治疗用途

摘要

本发明涉及化合物的新治疗用途，所述化合物是H3受体的反向激动剂。特别地，本发明涉及这些化合物在治疗多发性硬化中的治疗用途。

权利要求

1.一种化合物，其是3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-5-((1-环丁基哌啶-4-基)甲基)-1,2,4-噁二唑，或其药学上可接受的盐。

2.根据权利要求1所述的化合物在制备用于治疗多发性硬化的药物中的用途。

说明书

治疗用途

技术领域

[0001] 本发明涉及化合物的新治疗用途，所述化合物是H3受体的反向激动剂。特别地，本发明涉及这些化合物在治疗多发性硬化中的治疗用途。

[0002] 发明背景

[0003] 多发性硬化(MS)是影响中枢神经系统的慢性炎性脱髓鞘疾病。MS中的基本损伤是炎性介导的CNS中轴突的脱髓鞘，其被认为是由改变的免疫系统功能引起的。脱髓鞘可以导致对轴突的营养支持减少、离子通道的重新分布和动作电位膜电位的失稳。轴突最初可以适应，但最终发生末梢和逆行变性，导致随后的失能的发生。

[0004] 越来越多的证据证明，存在内源性CNS修复机制来对抗MS进程中的脱髓鞘事件。这种髓鞘再生的过程是由称为少突细胞前体细胞(OPC)的前体细胞群介导的。尸检数据和实验研究指出OPC分化的失败是MS中髓鞘再生失败的主要原因。因此，通过OPC分化和保持少突细胞来早期促进髓鞘再生是MS中的重要靶标。脱髓鞘事件后，在脱髓鞘区域中OPC快速募集和扩增，它们在此处产生髓鞘形成的少突细胞。随着病变发展，存在显著的星形细胞增殖(神经胶质增生)。使少突细胞或从前体细胞中分化的那些存活可以部分地使存活的裸露轴突进行髓鞘再生，产生所谓的影斑。尽管应答于原发性脱髓鞘的髓鞘再生是被充分证明的，并且在个体亚组中可能是令人惊讶的有效，但其在MS进程中常常无效，其原因尚未完全了解。因此，完全髓鞘再生的病变相对稀少。反而会发现，在许多病变中，髓鞘再生没有完全无效，但限于在病变边界处新形成的髓鞘的小边缘。此外，在许多病变中已经显示出，OPC大量存在，但不能分化，因而支持了OPC分化的增强是MS中髓鞘再生的可行靶标的假设(Kotter等，Enhancing remyelination in disease-can we wrap it up？Brain(2011)134:1882-1990)。

[0005] 在MS的早期阶段，在强烈升高的疾病活性的短时间间隔中出现炎性发作。这些发作后接着是恢复和缓解的时期。在缓解期期间，神经系统病变中的局部肿胀消退，免疫细胞变得不太有活性或无活性，并且产生髓鞘的细胞使轴突进行髓鞘再生。神经信号增强，并且由炎症和脱髓鞘引起的失能变得较不严重或完全消失。将疾病的这个阶段称为复发-缓解MS(RRMS)。然而，病变没有全部完全治愈。一些作为“慢性”病变保留下来，其通常具有脱髓鞘的核心区，其缺乏免疫细胞。随着时间过去，这类病变的中心的神经元大部分死亡，尽管炎症常常在其边缘持续。大脑可以很好地适应一些神经元的损失，并且永久性失能可以很多年都不发生。然而，超过50％的患有MS的病人最终进入进行性退化的阶段，称为继发性进行性MS(SPMS)。在这个阶段中，疾病不再很好地对疾病改善药物作出反应，并且病人的失能不断恶化。在MS的自然进程中早期的神经元破坏表明MS的进行性失能可能是累积的神经元损失的结果，其最终压倒了大脑的补偿能力。原发性进行性MS是一种其中不存在复发的多发性硬化类型，但经过几年的时间，存在身体和认知功能的逐渐丧失。

[0006] 尽管多发性硬化症状和疾病的进程在人与人之间可能是不同的，但存在疾病-复发-缓解MS、继发性进行性MS和原发性进行性MS三种形式。

[0007] 所有目前批准用于治疗MS的疗法是作用于降低发作的次数。这些疗法是免疫调节剂，并且它们没有起到从根本上改变MS进程的作用，而是提供降低复发和减缓疾病进展的适度效果，如通过扩展失能状态量表(EDSS)测量的。研究显示出目前的疗法将复发降低了大约30-68％并且将经历持续失能的相对风险的复发MS病人的百分比降至30-42％的范围内(Havrdova等(2010)Neurology74:(增补3)，S3-S7)。此外，存在处于I期临床开发中的抗体，如BIIB033(Biogen Idec)，其目的在于提供初步的神经保护/神经再生功效。临床前数据表明BIIB033可以作用于修复轴突和/或髓鞘损伤(Mi等(2007)Nature Medicine13:1228-1233)。

[0008] 在许多专利申请中已经公开了组胺H3受体的拮抗剂和反向激动剂。已经鉴定出H3受体主要在哺乳动物中枢神经系统(CNS)中表达，除了在一些交感神经上，在外周组织中具有最小的表达(Leurs等，(1998)，Trends Pharmacol.Sci.19:177-183)。通过选择性激动剂或组胺激活H3受体导致对各种不同神经群的神经递质释放的抑制，包括组胺能神经元和胆碱能神经元(Schlicker等，(1994)Fundam.Clin.Pharmacol.8:128-137)。此外，体外和体内研究已经表明H3拮抗剂可以促进与认知相关的大脑区域(如大脑皮层和海马状突起)中的神经递质释放(Onodera等，(1998)，见：The Histamine H3receptor，编辑Leurs和Timmerman，pp255-267，Elsevier Science B.V.)。此外，文献中的大量报道已经证明了H3拮抗剂(例如，硫丙咪胺(thioperamide)、clobenpropit、ciproxifan和GT-2331)在啮齿动物模型(包括五种选择任务、目标识别、高架十字迷宫、新任务的获得和被动回避)中的认知增强性能(Giovanni等，(1999)Behav.Brain Res.104:147-155)。已经研究了拮抗剂和部分激动剂用于治疗神经疾病中的认知损伤。

