一种化合物及其应用于单胺氧化酶活性的荧光检测方法

摘要

本发明公开了一种式(i1)或式(i2)所示的化合物及其制备方法，所述的化合物可作为荧光探针，应用于单胺氧化酶活性的荧光检测；本发明所述化合物的制备所需要的设备简单，操作过程简便，原料来源都已商品化容易得到，并且所制备的化合物作为单胺氧化酶的荧光探针性质很稳定，纯度也很高；本发明提供的荧光探针在用于单胺氧化酶活性的荧光检测方法时，与以前所用的检测单胺氧化酶活性的基本方法相比，其精确度、灵敏度都有很大的提高。

权利要求

1.一种如式(i1)或式(i2)所示的化合物：

式(i1)中，R1为如式(ii)所示的基团；式(i2)中，R2为如式(iii)所示的基团：

2.如权利要求1所述的式(i1))所示化合物的制备方法，其特征在于所述的制备方法包括如下步骤：(a)间苯二酚和偏苯三酸酐反应，得到式(A)所示的5(6)-羧基荧光素；

(b)有机溶剂中，步骤(a)得到的式(A)所示的5(6)-羧基荧光素在碱性物质的作用下同碘甲烷反应，得到式(B)所示的甲基化荧光素；所述的碱性物质为无机碱性物质或有机碱性物质；

(c)步骤(b)得到的式(B)所示的甲基化荧光素与硼氢化钠进行还原反应后，所得还原产物同1-甲基-4-溴-吡啶碘盐在碱性条件下反应得到式(D)所示的化合物；

(d)步骤(c)得到的式(D)所示的化合物同硼氢化钠进行还原反应后得到式(C)所示的化合物；

(e)步骤(d)得到的式(C)所示化合物在碱性条件下反应生成式(F)所示的化合物；

(f)CY3-COOH与N-Boc-乙二胺在碱性条件下反应得到式(I)所示的化合物；

(g)步骤(f)得到的式(I)所示化合物在TFA的作用下生成式(H)所示的化合物；

(h)步骤(g)得到的式(H)所示化合物与步骤(e)得到的式(F)所示化合物反应生成式(i1)所示的化合物；

式(C)、式(F)中，R1为如式(ii)所示的基团；式(D)中，R3为如式(iv)所示的基团：

3.如权利要求2所述的式(i1)所示化合物的制备方法，其特征在于所述的制备方法包括如下步骤：(a)间苯二酚和偏苯三酸酐在甲磺酸溶液中回流反应8小时后，将反应液倒入碎冰中析出固体后过滤，取滤饼得到式(A)所示的5(6)-羧基荧光素；

(b)有机溶剂DMF中，步骤(a)得到的式(A)所示的5(6)-羧基荧光素在碱性物质碳酸钾的作用下，同碘甲烷常温搅拌反应过夜，得到式(B)所示的甲基化荧光素；

(c)步骤(b)得到的式(B)所示的甲基化荧光素在甲醇溶液中与硼氢化钠在冰浴条件下进行还原反应30分钟后，再同1-甲基-4-溴-吡啶碘盐在碱性条件下过夜反应得到式(D)所示的化合物，所述的碱性物质为有机碱性物质吡啶或无机碱性物质碳酸钾；

(d)步骤(c)得到的式(D)所示的化合物在甲醇溶液中同硼氢化钠在冰浴条件下进行还原反应30分钟后得到式(C)所示的化合物；

(e)步骤(d)得到的式(C)所示化合物在NaOH的作用下，于甲醇水溶液中回流反应4小时后生成式(F)所示的化合物；

(f)在有机溶剂DMF中，CY3-COOH同N-Boc-乙二胺在HoBt、EDC、Et3N碱性条件下常温过夜反应得到式(I)所示的化合物；

(g)步骤(f)得到的式(I)所示化合物在TFA的作用下常温反应2小时后脱Boc生成式(H)所示的化合物；

(h)步骤(g)得到的式(H)所示化合物同步骤(e)生成的式(F)所示化合物在HoBt、EDC、Et3N碱性条件下常温过夜反应生成式(i1)所示的化合物。

4.如权利要求3所述的式(i1)所示化合物的制备方法，其特征在于所述的步骤(h)中，式(i1)所示化合物的分离纯化方法为：反应结束后，反应液中加入饱和NaCl水溶液，用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，取有机层经过无水硫酸钠干燥、过滤、蒸干溶剂，即得式(i1)所示的化合物粗品，式(i1)所示的化合物粗品进行柱层析分离提纯，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇体积比10:1的混合液，收集含目标化合物的洗脱液，浓缩干燥得到式(i1)所示的化合物纯品。

