一种化合物及其应用于碱性磷酸酶活性的荧光检测方法

摘要

本发明公开了一种式(i)所示的化合物及其制备方法，所述的化合物可以作为荧光探针，应用于碱性磷酸酶活性的荧光检测方法中；本发明利用荧光共振能量转移原理，以四苯基乙烯衍生物和5(6)-羧基荧光素作为FRET体系的供受体，设计合成出了以磷酸基团作为识别基团的“OFF-ON”FRET探针；所述荧光探针的制备所需要的设备简单，操作过程简便，原料来源都已商品化容易得到，并且该探针对碱性磷酸酶具有高度的专一性；本发明荧光探针在应用于碱性磷酸酶活性的荧光检测时，与以前所用的检测碱性磷酸酶活性的基本方法相比，其精确度和灵敏度都有很大的提高；

权利要求

1.一种如式(i)所示的化合物：

2.一种如式(i)所示的化合物的制备方法，其特征在于所述的制备方法包括如下步骤：(a)如式(C)所示的甲基二苯甲酮反应得到式(D)所示的1,2-二苯基-1,2-二对甲苯乙烯；

(b)步骤(a)得到的式(D)所示的1,2-二苯基-1,2-二对甲苯乙烯与N-溴代丁二酰亚胺进行取代反应得到式(E)所示的1-(4-溴甲基苯)-2-对甲苯基-1,2-二苯基乙烯；

(c)步骤(b)得到的式(E)所示的1-(4-溴甲基苯)-2-对甲苯基-1,2-二苯基乙烯与叠氮化钠作用，反应得到式(F)所示的1-(4-叠氮甲基苯)-2-对甲苯基-1,2-二苯基乙烯；

(d)步骤(c)得到的式(F)所示的1-(4-叠氮甲基苯)-2-对甲苯基-1,2-二苯基乙烯与三苯基磷进行还原反应得到式(G)所示的化合物(4-(1,2-二苯基-2-(对甲苯基)乙烯基)苯基)甲胺；

(e)如式(A)所示的偏苯三酸酐和间苯二酚反应，得到式(B)所示的5(6)-羧基荧光素；

(f)有机溶剂中，步骤(e)得到的式(B)所示的5(6)-羧基荧光素与步骤(d)得到的式(G)所示化合物在酰化条件下，反应得到式(H)所示的化合物2-(6-羟基-3氧-3H-氧杂蒽-9-基)-4(5)-((4-(1,2-二苯基-2-(对甲苯基)乙烯基)苯甲基)氨基甲酰基)苯甲酸；

(g)步骤(f)得到的式(H)所示的化合物与氯磷酸二乙酯进行酯化反应得到式(I)所示的化合物；

(h)式(I)所示的化合物在三甲基碘硅烷作用下得到式(i)所示的化合物；

3.如权利要求2所述的式(i)所示化合物的制备方法，其特征在于所述的制备方法包括如下步骤：(a)如式(C)所示的甲基二苯甲酮于四氢呋喃溶剂中，在TiCl4和锌粉催化下回流反应8～10小时，反应结束后即得到式(D)所示的1,2-二苯基-1,2-二对甲苯乙烯；

(b)步骤(a)得到的式(D)所示的1,2-二苯基-1,2-二对甲苯乙烯与N-溴代丁二酰亚胺在CCl4溶剂中回流进行取代反应，反应结束后反应液分离处理得到式(E)所示的1-(4-溴甲基苯)-2-对甲苯基-1,2-二苯基乙烯；

(c)步骤(b)得到的式(E)所示的1-(4-溴甲基苯)-2-对甲苯基-1,2-二苯基乙烯在DMSO中与叠氮化钠作用，常温反应得到式(F)所示的1-(4-叠氮甲基苯)-2-对甲苯基-1,2-二苯基乙烯；

(d)步骤(c)得到的式(F)所示的1-(4-叠氮甲基苯)-2-对甲苯基-1,2-二苯基乙烯与三苯基磷进行还原反应，以THF为溶剂，回流反应10小时得到式(G)所示的化合物(4-(1,2-二苯基-2-(对甲苯基)乙烯基)苯基)甲胺；