[0009] 发明概述

[0010] 现在在分化中的少突细胞上发现了H3受体。此外，作为H3受体反向激动剂起作用的化合物已经显示出促进少突细胞前体的分化。发明人也已经证明H3受体的反向激动剂可以通过提高的少突细胞前体分化来增强髓鞘再生。因此，H3受体的反向激动剂可以用作治疗MS和其他脱髓鞘疾病的新疗法。

[0011] 在本发明的第一个方面中，提供了一种化合物，其是用于治疗MS的H3受体的反向激动剂，其中所述治疗减缓、停止或逆转失能的进展。在本发明的另一个方面中，提供了一种化合物，其是用于减缓、停止或逆转MS中的失能进展的H3受体的反向激动剂。

[0012] 在本发明的一个实施方案中，所述化合物是1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 (benzazepin)-7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮或其药学上可接受的盐。

[0013] 本发明提供了1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮或其药学上可接受的盐，其用于通过每天口服施用5至500微克的剂量来治疗人的MS。在一个实施方案中，本发明提供了1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮或其药学上可接受的盐，其用于通过每天口服施用的10至150微克的剂量来治疗人的MS。在另一个实施方案中，本发明提供了1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮或其药学上可接受的盐，其用于通过每天口服给药的约80微克的剂量来治疗人的MS。

[0014] 在本发明的第二个方面中，提供了一种化合物，其是用于促进髓鞘再生的H3受体的反向激动剂。

[0015] 在本发明的一个实施方案中，所述H3受体反向激动剂是1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮或其药学上可接受的盐。

[0016] 在本发明的第三个方面中，提供了一种化合物，其是用于治疗脱髓鞘疾病的H3受体的反向激动剂。

[0017] 在本发明的一个实施方案中，所述H3受体反向激动剂是1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮或其药学上可接受的盐。

[0018] 在第四个方面中，本发明提供了用于口服给药于人的药物组合物，其包含作为H3受体的反向激动剂的化合物，其中所述药物组合物用于治疗MS或脱髓鞘疾病。在一个实施方案中，所述药物组合物包含5至500微克的1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮或其药学上可接受的盐，用于每天口服给药于人。在一个实施方案中，所述药物组合物包含10至150微克的1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮或其药学上可接受的盐，用于每天口服给药于人。在一个实施方案中，所述药物组合物包含约80微克的1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮或其药学上可接受的盐，用于每天口服给药于人。

[0019] 附图简要说明

[0020] 图1a-1c.H3R实施例化合物在OPC分化试验中的作用。

[0021] 图2.实施例化合物2(一种H3R反向激动剂)对OPC分化试验中成熟少突细胞标志物的表达的作用。

[0022] 图3a.实施例化合物1(一种H3R反向激动剂)在OPC分化试验中的作用(n＝2)。

[0023] 图3b.实施例化合物1在OPC分化试验中的作用(n＝5)。

[0024] 图4a.经由siRNA的H3R敲除(knockdown)对OPC分化的作用。

[0025] 图4b.具有统计学分析的经由siRNA的H3R敲除对OPC分化的作用。

[0026] 图5a.实施例化合物1对双环己酮草酰二腙(cuprizone)模型中的髓鞘再生的作用(前脑、胼胝体，黑-金II染色)。

[0027] 图5b.实施例化合物1对双环己酮草酰二腙模型中的髓鞘再生的作用(后脑、胼胝体，黑-金II染色)。

[0028] 图5c.实施例化合物1对双环己酮草酰二腙模型中的髓鞘再生的作用的统计学分析(胼胝体，脱髓鞘区域)。

[0029] 图5d.实施例化合物1对双环己酮草酰二腙模型中的髓鞘再生的作用的统计学分析(胼胝体，平均强度)。

[0030] 图5e.实施例化合物2对双环己酮草酰二腙模型中的髓鞘再生的作用(前脑、胼胝体)。

[0031] 图5f.实施例化合物2对双环己酮草酰二腙模型中的髓鞘再生的作用(前脑、皮层)。

[0032] 图6a.实施例化合物2对原发性OPC中的cAMP胞内水平的作用(n＝1)。

[0033] 图6b.实施例化合物2对原发性OPC中的cAMP胞内水平的作用(n＝2)。

[0034] 图7.实施例化合物1对H3R的基础GTPγS结合的作用。

[0035] 发明详述

[0036] 在本发明的第一个方面中，提供了一种化合物，其是用于治疗MS的H3受体反向激动剂，其中所述治疗减缓、停止或逆转失能的进展。在本发明的另一个方面中，提供了一种化合物，其是用于减缓、停止或逆转MS中的失能进展的H3受体反向激动剂。在本发明的另一个方面中，提供了一种化合物，其是用于停止或逆转MS中失能进展的H3受体反向激动剂。在本发明的另一个方面中，提供了一种化合物，其是用于减缓MS中失能进展的H3受体反向激动剂。

[0037] 在本发明的一个实施方案中，所述化合物是1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮、3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯(dioxol)-5-基)-5-((1-环丁基哌啶-4-基)甲基)-1,2,4-噁二唑或4-(4-((1-异丙基哌啶-4-基)氧)哌啶-1-基)苄腈；或其药学上可接受的盐。

[0038] 在本发明的一个实施方案中，所述化合物是1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮，或其药学上可接受的盐。

[0039] 本发明提供了1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮或其药学上可接受的盐，其用于通过每天口服施用5至500微克的剂量来治疗人的MS。在一个实施方案中，本发明提供了1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮或其药学上可接受的盐，其用于通过每天口服施用的10至150微克的剂量来治疗人的MS。在另一个实施方案中，本发明提供了1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮或其药学上可接受的盐，其用于通过每天口服施用的约80微克的剂量来治疗人的MS。