5.如权利要求1所述的式(i1)或式(i2)所示的化合物作为荧光探针，应用于单胺氧化酶活性的荧光检测。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的单胺氧化酶活性的荧光检测的方法为：以式(i1)或式(i2)所示的化合物作为荧光探针，单胺氧化酶水解荧光探针形成荧光物质，测定荧光强度，从而获得单胺氧化酶活性强度。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的单胺氧化酶活性的荧光检测的方法为：先将待测单胺氧化酶样品溶于浓度50mM，pH值为7.4的PBS缓冲液中得到浓度为3μg/mL待测单胺氧化酶的样品溶液，然后所述的待测单胺氧化酶的样品溶液按体积比55:143加入pH值为7.4～9的硼酸缓冲液中，接着加入荧光探针的DMSO溶液，得到反应液，将反应液立即加入96孔筛板中，观测荧光强度变化，获得单胺氧化酶活性强度数据；所述方法中加入荧光探针的DMSO溶液的量要使反应液中荧光探针的终浓度为50～200μmol/L。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的单胺氧化酶活性的荧光检测的方法为：在离心管中，先将待测单胺氧化酶样品溶于浓度50mM，pH值为7.4的PBS缓冲液中得到浓度为3μg/mL待测单胺氧化酶的样品溶液，然后将所述的待测单胺氧化酶的样品溶液按体积比55:143加入浓度50mM、pH值为8.4的硼酸缓冲液中，接着加入荧光探针的DMSO溶液，得到荧光探针的终浓度为50～200μmol/L的反应液，将反应液立即加入96孔筛板中，并用酶标仪在37℃下检测荧光强度，分析荧光强度与时间的关系后获得单胺氧化酶活性强度数据。

说明书

一种化合物及其应用于单胺氧化酶活性的荧光检测方法

(一)技术领域

[0001] 本发明涉及一种新化合物，所述的化合物可以作为荧光探针，应用于单胺氧化酶活性的荧光检测方法中。(二)背景技术

[0002] 单胺氧化酶(EC1.4.3.4；amine-oxygen oxidoreductases)是多巴胺氧化代谢中一种重要的酶类，它在神经递质代谢中起着重要的作用，主要的代谢过程是催化不同结构的胺(神经递质多巴胺、去甲肾上腺素、5-羟色胺、酪胺、2-苯基乙胺以及神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)，并氧化脱氨产生H2O2。

[0003] 单胺氧化酶B主要代谢不含羟基的胺类物质，如苯乙胺和苄胺等。经发现，单胺氧化酶B异常可能导致一系列精神疾病，例如帕金森综合症、老年痴呆症、酒精中毒和神经退化等。帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的精神性疾病，主要表现为黑质致密部多巴胺能神经元丢失、纹状体多巴胺减少的特征。MAO-B能够将1-甲基-4-苯基-1，+2，3，6-四氢吡啶转化为具有毒性的l-甲基-4-苯基-吡啶盐离子(MPP)，而后者是一种能够破坏黑纹神经元的物质。老年痴呆症(Alzheimer's disease,AD)是中枢神经系统退行性变的一种表现，通过对AD死者的研究发现其MAO-B活性十分地低。同时，随着年龄的增加，脑内MAO-B的活性会升高，这说明MAO-B的活性与机体的寿命有一定的关系。

[0004] 目前有多种方法检测单胺氧化酶的活性：紫外法，分光光度法,放射性法以及荧光法等。前两种方法的灵敏度不高，而放射性法虽具有较高的灵敏度，但是它需要放射性标记的化合物，操作上有一定的危险性。而荧光探针作为一种非放射性的标记技术，因其具有较好的安全性和较高的灵敏度而被广泛应用于细胞内、外酶蛋白活性的检测。