(e)如式(A)所示的偏苯三酸酐和间苯二酚在甲磺酸溶液中回流反应，反应结束后反应液倒入碎冰中析出固体，过滤，取滤饼得到式(B)所示的5(6)-羧基荧光素；

(f)在DMF有机溶剂中，步骤(e)得到的式(B)所示的5(6)-羧基荧光素与步骤(d)得到的式(G)所示化合物在HOBt、EDC.HCl、三乙胺条件下，反应过夜后，往反应液中加入水后过滤，取滤饼得到式(H)所示的化合物；

(g)步骤(f)得到的式(H)所示的化合物与氯磷酸二乙酯在吡啶溶液中进行酯化反应，反应结束后，反应液中加入水后过滤，取滤饼得到式(I)所示的化合物；

(h)式(I)所示的化合物在三甲基碘硅烷作用下脱酯，反应结束后反应液分离处理得到式(i)所示的化合物。

说明书

一种化合物及其应用于碱性磷酸酶活性的荧光检测方法

(一)技术领域

[0001] 本发明涉及一种新化合物，所述的化合物可以作为FRET荧光探针，应用于碱性磷酸酶活性的荧光检测方法中。(二)背景技术

[0002] 碱性磷酸酶可来源于不同哺乳动物的骨、肝、胎盘和肠道，作为常见的分析酶，能催化水解多样的磷酸化合物并且具有底物特异性。在临床诊断上碱性磷酸酶可作为一个重要的生物指标，在很多疾病中如骨骼疾病，肝脏功能障碍，卵巢癌，乳腺癌，前列腺癌，白血病和糖尿病等中均可通过检测碱性磷酸酶的异常水平来进行初步诊断。目前已经出现了很多方法用于该碱性磷酸酶检测，荧光检测法因其快速，敏感的传导信号而备受欢迎。

[0003] 荧光共振能量转移(FRET)已广泛应用于离子、小分子、生物大分子活性的检测。FRET分子较于其他荧光探针而言，有以下两个优点：(1)能实现更大的斯托克斯位移，从而减少诸如背景信号的干扰；(2)能够进行比率检测，即随着反应体系的变化两个荧光团的发射强度或着吸收强度的比值也会跟着变化，而且随着强度比值的变化可以提高动态响应的范围，建立内标，削弱其他因素的干扰。目前，已经报道的荧光探针大多数是以荧光强度的变化作为响应信号，虽然都能用于检测碱性磷酸酶，但是这些探针无法排除因其他酶与四苯乙烯(TPE)类化合物聚集而导致的荧光误差而且单信号近紫外荧光探针在细胞内的荧光成像对细胞有损害，而基于TPE的FRET探针可通过增加斯托克斯位移解决该类问题。

[0004] 5(6)-羧基荧光素的发射波长处于可见光区，可以大大减少背景荧光(近紫外区)对检测结果的干扰，而且它还是一种能同生物活性物质相键合的荧光染料。而四苯基乙烯也是生物化学中新兴的一种荧光染料，它虽然摩尔消光系数和量子产率高，而且也在生物大分子检测领域具有重要的应用，但是它却存在背景高、非特异性结合的缺点，那么FRET可以很好的解决这一误差，排除其他因素的影响。根据报道，5(6)-羧基荧光素的激发波长与TPEs的发射波长有重叠，因此通过合适的连接臂，可以构建出荧光素-TPEs的FRET体系。

[0005] 因此，设计荧光素-TPEs的FRET探针来检测碱性磷酸酶是一种更为灵敏、有效的方法。(三)发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种化合物，所述的化合物可作为荧光探针应用于碱性磷酸酶活性的荧光检测，作为荧光探针的化合物是一种新化合物，并且其制备方法简单，检测的精确度、准确度高，检测速度快。

[0007] 本发明采用的技术方案如下：

[0008] 本发明提供了一种如式(i)所示的化合物：

[0009]