[0040] 还提供了将化合物用于制备用于治疗MS的药物的用途，所述化合物是H3受体的反向激动剂，其中所述治疗减缓、停止或逆转失能的进展。在本发明的另一个方面中，提供了将化合物用于制备用于减缓、停止或逆转MS中的失能进展的药物的用途，所述化合物是H3受体的反向激动剂。

[0041] 在本发明的一个实施方案中，所述化合物是1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮、3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-5-((1-环丁基哌啶-4-基)甲基)-1,2,4-噁二唑或4-(4-((1-异丙基哌啶-4-基)氧)哌啶-1-基)苄腈；或其药学上可接受的盐。

[0042] 在本发明的一个实施方案中，所述化合物是1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮，或其药学上可接受的盐。

[0043] 还提供了一种治疗包括人类的哺乳动物中的MS的方法，其中所述治疗减缓、停止或逆转失能的进展，所述方法包括将治疗有效量的化合物给药于患者，所述化合物是H3受体的反向激动剂。

[0044] 在本发明的一个实施方案中，所述化合物是1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮、3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-5-((1-环丁基哌啶-4-基)甲基)-1,2,4-噁二唑或4-(4-((1-异丙基哌啶-4-基)氧)哌啶-1-基)苄腈；或其药学上可接受的盐。

[0045] 在本发明的一个实施方案中，所述化合物是1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮，或其药学上可接受的盐。

[0046] 本发明提供了一种治疗人的MS的方法，其中所述治疗减缓、停止或逆转了失能的进展，所述方法包括将每天5至500微克剂量的1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 卓-7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮或其药学上可接受的盐口服给药于人。在一个实施方案中，本发明提供了一种治疗人的MS的方法，其中所述治疗减缓、停止或逆转失能的进展，所述方法包括将每天10至150微克剂量的1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮或其药学上可接受的盐口服给药于人。在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗人的MS的方法，其中所述治疗减缓、停止或逆转失能的进展，所述方法包括将每天约80微克剂量的
1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮或其药学上可接受的盐口服给药于人。

[0047] 在本发明的一个实施方案中，所述治疗通过促进少突细胞前体细胞的分化而减缓、停止或逆转失能的进展。

[0048] 在本发明的第二个方面中，提供了一种化合物，其是用于促进髓鞘再生的H3受体反向激动剂。

[0049] 在本发明的一个实施方案中，所述化合物是1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮、3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-5-((1-环丁基哌啶-4-基)甲基)-1,2,4-噁二唑、4-(4-((1-异丙基哌啶-4-基)氧)哌啶-1-基)苄腈；或其药学上可接受的盐。

[0050] 在本发明的一个实施方案中，所述化合物是1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮，或其药学上可接受的盐。

[0051] 在本发明的另一个实施方案中，所述化合物是1-(3-(3-(4-氯苯基)丙氧基)丙基)-哌啶、(R)-6-(4-(3-(2-甲基吡咯烷-1-基)丙氧基)苯基)哒嗪-3(2H)-酮，或N’-(4-氯苄基)-3-(1H-咪唑-4-基)丙基硫甲脒二氢溴酸盐；或其药学上可接受的盐。

[0052] 还提供了将化合物用于制备促进髓鞘再生的药物的用途，所述化合物是H3受体的反向激动剂。

[0053] 在本发明的一个实施方案中，所述化合物是1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮、3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-5-((1-环丁基哌啶-4-基)甲基)-1,2,4-噁二唑或4-(4-((1-异丙基哌啶-4-基)氧)哌啶-1-基)苄腈；或其药学上可接受的盐。

[0054] 在本发明的一个实施方案中，所述化合物是1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮，或其药学上可接受的盐。

[0055] 在本发明的另一个实施方案中，所述化合物是1-(3-(3-(4-氯苯基)丙氧基)丙基)-哌啶、(R)-6-(4-(3-(2-甲基吡咯烷-1-基)丙氧基)苯基)哒嗪-3(2H)-酮，或N’-(4-氯苄基)-3-(1H-咪唑-4-基)丙基硫甲脒二氢溴酸盐；或其药学上可接受的盐。

[0056] 还提供了一种促进哺乳动物(包括人类)中的髓鞘再生的方法，所述方法包括将治疗有效量的化合物给药于需要的受试者，所述化合物是H3受体的反向激动剂。

[0057] 在本发明的一个实施方案中，所述化合物是1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮、3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-5-((1-环丁基哌啶-4-基)甲基)-1,2,4-噁二唑或4-(4-((1-异丙基哌啶-4-基)氧)哌啶-1-基)苄腈；或其药学上可接受的盐。

[0058] 在本发明的一个实施方案中，所述化合物是1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮，或其药学上可接受的盐。

[0059] 在本发明的另一个实施方案中，所述化合物是1-(3-(3-(4-氯苯基)丙氧基)丙基)-哌啶、(R)-6-(4-(3-(2-甲基吡咯烷-1-基)丙氧基)苯基)哒嗪-3(2H)-酮，或N’-(4-氯苄基)-3-(1H-咪唑-4-基)丙基硫甲脒二氢溴酸盐；或其药学上可接受的盐。

[0060] 在本发明的第三个方面中，提供了用于治疗脱髓鞘疾病的化合物，所述化合物是H3受体的反向激动剂。

[0061] 在本发明的一个实施方案中，所述化合物是1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮、3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-5-((1-环丁基哌啶-4-基)甲基)-1,2,4-噁二唑、4-(4-((1-异丙基哌啶-4-基)氧)哌啶-1-基)苄腈；或其药学上可接受的盐。

[0062] 在本发明的一个实施方案中，所述H3受体反向激动剂是1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮，或其药学上可接受的盐。