[0005] FRET是指两个荧光发射基团在一定的距离范围内，当能量供体吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，通过偶极-偶极相互作用，以非辐射的形式将转移给临近的受体分子的过程。FRET分子较于其他荧光探针而言，有以下两个优点：1)能实现更大的stokes位移，从而减少背景信号的干扰。2)能够进行比率检测，即两个荧光发射强度或吸收强度的比值随着底物的变化而变化，从而通过强度比值的变化提高动态响应的范围，建立内标，削弱其他因素的干扰。因此，构建实用的FRET体系来检测目标分子具有深远的意义。(三)发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种化合物，并将所述的化合物作为荧光探针应用于单胺氧化酶活性的荧光检测，作为荧光探针的化合物为新化合物，并且其制备方法简单，性质稳定，检测的精确度、准确度高。

[0007] 本发明采用的技术方案如下：

[0008] 本发明提供了一种如式(i1)或式(i2)所示的化合物：

[0009]

[0010] 式(i1)中，R1为如式(ii)所示的荧光基团；式(i2)中，R2为如式(iii)所示的荧光基团：

[0011]

[0012] 本发明还提供了一种式(i1)、式(i2)所示化合物的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：

[0013] (a)间苯二酚和偏苯三酸酐反应，得到式(A)所示的5(6)-羧基荧光素；

[0014] (b)有机溶剂中，步骤(a)得到的式(A)所示的5(6)-羧基荧光素在碱性物质的作用下同碘甲烷反应，得到式(B)所示的甲基化荧光素；所述的碱性物质为无机碱性物质或有机碱性物质；

[0015] (c)步骤(b)得到的式(B)所示的甲基化荧光素与硼氢化钠进行还原反应后，所得还原产物分别同式(iv)和式(v)所示化合物在碱性条件下反应得到式(D)和式(E)所示的化合物；

[0016] (d)步骤(c)得到的式(D)所示的化合物同硼氢化钠进行还原反应后得到式(C)所示的化合物；

[0017] (e)步骤(d)和(c)得到的式(C)和式(E)所示化合物分别在碱性条件下反应生成式(F)和式(G)所示的化合物；

[0018] (f)CY3-COOH与N-Boc-乙二胺在碱性条件下反应得到式(I)所示的化合物；

[0019] (g)步骤(f)得到的式(I)所示化合物在TFA的作用下生成式(H)所示的化合物；

[0020] (h)步骤(g)得到的式(H)所示化合物分别与步骤(e)得到的式(F)、式(G)所示化合物反应生成式(i1)和式(J)所示的化合物，式(J)所示化合物在TFA的作用下生成式(i2)所示的化合物；

[0021]

[0022] 式(C)、式(F)中，R1为如式(ii)所示的荧光基团；式(D)中，R3为如式(iv)所示的荧光基团；式(E)、式(G)、式(J)中，R4为如式(v)所示的荧光基团：

[0023]

[0024] 较为具体的，本发明式(i1)、式(i2)所示化合物的制备方法包括如下步骤：

[0025] (a)间苯二酚和偏苯三酸酐在甲磺酸溶液中回流反应8小时后，将反应液倒入碎冰中析出固体后过滤，取滤饼得到式(A)所示的5(6)-羧基荧光素；

[0026] (b)有机溶剂DMF中，步骤(a)得到的式(A)所示的5(6)-羧基荧光素在碱性物质碳酸钾的作用下，同碘甲烷常温搅拌反应过夜，得到式(B)所示的甲基化荧光素；

[0027] (c)步骤(b)得到的式(B)所示的甲基化荧光素在甲醇溶液中与硼氢化钠在冰浴条件下进行还原反应30分钟后，再分别同式(iv)和式(v)所示化合物在碱性条件下过夜反应得到式(D)和式(E)所示的化合物，所述的碱性物质为有机碱性物质吡啶或无机碱性物质碳酸钾；

[0028] (d)步骤(c)得到的式(D)所示的化合物在甲醇溶液中同硼氢化钠在冰浴条件下进行还原反应30分钟后得到式(C)所示的化合物；

[0029] (e)步骤(d)和(c)得到的式(C)和式(E)所示化合物分别在NaOH的作用下，于甲醇水溶液中回流反应4小时后生成式(F)和式(G)所示的化合物；