[0010] 本发明还提供了一种如式(i)所示的化合物的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：

[0011] (a)如式(C)所示的甲基二苯甲酮反应得到式(D)所示的1,2-二苯基-1,2-二对甲苯乙烯；

[0012] (b)步骤(a)得到的式(D)所示的1,2-二苯基-1,2-二对甲苯乙烯与N-溴代丁二酰亚胺进行取代反应得到式(E)所示的1-(4-溴甲基苯)-2-对甲苯基-1，2-二苯基乙烯；

[0013] (c)步骤(b)得到的式(E)所示的1-(4-溴甲基苯)-2-对甲苯基-1,2-二苯基乙烯与叠氮化钠作用，反应得到式(F)所示的1-(4-叠氮甲基苯)-2-对甲苯基-1,2-二苯基乙烯；

[0014] (d)步骤(c)得到的式(F)所示的1-(4-叠氮甲基苯)-2-对甲苯基-1,2-二苯基乙烯与三苯基磷进行还原反应得到式(G)所示的化合物(4-(1,2-二苯基-2-(对甲苯基)乙烯基)苯基)甲胺；

[0015] (e)如式(A)所示的偏苯三酸酐和间苯二酚反应，得到式(B)所示的5(6)-羧基荧光素；

[0016] (f)有机溶剂中，步骤(e)得到的式(B)所示的5(6)-羧基荧光素与步骤(d)得到的式(G)所示化合物在酰化条件下，反应得到式(H)所示的化合物2-(6-羟基-3氧-3H-氧杂蒽-9-基)-4(5)-((4-(1,2-二苯基-2-(对甲苯基)乙烯基)苯甲基)氨基甲酰基)苯甲酸；

[0017] (g)步骤(f)得到的式(H)所示的化合物与氯磷酸二乙酯进行酯化反应得到式(I)所示的化合物2-(3,6-二磷酸二乙酯氧基-9H-氧杂蒽-9-基)-4(5)-((4-(1,2-二苯基-2-(对甲苯基)乙烯基)苯甲基)氨基甲酰基)苯甲酸；

[0018] (h)式(I)所示的化合物在三甲基碘硅烷作用下得到式(i)所示的2-(3,6-二磷酸氧基-9H-氧杂蒽-9-基)-4(5)-((4-(1,2-二苯基-2-(对甲苯基)乙烯基)苯甲基)氨基甲酰基)苯甲酸；

[0019]

[0020] 较为具体的，如式(i)所示化合物的制备方法包括如下步骤：

[0021] (a)如式(C)所示的甲基二苯甲酮于四氢呋喃溶剂中，在TiCl4和锌粉催化下回流反应8～10小时，反应结束后即得到式(D)所示的1,2-二苯基-1,2-二对甲苯乙烯；

[0022] (b)步骤(a)得到的式(D)所示的1,2-二苯基-1,2-二对甲苯乙烯与N-溴代丁二酰亚胺在CCl4溶剂中回流进行取代反应，反应结束后反应液分离处理得到式(E)所示的1-(4-溴甲基苯)-2-对甲苯基-1,2-二苯基乙烯；

[0023] (c)步骤(b)得到的式(E)所示的1-(4-溴甲基苯)-2-对甲苯基-1,2-二苯基乙烯在DMSO中与叠氮化钠作用，常温反应得到式(F)所示的1-(4-叠氮甲基苯)-2-对甲苯基-1,2-二苯基乙烯；

[0024] (d)步骤(c)得到的式(F)所示的1-(4-叠氮甲基苯)-2-对甲苯基-1,2-二苯基乙烯与三苯基磷进行还原反应，以THF为溶剂，回流反应10小时得到式(G)所示的化合物(4-(1,2-二苯基-2-(对甲苯基)乙烯基)苯基)甲胺；

[0025] (e)如式(A)所示的偏苯三酸酐和间苯二酚在甲磺酸溶液中回流反应，反应结束后反应液倒入碎冰中析出固体，过滤，取滤饼得到式(B)所示的5(6)-羧基荧光素；