[0063] 在本发明的另一个实施方案中，所述化合物是1-(3-(3-(4-氯苯基)丙氧基)丙基)-哌啶、(R)-6-(4-(3-(2-甲基吡咯烷-1-基)丙氧基)苯基)哒嗪-3(2H)-酮，或N’-(4-氯苄基)-3-(1H-咪唑-4-基)丙基硫甲脒二氢溴酸盐；或其药学上可接受的盐。

[0064] 还提供了将化合物用于制备治疗脱髓鞘疾病的药物的用途，所述化合物是H3受体的反向激动剂。

[0065] 在本发明的一个实施方案中，所述化合物是1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮、3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-5-((1-环丁基哌啶-4-基)甲基)-1,2,4-噁二唑或4-(4-((1-异丙基哌啶-4-基)氧)哌啶-1-基)苄腈；或其药学上可接受的盐。

[0066] 在本发明的一个实施方案中，所述化合物是1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮，或其药学上可接受的盐。

[0067] 在本发明的另一个实施方案中，所述化合物是1-(3-(3-(4-氯苯基)丙氧基)丙基)-哌啶、(R)-6-(4-(3-(2-甲基吡咯烷-1-基)丙氧基)苯基)哒嗪-3(2H)-酮，或N’-(4-氯苄基)-3-(1H-咪唑-4-基)丙基硫甲脒二氢溴酸盐；或其药学上可接受的盐。

[0068] 还提供了一种治疗哺乳动物(包括人类)的脱髓鞘疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的化合物给药于需要的受试者，所述化合物是H3受体的反向激动剂。

[0069] 在本发明的一个实施方案中，所述化合物是1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮、3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-5-((1-环丁基哌啶-4-基)甲基)-1,2,4-噁二唑或4-(4-((1-异丙基哌啶-4-基)氧)哌啶-1-基)苄腈；或其药学上可接受的盐。

[0070] 在本发明的一个实施方案中，所述化合物是1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮，或其药学上可接受的盐。

[0071] 在第四个方面中，本发明提供了一种用于口服给药于人的药物组合物，其包含作为H3受体的反向激动剂的化合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂。在一个实施方案中，所述药物组合物包含5至500微克的1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮或其药学上可接受的盐，用于每天口服给药于人。在一个实施方案中，所述药物组合物包含10至150微克的1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮或其药学上可接受的盐，用于每天口服给药于人。在一个实施方案中，所述药物组合物包含约80微克的1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮或其药学上可接受的盐，用于每天口服给药于人。

[0072] 在第五个方面中，本发明提供了用于治疗MS的化合物，其是H3受体的反向激动剂。在一个实施方案中，所述H3受体反向激动剂是1-(3-(3-(4-氯苯基)丙氧基)丙基)-哌啶，或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，所述H3受体反向激动剂是(R)-6-(4-(3-(2-甲基吡咯烷-1-基)丙氧基)苯基)哒嗪-3(2H)-酮，或其药学上可接受的盐。

[0073] 还提供了将化合物用于制备治疗MS的药物的用途，所述化合物是H3受体的反向激动剂。在一个实施方案中，所述H3受体反向激动剂是1-(3-(3-(4-氯苯基)丙氧基)丙基)-哌啶，或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，所述H3受体反向激动剂是(R)-6-(4-(3-(2-甲基吡咯烷-1-基)丙氧基)苯基)哒嗪-3(2H)-酮，或其药学上可接受的盐。

[0074] 还提供了一种治疗哺乳动物(包括人类)的MS的方法，所述方法包括将治疗有效量的化合物给药于患者，所述化合物是H3受体的反向激动剂。在一个实施方案中，所述H3受体反向激动剂是1-(3-(3-(4-氯苯基)丙氧基)丙基)-哌啶，或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，所述H3受体反向激动剂是(R)-6-(4-(3-(2-甲基吡咯烷-1-基)丙氧基)苯基)哒嗪-3(2H)-酮，或其药学上可接受的盐。

[0075] 如本文中所用的，H3受体的反向激动剂是将H3受体稳定于无活性构象中的化合物。这种稳定作用导致受体与G蛋白的自发性偶联的降低，由此抑制固有活性。在不存在固有活性的情况下，反向激动剂表现为拮抗剂，因此之前很多文献将化合物描述为H3拮抗剂和/或反向激动剂。已经报道了H3受体的反向激动及其分析方法(Constitutive Activity of Histamine H3Receptors Stably Expressed in SK-N-MC Cells:Display of Agonism and Inverse Agonism by H3Antagonists，Wieland等(2001)，JPET299:908-914)。

[0076] H3受体的反向激动剂还可以在功能上定义为结合H3受体并且与此同时提高cAMP的胞内水平和激活cAMP途径的化合物。

[0077] 通过使用评价各种功能系统的量表来实现患有多发性硬化的个体中神经学损伤的测量；最广泛使用的是扩展失能状态量表(EDSS)或多发性硬化功能综合量表(MSFC)。依据EDSS的评分范围从0(正常的神经学检查)至10.0(死亡)。MSFC由测量手臂和手灵巧性、行走速度和认知的3个分量构成。这些量表已经被用于评价个体病人中的失能进展和测量目前批准的治疗在大规模临床研究中的影响。临床研究治疗效果可以被评价为整个群体的平均变化或被评价为在给定时间段内具有持续给定变化的患者的数量。

[0078] 目前批准的治疗没有一个明确展示过失能进展的停止或逆转，也没有一个明显地减缓失能进展，如通过EDSS或MSFC测量的。

[0079] 预期使用H3反向激动剂的治疗能够促进髓鞘再生。髓鞘再生将具有两个可能的结果：a)正常的神经脉冲传导(跳跃式传导)的恢复，由此潜在地逆转失能/损伤；和b)保护轴突免受剂型急性或慢性的变性机制损害，由此防止轴突损失以及由此引起的失能进展。可以使用功能量表，如EDSS和MSFC来测量失能。