[0030] (f)在有机溶剂DMF中，CY3-COOH同N-Boc-乙二胺在HoBt、EDC、Et3N碱性条件下常温过夜反应得到式(I)所示的化合物；

[0031] (g)步骤(f)得到的式(I)所示化合物在TFA的作用下常温反应2小时后脱Boc生成式(H)所示的化合物；

[0032] (h)步骤(g)得到的式(H)所示化合物分别同步骤(e)生成的式(F)、式(G)所示化合物在HoBt、EDC、Et3N碱性条件下常温过夜反应生成式(i1)和式(J)所示的化合物，式(J)所示化合物在TFA的作用下脱Boc生成式(i2)所示的化合物。

[0033] 本发明所述的制备方法步骤(h)中，式(i1)所示化合物的分离纯化方法为：反应结束后，反应液中加入饱和NaCl水溶液，用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，取有机层经过无水硫酸钠干燥、过滤、蒸干溶剂，即得式(i1)所示的化合物粗品，式(i1)所示的化合物粗品进行柱层析分离提纯，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇体积比10:1的混合液，收集含目标化合物的洗脱液，浓缩干燥得到式(i1)所示的化合物纯品。

[0034] 本发明所述的制备方法步骤(h)中，式(i2)所示化合物的分离纯化方法为：反应结束后，反应液中加入饱和NaCl水溶液，用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，取有机层经过无水硫酸钠干燥、过滤、蒸干溶剂，即得式(i2)所示的化合物粗品，式(i2)所示的化合物粗品进行柱层析分离提纯，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇体积比5:1的混合液，收集含目标化合物的洗脱液，浓缩干燥得到式(i2)所示的化合物纯品。

[0035] 本发明所述的式(i1)或式(i2)所示的化合物可作为荧光探针，应用于单胺氧化酶活性的荧光检测。所述的单胺氧化酶活性的荧光检测的方法为：以式(i1)或式(i2)所示的化合物作为荧光探针，单胺氧化酶水解荧光探针形成荧光物质，测定荧光强度，从而获得单胺氧化酶活性强度。

[0036] 进一步，所述的单胺氧化酶活性的荧光检测的方法为：先将待测单胺氧化酶样品溶于浓度50mM，pH值为7.4的磷酸缓冲液中得到浓度为3μg/mL待测单胺氧化酶的样品溶液，然后所述的待测单胺氧化酶的样品溶液按体积比55:143加入pH值为7.4～9的硼酸缓冲液中，接着加入荧光探针的DMSO溶液，得到反应液，将反应液立即加入96孔筛板中，观测荧光强度变化，获得单胺氧化酶活性强度数据；所述方法中加入荧光探针的DMSO溶液的量要使反应液中荧光探针的终浓度为50～200μmol/L。

[0037] 再进一步，所述的单胺氧化酶活性的荧光检测的方法为：在离心管中，先将待测单胺氧化酶样品溶于浓度50mM，pH值为7.4的PBS缓冲液中得到浓度为3μg/mL待测单胺氧化酶的样品溶液，然后将所述的待测单胺氧化酶的样品溶液按体积比55:143加入浓度50mM、pH值为8.4的硼酸缓冲液中，接着加入荧光探针的DMSO溶液，得到荧光探针的终浓度为50～200μmol/L的反应液，将反应液立即加入96孔筛板中，并用酶标仪在37℃下检测荧光强度，分析荧光强度与时间的关系后获得单胺氧化酶活性强度数据。

[0038] 本发明所述的检测方法，检测荧光强度时可在酶标仪中的96孔筛板中检测。

[0039] 具体的，以式(i1)所示的化合物为例，所述的单胺氧化酶活性的荧光检测方法按照以下步骤进行：在离心管中，先将待测单胺氧化酶活性的样品溶于浓度50mM，pH值为7.4的PBS缓冲液得到浓度为3μg/mL待测单胺氧化酶活性的样品溶液，然后取55体积份待测单胺氧化酶活性的样品溶液放入143体积份50mM，pH值为8.4的硼酸缓冲液中，接着加入2体积份浓度为10mM式(i1)所示化合物的DMSO溶液，在96孔筛板中用酶标仪检测荧光强度，分析荧光强度与时间的关系后获得单胺氧化酶活性强度数据。

[0040] 由于荧光强度与酶活强度成线性关系，因此可根据荧光强度的高低来定性判断酶活强度，并且可根据米氏方程将得到的荧光强度换算出单胺氧化酶活性的各种反应常数。