[0026] (f)在DMF有机溶剂中，步骤(e)得到的式(B)所示的5(6)-羧基荧光素与步骤(d)得到的式(G)所示化合物在HOBt、EDC.HCl、三乙胺条件下，反应过夜后，往反应液中加入水后过滤，取滤饼得到式(H)所示的化合物；

[0027] (g)步骤(f)得到的式(H)所示的化合物与氯磷酸二乙酯在吡啶溶液中进行酯化反应，反应结束后，反应液中加入水后过滤，取滤饼得到式(I)所示的化合物；

[0028] (h)式(I)所示的化合物在三甲基碘硅烷作用下脱酯，反应结束后反应液分离处理得到式(i)所示的化合物。

[0029] 本发明所述的式(i)所示的化合物可作为荧光探针，应用于碱性磷酸酶活性的荧光检测。所述的碱性磷酸酶活性的荧光检测的方法为：以式(i)所示的化合物作为荧光探针，碱性磷酸酶水解荧光探针形成FRET荧光物质，测定荧光强度变化从而获得碱性磷酸酶活性强度。

[0030] 进一步，所述的碱性磷酸酶活性的荧光检测的方法为：先将待测碱性磷酸酶样品溶于浓度50mM，pH值为8.4的硼酸缓冲液中得到浓度为22.5mg/mL待测碱性磷酸酶的样品溶液，然后将待测碱性磷酸酶的样品溶液按体积比1:15加入pH值为8.4的硼酸缓冲液中，接着加入荧光探针的DMSO溶液，得到反应液，将所述的反应液立即加入96孔筛板中，在λex/λem＝350/530nm的条件下观测荧光强度变化，获得碱性磷酸酶活性强度数据；所述方法中加入荧光探针的DMSO溶液的量要使反应液中荧光探针的终浓度为0.01～200μmol/L。

[0031] 再进一步，所述的碱性磷酸酶活性的荧光检测的方法为：在微量离心管中，先将待测碱性磷酸酶样品用浓度50mM，pH值为8.4的硼酸缓冲液溶解，得到待测碱性磷酸酶的样品溶液，然后将待测碱性磷酸酶的样品溶液按体积比1:15加入浓度50mM、pH值为8.4的硼酸缓冲液中，接着加入浓度7.5mM的荧光探针的DMSO溶液，得到荧光探针的终浓度为0.01～200μmol/L的反应液，在37℃下，所述反应液立即在96孔筛板中用酶标仪检测荧光强度，分析荧光强度与时间的关系后获得碱性磷酸酶活性强度数据。

[0032] 更为具体的，所述的碱性磷酸酶活性的荧光检测方法按照如下步骤进行：在微量离心管中，先将待测碱性磷酸酶样品用浓度50mM，pH值为8.4的硼酸缓冲液溶解，得到浓度为22.5mg/mL待测碱性磷酸酶的样品溶液，然后取10体积份所述的待测碱性磷酸酶的样品溶液放入139体积份浓度50mM，pH值为8.4的硼酸缓冲液中，接着加入1体积份浓度为7.5mM化合物(i)的DMSO溶液，在96孔筛板中用酶标仪检测荧光强度，分析荧光强度与时间的关系后获得碱性磷酸酶活性强度数据。

[0033] 由于荧光强度与酶活强度成线性关系，因此可根据荧光强度的高低来定性判断酶活强度，并且可根据米氏方程将得到的荧光强度换算出碱性磷酸酶活性的各种反应常数。

[0034] 本发明与现有技术相比，其有益效果体现在：

[0035] (1)提供一种新的化合物作为FRET荧光探针，所用荧光探针的制备所需要的设备简单，操作过程简便，原料来源都已商品化容易得到，并且所制备的碱性磷酸酶荧光探针性质稳定；