[0080] 在本发明的另一个方面中，提供了一种化合物，其是3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-5-((1-环丁基哌啶-4-基)甲基)-1,2,4-噁二唑，或其药学上可接受的盐。

[0081] 合成方法

[0082] 可以通过WO2004/056369中提及的方法或通过WO2005/123723中提及的方法来产生1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮，及其药学上可接受的盐。

[0083] 可以按照WO2005/014571中所描述的来产生4-(4-((1-异丙基哌啶-4-基)氧)哌啶-1-基)苄腈，及其药学上可接受的盐。

[0084] 可以根据以下的方案1来产生3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-5-((1-环丁基哌啶-4-基)甲基)-1,2,4-噁二唑：

[0085]

[0086] 因为它们在医学中的潜在用途，本发明的化合物的盐理想地是药学上可接受的。对于合适的盐的概述，参见Berge等，J.Pharm.Sci.，66:1-19(1977)。通常，可以按照需要使用期望的酸或碱来容易地制得药学上可接受的盐。所得到的盐可以从溶液中沉淀出来并且通过过滤收集，或可以通过溶剂的蒸发来回收。

[0087] 可以通过将本发明的化合物与合适的无机或有机碱(例如，三乙胺、乙醇胺、三乙醇胺、胆碱、精氨酸、赖氨酸或组氨酸)反应来形成药学上可接受的碱加成盐，任选在合适的溶剂中，以获得碱加成盐，其通常通过例如结晶和过滤分离。药学上可接受的碱盐包括铵盐、碱金属盐(如钠和钾的那些)、碱土金属盐(如钙和镁的那些)以及与有机碱的盐，包括伯胺、仲胺和叔胺的盐，如异丙胺、二甲胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺和N-甲基-D-葡糖胺。

[0088] 可以通过将本发明的化合物与合适的无机或有机酸(如，氢溴酸、盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、琥珀酸、马来酸、乙酸、丙酸、富马酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、苯甲酸、水杨酸、谷氨酸、天冬氨酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸、萘磺酸如2-萘磺酸，或己酸)反应来形成药学上可接受的酸加成盐，任选在合适的溶剂中，如有机溶剂中，以获得盐，其通常通过例如结晶和过滤分离。本发明的化合物的药学上可接受的酸加成盐可以包含或例如是氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、醋酸盐、丙酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、乳酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐、对甲苯磺酸盐、苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、萘磺酸盐(例如2-萘磺酸盐)或己酸盐。

[0089] 可以将其他非药学上可接受的盐，例如甲酸盐、草酸盐或三氟乙酸盐，用于例如本发明的化合物的分离中，并且包括在本发明的范围内。

[0090] 1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮的药学上可接受的盐包括WO2004/056369中所描述的那些。4-(4-((1-异丙基哌啶-4-基)氧)哌啶-1-基)苄腈的药学上可接受的盐包括WO2005/014571中所描述的那些。可以按照以上所述的来产生3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-5-((1-环丁基哌啶-4-基)甲基)-1,2,4-噁二唑的药学上可接受的盐，特别是如上所述的酸加成盐，并且特别包括盐酸盐。

[0091] 用途

[0092] H3受体的反向激动剂及其药学上可接受的盐，特别是1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮及其药学上可接受的盐，可以用于减缓、停止或逆转MS中的失能的进展。在一个方面中，H3受体的反向激动剂及其药学上可接受的盐，特别是1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂-7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮及其药学上可接受的盐，可以通过恢复正常的神经脉冲传导(跳跃式传导)来促进髓鞘再生，由此潜在地逆转失能/损伤。在另一个方面中，H3受体的反向激动剂及其药学上可接受的盐，特别是1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮及其药学上可接受的盐，可以通过保护轴突免受急性或慢性的变性机制的影响来促进髓鞘再生，由此防止轴突损失和随后的失能进展。

[0093] H3受体的反向激动剂及其药学上可接受的盐，特别是1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮及其药学上可接受的盐，可以用于治疗多发性硬化，包括放射孤立综合征、临床孤立综合征、复发-缓解多发性硬化、继发性进行性多发性硬化、原发性进行性多发性硬化、进行性/复发性多发性硬化、视神经脊髓炎和急性MS(马尔堡病(Marburg)的变体)。在一个方面中，H3受体的反向激动剂及其药学上可接受的盐，特别是1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮及其药学上可接受的盐，可以用于治疗复发-缓解多发性硬化(RRMS)。在另一个方面中，H3受体的反向激动剂及其药学上可接受的盐，特别是1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮及其药学上可接受的盐，可以用于治疗继发性进行性多发性硬化(SPMS)。

[0094] H3受体的反向激动剂及其药学上可接受的盐，特别是1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮及其药学上可接受的盐，还可以用于治疗引起脱髓鞘的疾病，例如，急性播散性脑脊髓炎、视神经炎、维生素B12缺乏症、脑桥中央髓鞘溶解、脊髓痨、横贯性脊髓炎、进行性多灶性白质脑病和脑白质营养不良。

[0095] H3受体的反向激动剂及其药学上可接受的盐，特别是1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮及其药学上可接受的盐，还可以用于治疗具有脱髓鞘特征的痴呆疾病，包括血管性痴呆、混合型痴呆和阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)。

[0096] H3受体的反向激动剂及其药学上可接受的盐，特别是1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮及其药学上可接受的盐，在外周神经系统的脱髓鞘疾病的治疗中也具有潜在用途，所述疾病包括慢性炎性脱髓鞘多发性神经病、格林-巴利(Guillain-Barré)综合症、急性炎性脱髓鞘多发性神经病、Miller Fisher综合征、急性运动轴突神经病、急性运动感觉轴突神经病、急性泛自主神经病、Bickerstaff’s脑干脑炎、抗-MAG外周神经病、Charcot-Marie-Tooth病和铜缺乏。