[0041] 本发明与现有技术相比，其有益效果体现在：

[0042] (1)提供一种新的化合物作为荧光探针，所用荧光探针的制备所需要的设备简单，操作过程简便，原料来源都已商品化容易得到，并且所制备的单胺氧化酶荧光探针性质很稳定；

[0043] (2)与以前所用的检测单胺氧化酶活性的基本方法相比，其精确度和灵敏度都有很大的提高。(四)附图说明

[0044] 图1为实施例3探针选择性试验的检测结果图。

[0045] 图2为实施例4加入单胺氧化酶抑制剂的对比图。

[0046] 图3为实施例2单胺氧化酶浓度与荧光强度关系图。(五)具体实施方式：

[0047] 下面以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此：

[0048] 实施例1：制备2-(3-甲氧基-6-(1-甲基-1,2,3,6-四氢吡啶-4-氧基)-9H-氧杂蒽-9-基)-4(5)-1-(2-(CY3-甲酰胺)氨基甲酰基)苯甲酸

[0049]

[0050] 称取间苯二酚(2.86g，2.6mmol)于50mL圆底烧瓶中，加入15mL甲磺酸，待间苯二酚完全溶解后，加入偏苯三酸酐(2.5g，1.3mmol)，85℃反应，TLC跟踪反应情况，反应完毕后，冷却至室温，将混合物倒入7倍体积的碎冰中，过夜，有橙黄色沉淀产生。抽滤，用水、CH2Cl2洗涤，于70℃烘箱干燥得红色固体。将其溶解于4M NaOH的水溶液中，小心滴加浓盐+酸，得到A物质4g，产率81.8％；ESI-MS m/z377.3(M+1)。

[0051] 将A(3.455g，9.2mmol)溶于50mL DMF中，加入K2CO3(5.71g，41.4mmol)，搅拌溶解后，加入过量的CH3I(2.3mL，36.8mmol)，室温反应24h后，用3×100mL的CH2Cl2萃取。得到的有机相用水(100mL×2)和饱和食盐水(100mL×2)洗涤。无水硫酸钠1
干燥，过滤，浓缩得到黄色固体产物B(3.5g)，产率约为91％；H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.30(d,J ＝ 0.9Hz,1H),7.97(s,1H),7.43(d,J ＝ 7.9Hz,1H),6.97(s,1H),6.89–
6.69(m,3H),6.55(ddt,J ＝ 9.7,3.9,1.8Hz,1H),6.51–6.42(m,1H),3.95(dd,J ＝+
35.3,20.2Hz,6H),3.67(d,J＝11.9Hz,3H)；ESI-MS m/z419.2(M+1).

[0052] 取B(1.254g，3mmol)溶解在100mL MeOH中，冰浴分批少量多次加入NaBH4(0.57g，15.0mmol)，TLC跟踪监测，待反应完全后，用旋转蒸发仪抽干反应溶剂甲醇，用的CH2Cl2(50mL×3)萃取。合并有机层，用饱和食盐水(50mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得淡黄色泡沫状固体1.12g，产率为88.9％；将其直接溶解在60mL CH3CN中，加入
1-甲基-4-溴-吡啶碘盐(0.96g，3.2mmol)，再加入5mL吡啶，常温搅拌反应24h。将反应液过滤，滤液浓缩后用柱层析(洗脱剂为CH2Cl2：MeOH＝50:1，体积比)分离纯化得1g淡
1
黄色固体产物D，产率为73.5％；H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.88(d,J＝8.2Hz,1H),7.76(s,1H),7.65(s,1H),7.26(d,J＝ 7.2Hz,2H),7.17–6.96(m,1H),6.83–6.69(m,1H),6.62(d,J＝ 10.8Hz,1H),6.53(s,1H),6.43(d,J ＝ 11.0Hz,1H),6.31(s,1H),6.14(s,1H),4.42(s,+
3H),3.92–3.61(m,9H)；ESI-MS m/z513.4(M+1).