[0036] (2)与以前所用的检测碱性磷酸酶活性的基本方法相比,其精确度和灵敏度都有很大的提高。(四)附图说明

[0037] 图1为探针与磷酸酶作用时，λex/λem＝350/460nm和λex/λem＝350/530nm荧光强度与时间的关系图；

[0038] 图2为探针与磷酸酶作用时，λex/λem＝350/460nm和λex/λem＝350/530nm的荧光强度比值随时间的变化图；

[0039] 图3为与磷酸酶作用过程中探针浓度与荧光强度关系图；

[0040] 图4为碱性磷酸酶浓度与探针荧光强度关系图；

[0041] 图5为碱性磷酸酶抑制剂效果的对比图；

[0042] 图6为探针对其它酶的检测结果图。(五)具体实施方式：

[0043] 下面以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此：

[0044] 实施例1：制备2-(3,6-二磷酸氧基-9H-氧杂蒽-9-基)-4(5)-((4-(1，2-二苯基-2-(对甲苯基)乙烯基)苯甲基)氨基甲酰基)苯甲酸

[0045]

[0046] 首先将甲基二苯甲酮(1.96g，10mmol)及锌粉(1.95g，30mmol)加入干燥的三口瓶中，放入一个磁子后将其抽真空，随后通入氮气。用针筒移取新蒸除水THF溶液(50mL)至三口瓶中，将溶液搅拌，此时溶液为灰色悬浮液。用针筒移取(1.7mL，15mmol)TiCl4，并在-60℃下逐渐滴加到三口瓶中，随着TiCl4的加入，溶液反应剧烈，烧瓶壁上出现黄色固体，滴加完毕后室温反应，溶液颜色变为亮黑色，而后将油浴温度升至78℃回流过夜。待反应完毕后，将混合溶液过滤，用旋转蒸发除去溶剂，所得固体用层析柱进行分离(洗脱剂为石油醚：二氯甲烷＝5：1，体积比)，得到白色固体D1.6g；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.00–6.89(m,10H),
6.81(s,4H),6.79(s,4H),2.17(s,3H),2.15(s,3H).

[0047] 取化合物D(0.36g，1mmol)溶解在30mL CCl4中，加入NBS(0.18g，1mmol)，BPO(36mg，0.15mmol)，回流反应。TLC追踪反应情况，反应完毕后，冷却至室温后有白色颗粒悬浮，过滤后滤液用旋转蒸发仪除去溶剂，所得浓缩液用薄层层析硅胶板进行分离(展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝30：1，体积比)得白色固体E0.157g；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.01–6.96(m,8H),6.91(ddd,J＝10.3,5.8,2.8Hz,6H),6.80(d,J＝4.3Hz,4H),4.30(d,J＝7.7Hz,2H),2.16(d,J＝6.4Hz,3H).

[0048] 将化合物E(0.157g，0.36mmol)溶于DMSO(8mL)中，搅拌溶解后加入NaN3(28mg，0.432mmol)，常温搅拌反应24h后，加入水淬灭反应，有固体析出，过滤得白色固体，烘干得
0.14g白色固体F；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.03–6.98(m,6H),6.97–6.90(m,8H),6.81(d,J＝
2.8Hz,4H),4.15(d,J＝7.5Hz,2H),2.17(d,J＝1.0Hz,3H).

[0049] 取化合物F(79mg，0.197mmol)溶于5mLTHF中，搅拌后加入PPh3(65mg，0.25mmol)，回流反应10h，补加25μL水继续回流2h。反应完后冷却至室温，旋转蒸发仪浓缩，薄层层析硅胶板进行分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝15：1，体积比)得白色固体G60g，产率89％；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.98–6.86(m,14H),6.79(s,4H),4.78(s,2H),3.68(s,2H),2.15(d,J＝7.1Hz,3H)；ESI-MS m/z751(2M+1)+.

[0050] 称取间苯二酚(2.86g，2.6mmol)于50mL圆底烧瓶中，加入15mL甲磺酸，待间苯二酚完全溶解后，加入A(2.5g，1.3mmol)，85℃反应，TLC追踪反应情况，反应完毕后，冷却至室温，将混合物倒入7倍体积的碎冰中，过夜，有橙黄色沉淀产生。抽滤，用水、CH2Cl2洗涤，于70℃烘箱干燥得红色固体。将其溶解于4M NaOH的水溶液中，小心滴加浓盐酸，得到B物质4g；ESI-MS m/z377.3(M+1)+.

