高的BALB/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞（市售）融合，筛选获得杂交瘤细胞（融合及筛选均为现有常规方法）；另一批BALB/c小鼠腹腔注射 0.5mL 液6
体石蜡致敏，7-14 天后向小鼠腹腔内注射 1-2×10个杂交瘤细胞， 7-10 天后开始用注射器从小鼠腹腔抽取腹水，之后每隔 1-3 天抽取腹水 1次，4000rmp离心15min，收集上清液，-20℃保存，进一步采用辛酸-硫酸铵法（现有方法）纯化上清液获得吗啡单克隆抗体。

[0065] 三、吗啡抗原酶标记物的制备：

[0066] 称取辣根过氧化物酶25mg溶于1.25%戊二醛溶液中，于室温静置过夜，经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱，流速控制在1ml/min，收集棕色流出液，以聚二乙醇浓缩至5ml得浓缩液。称取12.5mg的吗啡抗原，用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入上述浓缩液中。然后加入1mol/L的碳酸盐缓冲液 0.25ml，持续搅拌3h，加0.2mol/L的赖氨酸溶液0.25ml，混匀后置于室温2h。在搅拌下逐滴加入等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃放置1h。3000r/min离心半小时，弃上清，沉淀用半饱和硫酸铵溶液洗两次后用0.15mol/L的PBS缓冲液溶解，之后装入透析袋中，用0.15mol/L的PB缓冲液S透析，去除铵离子后，10000r/min离心半小时去除沉淀，上清液即为吗啡抗原酶标记物。

[0067] 实施例1：

[0068] 一种海水鱼内生吗啡的检测方法，包括以下步骤：

[0069] （1）样品前处理

[0070] 取大黄鱼的脑部神经节，用甲醇（分析纯）清洗，沥干，然后用镊子将脑部神经节撕碎，称取0.2±0.05g撕碎的脑部神经节，加入0.5ml甲醇，70℃水浴3小时，冷却至室温，5000rpm离心2min，取上清液于冷冻离心浓缩机（Labconco CentriVap，美国）中10000rpm离心直至液体挥发完全，残渣用100μl样品稀释液稀释，振荡器上振荡充分溶解得样品溶液。

[0071] （2）试剂盒检测

[0072] 包被有吗啡特异性抗体的酶标板上的微孔编号：将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品做两孔平行，并记录样品孔和标准品孔所在位置；

[0073] 将样品溶液和吗啡标准品溶液均按照每孔20μl的量加到对应微孔中，然后加入吗啡抗原酶标记物100μl/孔，室温孵育30分钟后倒去孔内液体，使得待测样品中的内生吗啡与酶标记的竞争酶标板上的吗啡抗体有效结合，用洗涤液250μl/孔洗涤5次，除去未结合的酶标记物，加入显色剂100μl/孔，室温孵育10分钟，然后加终止液（2mol/L的硫酸溶液）100/孔终止，酶标仪450nm下测定每孔的吸光度值。

[0074] （3）结果分析

[0075] 百分吸光率的计算，标准品或样品的百分吸光率等于标准品或样品的吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即

[0076]

[0077] B—标准品或样品溶液的平均吸光度值。

[0078] B0—0标准品的吸光度值。

[0079] 以标准品百分吸光率为纵坐标，以吗啡标准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线图（如图1所示），步骤（2）获得的吸光度值与样品中内生吗啡的量呈负关系，将样品的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样品所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样品中内生吗啡的实际含量，经计算，大黄鱼脑中内生吗啡的含量为33.52 ng/ml。

[0080] 实施例2：

[0081] 一种海水鱼内生吗啡的检测方法，包括以下步骤：

[0082] （1）样品前处理

[0083] 取大黄鱼的脑部神经节，用甲醇（分析纯）清洗，沥干，然后用镊子将脑部神经节撕碎，称取0.2±0.05g撕碎的脑部神经节，加入2ml甲醇， 75℃水浴2小时，冷却至室温，5000rpm离心2min，取上清液于冷冻离心浓缩机（Labconco CentriVap，美国）中10000rpm离心直至液体挥发完全，残渣用200μl样品稀释液稀释，振荡器上振荡充分溶解得样品溶液。

[0084] （2）试剂盒检测

[0085] 包被有吗啡特异性抗体的酶标板上的微孔编号：将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品做两孔平行，并记录样品孔和标准品孔所在位置；

[0086] 将样品溶液和吗啡标准品溶液均按照每孔30μl的量加到对应微孔中，然后加入吗啡抗原酶标记物120μl/孔，室温孵育35分钟后倒去孔内液体，使得待测样品中的内生吗啡与酶标记的竞争酶标板上的吗啡抗体有效结合，用洗涤液300μl/孔洗涤3次，除去未结合的酶标记物，加入显色剂120μl/孔，室温孵育15分钟，然后加终止液（2mol/L的氢氧化钠溶液）120μl/孔终止，酶标仪450nm下测定每孔的吸光度值。

[0087] （3）结果分析

[0088] 以标准品百分吸光率为纵坐标，以吗啡标准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线图（如图1所示），步骤（2）获得的吸光度值与样品中内生吗啡的量呈负关系，将样品的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样品所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样品中内生吗啡的实际含量，经计算，大黄鱼脑中内生吗啡的含量为34.29 ng/ml。

[0089] 实施例3：

[0090] 一种海水鱼内生吗啡的检测方法，包括以下步骤：

[0091] （1）样品前处理

[0092] 取大黄鱼的脑部神经节，用甲醇（分析纯）清洗，沥干，然后用镊子将脑部神经节撕碎，称取0.2±0.05g撕碎的脑部神经节，加入1ml甲醇，72℃水浴2.5小时，冷却至室温，5000rpm离心2min，取上清液于冷冻离心浓缩机（Labconco CentriVap，美国）中10000rpm离心直至液体挥发完全，残渣用150μl样品稀释液稀释，振荡器上振荡充分溶解得样品溶液。

[0093] （2）试剂盒检测

[0094] 包被有吗啡特异性抗体的酶标板上的微孔编号：将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品做两孔平行，并记录样品孔和标准品孔所在位置；

[0095] 将样品溶液和吗啡标准品溶液均按照每孔20μl的量加到对应微孔中，然后加入吗啡抗原酶标记物100μl/孔，室温孵育30分钟后倒去孔内液体，使得待测样品中的内生吗啡与酶标记的竞争酶标板上的吗啡抗体有效结合，用洗涤液300μl/孔洗涤3次，除去未结合的酶标记物，加入显色剂100μl/孔，室温孵育12分钟，然后加终止液（2mol/L的硫酸溶液）100μl/孔终止，酶标仪450nm下测定每孔的吸光度值。

[0096] （3）结果分析

[0097] 以标准品百分吸光率为纵坐标，以吗啡标准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线图（如图1所示），步骤（2）获得的吸光度值与样品中内生吗啡的量呈负关系，将样品的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样品所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样品中内生吗啡的实际含量，经计算，大黄鱼脑中内生吗啡的含量为33.39 ng/ml。

[0098] 本发明样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品，检测快速、灵敏、准确。

[0099] 本发明的海水鱼内生吗啡检测试剂盒，保存时间长（有效期12个月），成本低，无放射性同位素污染，检测快速、灵敏、准确。

[0100] 以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。