[0053] 取D(0.512g，1mmol)溶解在30mL甲醇溶液中，待溶解完全后，冰浴分批少量加入硼氢化钠(0.152g，4.0mmol)，反应约30min后，抽干反应液溶剂甲醇，用CH2Cl2(30mL×3)萃取，得到的有机相用饱和食盐水(30mL×2)洗涤，无水硫酸镁干燥过滤后，用旋转蒸1
发仪抽干，得到淡黄色固体产物C，产率为91％；H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.94(d,J＝
9.9Hz,1H),7.88–7.76(m,1H),7.19(d,J ＝ 8.3Hz,1H),6.99–6.77(m,3H),6.63(d,J ＝
11.1Hz,2H),6.51(dt,J ＝ 8.5,2.6Hz,1H),6.33(s,1H),5.02–4.88(m,1H),3.84(dd,J＝ 48.1,19.6Hz,9H),2.99(s,2H),2.65(t,J ＝ 5.3Hz,2H),2.38(s,5H)；ESI-MS m/+
z516.4(M+1).

[0054] 将C(0.515g，1mmol)溶解于30mL甲醇中，加入2M的NaOH溶液7.5mL，加热回流4h后，用旋转蒸发仪浓缩一部分溶剂，然后用1M的HCl溶液将浓缩液pH调节至2左右，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，无水硫酸镁干燥，抽干溶液，用柱层析的方法(洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝5:1，体积比)分离纯化得0.28g白色固体F，产率67％；1
H NMR(400MHz,DMSO)δ7.63(d,J ＝ 8.0Hz,1H),7.49(d,J ＝ 7.9Hz,1H),7.19(dd,J＝ 29.6,8.4Hz,1H),7.03(t,J ＝ 9.0Hz,1H),6.75(d,J ＝ 8.1Hz,1H),6.72–
6.64(m,3H),6.55(dd,J＝13.1,7.0Hz,2H),5.08(d,J＝8.0Hz,2H),3.72(d,J＝4.7Hz,3H+
),3.17(s,2H),2.84(s,2H),2.51–2.40(m,3H),2.32(s,2H)；ESI-MS m/z488.4(M+1).[0055] 将Cy3(0.114g，0.2mmol)溶于5mL DMF中，加入HOBt(0.033g，0.24mmol)，待完全溶解后，再加入EDC(0.046g，0.24mmol)，三乙胺(51ul，0.4mmol)，室温搅拌1h后，加入N-Boc乙二胺(0.0384g，0.24mmol)继续搅拌过夜，TLC跟踪监测，待反应完全后，加入
10mL水，用CH2Cl2(50mL×3)萃取，无水硫酸钠干燥，抽干溶液得0.085g红色固体I，产率为+
72.6％；ESI-MS m/z586.3(M+1).

[0056] 将I直接溶解在5mL无水CH2Cl2中，加入2.5mL三氟乙酸，室温搅拌2h，浓缩反应液后用柱层析(洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝3:1，体积比)分离，得60mg红色固体H，产率为85.7％；1H NMR(500MHz,DMSO)δ7.61(d,J＝6.4Hz,2H),7.43(d,J＝7.3Hz,4H),7.27(d,J＝ 5.7Hz,2H),6.49-6.38(t,J ＝ 13.1Hz,3H),4.11(s,2H),3.64(s,2H),3.27(d,J ＝
3.4Hz,2H),3.08(dd,J＝13.3,6.3Hz,2H),2.51(m,2H),2.22(dd,J＝19.2,13.2Hz,2H),1.+
92-1.88(m,6H),1.77-1.68(m,6H),1.3–1.05(m,3H)；ESI-MS m/z486.4(M+1).[0057] 将 F(58mg，0.12mmol) 溶 于 5mL DMF 中， 加 入 HOBt(0.020g，0.15mmol)、EDC(0.028g，0.15mmol)、三乙胺(34uL，0.24mmol)，反应1h后，加入H(48.5mg，0.1mmol)，常温反应过夜，加入5mL水，用CH2Cl2(10mL×3)萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，抽干溶液，柱层析(洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝5:1，体积比)分离得15mg的红色固体物质2-(3-甲氧基-6-(1-甲基-1,2,3,6-四氢吡啶-4-氧基)-9H-氧
1
杂蒽-9-基)-4(5)-1-(2-(CY3-甲酰胺)氨基甲酰基)苯甲酸，产率为15.7％；H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.36(dd,J ＝ 37.1,27.5Hz,1H),7.88–7.80(m,1H),7.74(dd,J＝ 5.7,3.3Hz,1H),7.66–7.59(m,1H),7.58–7.51(m,1H),7.43–7.29(m,3H),7.27–
7.17(m,3H),7.12–7.01(m,2H),6.98(dd,J ＝ 10.9,5.9Hz,2H),6.75–
6.61(m,2H),6.51(d,J ＝ 13.2Hz,1H),6.41(ddd,J ＝ 24.5,12.0,3.2Hz,3H),4.84–
4.59(m,1H),4.10(d,J ＝ 6.7Hz,2H),3.75–3.67(m,3H),3.60(dd,J ＝
17.0,8.9Hz,2H),3.54–3.49(m,2H),3.18(s,2H),2.75(d,J ＝ 13.3Hz,7H),2.09–
2.04(m,2H),1.80(s,2H),1.69–1.66(m,6H),1.27(s,6H),1.01(s,2H),1.00–
0.97(m,3H).