[0097] 剂量

[0098] 本发明的化合物可以口服给药。本发明的化合物可以以每天约1至约1000微克，或每天约5至约500微克，或每天10至150微克的剂量给药于人。

[0099] 本发明提供了1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮或其药学上可接受的盐，其用于通过每天口服给药5至500微克剂量的1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮或其药学上可接受的盐治疗人的MS或脱髓鞘疾病。在一个实施方案中，以每天10至150微克的剂量来提供1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂-7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮或其药学上可接受的盐用于人的口服给药。在一个实施方案中，以每天约80微克的剂量来提供1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮或其药学上可接受的盐用于人的口服给药。

[0100] 药物组合物

[0101] 本发明的化合物可以配制成药物剂型，其含有本发明的化合物或其药学上可接受的盐和一种或多种药学上可接受的赋形剂。本领域描述了这样的剂型和赋形剂。例如，1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮可以以多个剂量水平配制于药物组合物中，如WO2004/05369和WO2008/104590中所描述的。

[0102] 本发明提供了一种用于口服给药于人的药物组合物，其包含化合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂，所述化合物是H3受体的反向激动剂，其中所述药物组合物用于治疗MS或脱髓鞘疾病。在一个实施方案中，所述药物组合物包含用于每天口服给药于人的5至500微克本发明的化合物或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，所述药物组合物包含用于每天口服给药于人的10至150微克本发明的化合物或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，所述药物组合物包含用于每天口服给药于人的约80微克本发明的化合物或其药学上可接受的盐。

[0103] 组合

[0104] 根据本发明给药的化合物可以联合其他治疗剂来使用，例如声称在多发性硬化的治疗中有用的药物。这样的其他治疗剂的合适实例可以是醋酸格拉替雷(Copaxone)、β干扰素-1a(Avonex和Rebif)、β干扰素-1b(Betaseron)、芬戈莫德(Gilenya)和那他珠单抗(Tysabri)。其他合适的药剂包括BG-12、Peg-Avonex、拉喹莫德、特立氟胺、达利珠单抗(Zenapax)、阿仑单抗(Campath)、BAF312、ONO-4641、ponesimod、Pleneva、plovamer、ATX-MS-1467、Trimesta、V85546、ATL-1102、奥 法 木 单 抗、secukinumab、LY-2127399、toxavin、manocort和Firategrast。

[0105] 当本发明的化合物或其药学上可接受的盐联合其他治疗剂使用时，化合物可以通过任何方便的途径按序或同时施用。

[0106] 在另一个方面中，本发明因此提供了1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮或其药学上可接受的盐与进一步的一种或多种治疗剂的组合。

[0107] 以上所述的组合可以方便地以药物制剂的形式呈现来使用，并且因此包含如上定义的组合与药学上可接受的载体或赋形剂的药物制剂构成了本发明的进一步的方面。这样的组合的单个成分可以在分开的或组合的药物制剂中按序或同时给药。

[0108] 当本发明的化合物或其药学上可接受的盐与对抗相同病况的第二种治疗剂活性物质联合使用时，每种化合物的剂量可以不同于化合物单独使用时的剂量。实施例

[0109] 缩写

[0110] bFGF 碱性成纤维细胞生长因子

[0111] BDM 基础的化学确定培养基

[0112] BSA 牛血清白蛋白

[0113] CNS 中枢神经系统

[0114] CPZ 双环己酮草酰二腙

[0115] EDSS 扩展失能状态量表

[0116] GPCR G蛋白偶联受体

[0117] H3R 组胺受体3

[0118] IOD 积分光密度

[0119] MAG 髓鞘相关糖蛋白

[0120] MBP 髓鞘碱性蛋白

[0121] MS 多发性硬化

[0122] NAc N-乙酰-L-半胱氨酸

[0123] OCT 最佳切割温度溶液

[0124] OPC 少突细胞前体细胞

[0125] PBS 磷酸盐缓冲盐水

[0126] PDGF 血小板源生长因子

[0127] PDL 多-D-赖氨酸

[0128] PFA 多聚甲醛

[0129] PO 多鸟氨酸

[0130] RRMS 复发-缓解MS

[0131] RT-PCR聚合酶链式反应

[0132] SEM 平均值标准误差

[0133] siRNA 小干扰RNA

[0134] SPMS 继发性进行性MS

[0135] 描述1：苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-甲腈

[0136] 向苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-甲醛(16g,107mmol)、甲酸钠(14.50g，213mmol)的甲酸(150mL)溶液中，加入固体盐酸羟胺(22.22g，320mmol)。
将反应混合物在100℃下搅拌2hr。在减压下除去溶剂。然后，加入H2O(200mL)，用DCM(200mL×3)提取混合物，将合并的有机层通过硫酸钠干燥，并且在减压下蒸发以获得苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-甲腈(15g，91％)的黄色固体。

[0137] 1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.21(d，J ＝ 8.0Hz，1H)，7.03(s，1H)，6.86(d，J ＝8.0Hz，1H)，6.07(s，2H)。

[0138] 描述2：(Z)-N’-羟基苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-甲脒

[0139]

[0140] 向苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-甲腈(15g，102mmol)、盐酸羟胺(14.17g，204mmol)的乙醇(500mL)溶液中，一次性加入Na2CO3(54.0g，510mmol)。将反应混合物在
80℃下搅拌5hr。然后，在减压下除去溶剂，用DCM(1L×4)洗涤残余物，过滤，并将合并的滤液在减压下浓缩，获得了(Z)-N’-羟基苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-甲脒(15g，+ +
73.5％)的黄色固体。MS(ES)m/z181.1(MH)。

[0141] 描述3：2-(1-苄基哌啶-4-亚基)乙酸乙酯

[0142]