[0051] 将B(37.6mg，0.1mmol)溶于5mL DMF中，加入HOBt(16.2mg，0.12mmol)、EDC.HCl(22.9mg，0.12mmol)、三乙胺(27.8μL，0.2mmol)，反应30min后，加入G(45mg，0.12mmol)，反应过夜后加入水淬灭反应，有沉淀析出，固体再用薄层层析硅胶板分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝5：1，体积比)得36mg的红色固体H；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.49(s,2H),7.70(d,J＝6.6Hz,4H),7.62(d,J＝5.4Hz,5H),7.45(d,J＝2.5Hz,1H),7.30–7.26(m,8H),7.02–6.89(m,20H),6.82–6.77(m,8H),6.66–6.41(m,8H),4.94–4.60(m,2H),4.44(d,J＝64.0Hz,
2H),3.35(s,2H),2.14(dd,J＝14.8,11.0Hz,6H)；ESI-MS m/z756.25(M+23)+.

[0052] 首先将H(73.3mg，0.1mmol)和搅拌子加入反应瓶中，再将其抽真空，随后通入氮气。用针筒分别移取吡啶溶液(2mL)和氯磷酸二乙酯(116μL，0.8mmol)加入反应瓶中，待反应完毕后，将混合溶液加水后过滤，滤出物用薄层层析硅胶分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝10：1，体积比)得白色固体I20mg；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.34(dd,J＝5.2,0.9Hz,1H),8.21(ddd,J＝8.0,5.0,1.6Hz,1H),8.09(dd,J＝8.0,0.8Hz,1H),8.04(ddd,J＝8.0,2.4,
1.4Hz,1H),7.52(d,J＝9.4Hz,1H),7.27–7.25(m,1H),7.24–7.20(m,4H),7.14–6.94(m,
30H),6.94–6.87(m,10H),6.76(dd,J＝10.3,6.2Hz,4H),6.61(dt,J＝11.1,5.4Hz,1H),
6.56(dd,J＝12.6,6.3Hz,1H),4.61(dd,J＝10.4,5.5Hz,2H),4.52(dd,J＝11.5,5.7Hz,
2H),4.30–4.20(m,16H),2.29–2.23(m,6H),1.40–1.36(m,24H)；ESI-MS m/z1028.3(M+23)+.

[0053] 最后将I(20mg，0.02mmol)和搅拌子加入反应瓶中，再将其抽真空，随后通入氮气。用针筒分别移取二氯甲烷溶液(5mL)和TMSI(140μL)加入反应瓶中，反应1.5h后，将混合溶液旋干，残余物用薄层层析硅胶分离(展开剂为甲醇：二氯甲烷＝2：1，体积比)得得白色固体探针i4mg；1H NMR(500MHz,DMF)δ9.52–9.44(m,1H),8.69–8.61(m,1H),8.22–8.13(m,
2H),7.84–7.77(m,2H),7.60–7.16(m,48H),7.00–6.94(m,1H),6.88–6.81(m,1H),6.69–
6.60(m,1H),6.61–6.48(m,1H),4.80–4.65(m,4H),2.72–2.52(m,6H)；ESI-MS m/z893.2(M+
23)+.

[0054] 实施例2：FRET荧光探针对碱性磷酸酶活性的实时检测：

[0055] 将待测碱性磷酸酶活性的样品用浓度50mM，pH值为8.4的硼酸缓冲液溶于微量离心管中得到待测碱性磷酸酶活性的样品溶液(22.5mg/mL)，取20μL待测碱性磷酸酶活性的样品溶液放入278μL50mMpH8.4的硼酸缓冲液中，加入2μL浓度为7.5mM实施例1制得的化合物(i)，反应液中荧光探针的终浓度为50μM，在96孔筛板中用酶标仪立即检测荧光强度，分析荧光强度与时间的关系如图1，图2所示。