[0058] 实施例2：

[0059] 为了确定酶浓度对检测结果的影响，设计一组梯度实验，三组平行组，在96孔板中分别加入适量的硼酸缓冲液(浓度50mM，pH＝8.4)，随后分别加入10μL、25μL、40μL、55μL酶液(MAO-B溶于浓度50mM，pH值为7.4的PBS缓冲液中得到浓度为3μg/mL的酶液)，使得酶的最终浓度为0.030mg/mL、0.075mg/mL、0.15mg/mL、0.16mg/mL，最后加入2μL实施例1中所制得的探针的DMSO溶液(浓度10mM)。37℃反应了2h后，在λex/λem＝
475/570nm下用荧光酶标仪进行荧光发射波谱的检测，得到酶浓度对检测结果的影响。

[0060] 实验证明，只要存在微量的单胺氧化酶，就能高效的水解荧光探针，通过全功能微孔板检测系统可以测定，并且随着单胺氧化酶的浓度增大，荧光强度从500增加到2000(如附图3)，变化的幅度较大，而且单胺氧化酶的浓度与荧光强度成线性关系，通过荧光强度就可以直观地得出单胺氧化酶的活性的变化，再根据米氏方程得到酶的各种反应常数。

[0061] 实施例3：选择性试验

[0062] 为了研究探针对单胺氧化酶的选择特异性，设计三组平行试验，分别在96孔板中加入143μL的硼酸缓冲液(浓度50mM，pH＝8.4)，随后加入55μL酶液(MAO-A或MAO-B溶于浓度50mM，pH值为7.4的PBS缓冲液中得到浓度为3μg/mL的酶液)，加入2μL实施例1中所制得的探针的DMSO溶液，并使反应液中荧光探针的终浓度为100μM，37℃反应了2h后，在λem/λex＝475/570nm下用荧光酶标仪进行全波段扫描。从图1检测结果来看，实施例1中所制得的探针对单胺氧化酶均有一定的检测效果且对MAO-B的检测效果比MAO-A更好，说明探针对MAO-B有选择性。

[0063] 实施例4：抑制剂试验

[0064] 为了验证探针是结合单胺氧化酶而引起检测体系荧光信号的变化，设计三组平行试验，分别在96孔板中加入139μL的硼酸缓冲液(浓度50mM，pH＝8.4)，随后加入55μL酶液(MAO-B溶于浓度50mM，pH值为7.4的PBS缓冲液中得到浓度为3μg/mL的酶液)，4μL单胺氧化酶抑制剂巴吉林(400μM)，37℃反应2h后，最后加入2μL实施例1中制得的探针的DMSO溶液，并使反应液中荧光探针的终浓度为100μM，再反应2h，在λex/λem＝
475/570nm下用荧光酶标仪进行全波段扫描，对照组为同等条件下不加抑制剂的反应体系。

[0065] 通过图2发现，经处理过的酶与探针结合之后，荧光强度明显低于正常检测组，这说明探针正是跟单胺氧化酶作用之后才引起荧光信号的变化的。单胺氧化酶的活性被抑制后，用我们制备的荧光探针检测不出活性。

[0066] 实施例5：

[0067] 采用类似实施例1的方法，将式(ii)换成式(iii)，结果表明(i2)对单胺氧化酶的选择性也是MAO-B优于MAO-A。