[0143] 向1-苄基哌啶-4-酮(30g，159mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(400mL)溶液中加入固体2-(三苯基正膦亚基)乙酸乙酯(110g，317mmol)。将反应混合物在120℃下搅拌20hr。将反应混合物过滤并且将滤液在减压下浓缩，通过硅胶柱色谱纯化粗制产物(石油醚:乙酸乙酯＝20:1)以获得2-(1-苄基哌啶-4-基亚基)乙酸乙酯(24g，55.5％)的+ +黄色油状物。MS(ES)m/z259.9(MH)。

[0144] 描述4：2-(哌啶-4-基)乙酸乙酯

[0145]

[0146] 向2-(1-苄基哌啶-4-亚基)乙酸乙酯(24g，93mmol)的乙酸乙酯(300mL)溶液中加入Pd/C(3.94g)。使用H-cube氢化混合物(设定：55℃，55psi)16hr。将反应混合物过滤，并且将滤液在减压下浓缩，以获得2-(哌啶-4-基)乙酸乙酯(15g，90％)的无色油状物。

[0147] 1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：4.10(m，2H)，3.03(d，J ＝ 16.4Hz，2H)，2.59(t，J ＝16.4Hz，2H)，2.19(d，J＝9.6Hz，2H)，1.87(m，1H)，1.67(d，J＝17.2Hz，2H)，1.23(t，J＝
9.6Hz，3H)，1.10(m，2H).

[0148] 描述5：2-(1-环丁基哌啶-4-基)乙酸乙酯

[0149]

[0150] 在20℃空气中搅拌下，向2-(哌啶-4-基)乙酸乙酯(13g，76mmol)、环丁酮(6.92g，99mmol)的二氯甲烷(DCM)(200mL)溶液中，一次性加入乙酸(4.35mL，76mmol)。将反应混合物在25℃下搅拌0.5hr。然后将三乙酰氧硼氢化钠(25.7g，121mmol)加入上述混合物中。将反应混合物在25℃下搅拌3hr。用NaOH溶液(2M，150mL)洗涤混合物，用DCM(200mL×3)提取无机层，将合并的有机层通过硫酸钠干燥，并且在减压下蒸发，以获得2-(1-环丁基哌啶-4-基)乙酸乙酯(15g，79％)的无色油状物。

[0151] 1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：4.06(m，2H)，3.23(d，J ＝ 15.6Hz，2H)，3.01(m，1H)，1.96-2.28(m，8H)，1.70-1.81(m，4H)，1.48-1.65(m，3H)，1.19(t，J＝9.6Hz，3H).[0152] 描述6：2-(1-环丁基哌啶-4-基)乙酸的制备

[0153]

[0154] 将2-(1-环丁基哌啶-4-基)乙酸乙酯(18g，80mmol)和HCl(12M。150mL)的混合物加热至100℃，并且将反应混合物在100℃下搅拌5hr。然后，在减压下除去溶剂，以获得2-(1-环丁基哌啶-4-基)乙酸(12g，68.5％)的棕色固体。

[0155] 1H NMR(400MHz，DMSO)δ：3.51(m，1H)，3.26(d，J ＝ 12.0Hz，2H)，2.67(m，2H)，2.33(m，2H)，2.17(d，J＝6.8Hz，2H)，2.12(m，2H)，1.82(m，3H)，1.68(m，2H)，1.51(m，2H).[0156] 描述7：(Z)-N-(苯并[d][1，3]间二氧杂环戊烯-5-基(肟基)甲基-2-(1-环丁基-哌啶-4-基)乙酰胺：

[0157]

[0158] 向20℃下搅拌的2-(1-环丁基哌啶-4-基)乙酸(3g，15.21mmol)、HATU(8.67g，22.81mmol)和DIPEA(7.97mL，45.6mmol)的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)(20mL)溶液中，加入固体(Z)-N’-羟基苯并[d][1，3]间二氧杂环戊烯-5-甲脒(2.74g，15.21mmol)。将反应混合物在20℃下搅拌1hr。然后，加入H2O(50mL)，用DCM(30mL×3)提取混合物，将合并的有机层通过硫酸钠干燥，并且在减压下蒸发，将粗制产物直接用于下一个步骤中(3g，49.4％)。
+ +
MS(ES)m/z360.2(MH)。

[0159] 实施例1

[0160] 1-{6-[(3-环丁基-2，3，4，5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮

[0161]

[0162] 将环丁酮(3.77kg)和乙酸(1.074kg)的混合物加入1-[6-(2，3，4，5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基氧)-3-吡啶基]-2-吡咯烷酮(WO2005/123723A1，描述3)(5.8kg)的二氯甲烷(58L)溶液中，并且将混合物在25-35℃下搅拌3小时，然后冷却至10-15℃。将三乙酰氧硼氢化钠(5.72kg)以10分钟的间隔分成四个等份加入，将温度维持在10-15℃。将所得到的混合物加热至25-35℃，并且搅拌3小时直至完全反应，如通过TLC测定的。

[0163] 将反应混合物冷却至5-10℃，用氢氧化钠水溶液(7.4％w/w)将pH调节至pH10-11，搅拌30-40分钟并进行相分离。用二氯甲烷(3×17.5L)提取水相。合并后的有机相用氯化钠水溶液(13％w/w)洗涤两次，过滤，并将滤液浓缩至小于14.5L。加入甲醇(29L)，在回流下将混合物加热25-30分钟，然后在真空下浓缩至小于14.5L，将温度维持低于50℃。将所述甲醇加入、加热和浓缩重复三次，每次使用29L甲醇。

[0164] 将残余物溶解于二氯甲烷(58L)中，用氯化钠水溶液(4.8％)洗涤三次，过滤，并浓缩至小于14.5L。加入甲醇(29L)，将混合物在回流下加热25-30分钟，然后在真空下浓缩至小于14.5L，将温度维持低于50℃。重复所述甲醇添加、加热和浓缩，并持续蒸馏至小于8.7L。将所得到的浆液在回流下溶解于2-丙醇中，并且在真空下蒸馏至小于8.7L，将温度维持低于60℃。使用29L的2-丙醇重复该操作。将残余物在回流下在2-丙醇(26L)中加热20分钟，冷却至70-75℃，并且加入1-{6-[(3-环丁基-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂 -7-基)氧]-3-吡啶基}-2-吡咯烷酮(6g)的2-丙醇(17mL)浆液。将混合物在50分钟内冷却至25-35℃，然后冷却至-5-0℃并搅拌3小时。将浆液过滤，用冷的2-丙醇(6L)洗涤滤饼，然后在50-60℃的真空下干燥，以获得标题产物(4.74kg)。