[0056] 实验证明，随着时间的延长荧光强度均逐渐增加，且当反应到15min时Em＝460nm处TPE的荧光开始下降而荧光素的发射荧光强度增加缓慢，说明本章节所设计的探针能够对碱性磷酸酶进行检测。而且随着时间的延长，探针在530nm处的荧光值I530跟探针在460nm处的荧光值I460的比值I530/I460在逐渐的增大，最后趋于稳定。说明该探针能用于检测碱性磷酸酶，也进一步验证了探针与酶作用后成为水不溶化合物而聚集，该化合物逐渐被氧化为化合物H。

[0057] 实施例3：FRET荧光探针浓度对碱性磷酸酶活性的检测：

[0058] 为了获取探针浓度对检测结果的影响，按照荧光探针的应用模型，设计一组梯度实验，取三组平行实验组。在微量离心管中加入适量的硼酸缓冲液(浓度50mM，pH＝8.4)，再加入20μL酶液(碱性磷酸酶样品用浓度50mM，pH值为8.4的硼酸缓冲液溶解，得到浓度为22.5mg/mL的酶液)，最后加适量的探针使得其终浓度为0μM、25μM、50μM、75μM、100μM、150μM、200μM，反应2h后取200μL用荧光酶标仪记录实验数据，λex/λem＝350/530nm。

[0059] 探针浓度对检测结果的影响如图3所示，从图中可以看出随着探针浓度的增加，碱性磷酸酶检测体系的荧光强度随之增加，并且当探针浓度高于50μM时，检测体系的荧光强度增加趋于缓慢，这说明当探针浓度高于50μM时，酶趋于反应完全。因此，探针对碱性磷酸酶的最适检测浓度选为50μM。

[0060] 实施例4：碱性磷酸酶浓度的检测：

[0061] 只要存在微量的碱性磷酸酶，就能高效的水解荧光探针，通过酶标仪检测系统可以测定，并且随着碱性磷酸酶的浓度增大，荧光强度从300增加到8000(如附图4)，变化的幅度较大，而且碱性磷酸酶的浓度与荧光强度成线性关系，通过荧光强度就可以直观地得出碱性磷酸酶的活性的变化，再根据米氏方程得到酶的各种反应常数。

[0062] 实施例5:

[0063] 取276μL浓度50mM，Ph8.4的硼酸缓冲液，加入碱性磷酸酶20μL(碱性磷酸酶样品用浓度50mM，pH值为8.4的硼酸缓冲液溶解，得到浓度为22.5mg/mL的酶液)，10mM的碱性磷酸酶抑制剂--EDTA溶液3μL，置于37℃恒温水浴摇床中，30分钟后，加入2μL实施例1制得的2-(3,6-二磷酸氧基-9H-氧杂蒽-9-基)-4(5)-((4-(1,2-二苯基-2-(对甲苯基)乙烯基)苯甲基)氨基甲酰基)苯甲酸的DMSO溶液(浓度7.5mM)，置于37℃恒温水浴摇床中，2小时后用酶标仪检测荧光强度。

[0064] 结果如图5所示加入抑制剂及用失活的酶的实验组的荧光强度在530nm均无增强峰型出现，证明我们所观察到的荧光变化来自于碱性磷酸酶将探针的磷酸基切断。

[0065] 实施例6：其他酶试验的检测结果

[0066] 将碱性磷酸酶换为下列酶制剂，分别对底物进行作用：胰激肽原酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、脂肪酶和牛血清蛋白，结果显示，反应体系均在460nm处荧光值增加而且对于不同酶及BSA荧光强度值有所变化，说明这些蛋白质同TPE结合的能力不同，那么单信号TPEs磷酸酶探针在混合酶中就难以区分荧光变化值是否来自于探针磷酸基的切断。从附图6中还可以看出检测体系中530nm处均无增强峰的出现，即化合物未被水解，说明本章节所设计的荧光探针能够对碱性磷酸酶进行专一的酶活检测，可以排除酶与TPE结合产生的荧光变化。