[0165] 实施例2

[0166] 3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-5-((1-环丁基哌啶-4-基)甲基)-1,2,4-噁二唑

[0167]

[0168] 将(Z)-N-(苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-基(肟基)甲基)-2-(1-环丁基-哌啶-4-基)乙酰胺(5g，13.91mmol)的N，N--二甲基甲酰胺(DMF)(30mL)溶液加热至120℃，并且将反应混合物在120℃下搅拌24hr。将反应混合物过滤，并且将滤液在减压下浓缩，通过制备高效液相色谱(Pre-HPLC)纯化粗制产物，以获得3-(苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-基)-5-((1-环丁基哌啶-4-基)甲基)-1，2，4-噁二唑(1.5g，31.6％)的白色固体。

[0169] 1H NMR(400MHz，MeOD)δ：7.60(d，J ＝ 8.0Hz，1H)，7.44(s，1H)，6.94(d，J ＝8.0Hz，1H)，6.04(s，2H)，2.90(m，4H)，2.74(m，1H)，2.04(m，2H)，1.68-2.03(m，10H)，
1.40(m，2H).

[0170] MS(ES+)m/z360.2(MH+)。

[0171] 实施例3

[0172] 4-(4-((1-异丙基哌啶-4-基)氧)哌啶-1-基)苄腈盐酸盐

[0173]

[0174] 可以按照WO2005014571中所描述的来产生4-(4-((1-异丙基哌啶-4-基)氧)哌啶-1-基)苄腈盐酸盐。

[0175] 比较实施例4

[0176] 4-[3-(苯基甲氧基)丙基]-1H-咪唑草酸盐

[0177]

[0178] 可以从商业来源(Santa Cruz Biotechnology，USA)购买4-[3-(苯基甲氧基)丙基]-1H-咪唑草酸盐。

[0179] 比较实施例5

[0180] 4-[3-(1H-咪唑4-基)丙基]哌啶二氢溴化物

[0181]

[0182] 可以从商业来源(Tocris Bioscience，UK)购买4-[3-(1H-咪唑4-基)丙基]哌啶二氢溴化物。

[0183] 实施例6

[0184] 1-(3-(3-(4-氯苯基)丙氧基)丙基)哌啶

[0185]

[0186] 1-(3-(3-(4-氯苯基)丙氧基)丙基)哌啶，H3R的反向激动剂(Schwartz，(2011)Br.J.Pharmacol.163:713-721)，购自商业来源(Tocris Bioscience，UK)。可以按照U.S.专利No.7169928中所描述的来合成实施例6化合物。

[0187] 实施例7

[0188] (R)-6-(4-(3-(2-甲基吡咯烷-1-基)丙氧基)苯基)哒嗪-3(2H)-酮

[0189]

[0190] (R)-6-(4-(3-(2-甲基吡咯烷-1-基)丙氧基)苯基)哒嗪-3(2H)-酮，H3R的反向激动剂，可以按照Hudkins等(J.Med.Chem.(2011)54:4781-4792)或U.S.专利No.8207168中所描述的来合成。

[0191] 实施例8

[0192] N’-(4-氯苄基)-3-(1H-咪唑-4-基)丙基硫甲脒二氢溴酸盐

[0193]

[0194] N’-(4-氯苄基)-3-(1H-咪唑-4-基)丙基硫甲脒二氢溴酸盐(也称为 clobenpropit) 是 H3R 的 反 向 激 动 剂 (Moreno-Delgado 等，Neuropharmacology(2006)51:517-523)。其从商业来源购得(Tocris Bioscience，UK)。

[0195] 生物学试验

[0196] 实施例9

[0197] 少突细胞前体细胞(OPC)分化试验

[0198] 使用以下试验测定了组胺受体3(H3R)的小分子反向激动剂和中性拮抗剂对OPC分化的作用。

[0199] 细胞分离

[0200] 由解剖2天大的大鼠幼仔的前脑获得了富集的OPC。将幼仔麻醉并斩首。然后，用微解剖剪刀剪开头骨，并用Dumont镊子取出皮层。用精细的尖端取出脑膜。通过细胞滤器重复研磨皮层后，用培养基将细胞重悬浮，所述培养基由补充了20％胎牛血清(Invitrogen，Carlsbad，CA)、谷氨酰胺(4mM，Invitrogen)的DMEM组成，并将细胞涂布于多-D-赖氨酸(PDL，100μg/ml，1h，Sigma，St.Louis，MO)-涂覆的T75烧瓶上。所得到的培养物每周两次供应新鲜的培养基，并且由于高浓度的血清，几乎所有神经元在一周内死亡。然后，使混合的胶质细胞接受一系列的摆脱(shake-off)程序，以在两周后获得纯的OPC。
具体地，将混合的胶质细胞最初在100rpm下振荡1小时以除去小胶质细胞，并且在37℃、
200rpm下振荡20-22小时以富集OPC。通过在1200rpm下离心5min来收集OPC，重悬浮于基础化学确定培养基(BDM)中。BDM由补充了N2培养基(100X，Invitrogen)、谷氨酰胺(4mM，Invitrogen)、BSA(0.1mg/ml，Sigma)、氢化可的松(20nM，Sigma)、硒(30nM，Sigma)和生物素(10nM，Sigma)的DMEM组成。将OPC接种于多鸟氨酸(PO，50μg/ml，1hr，Sigma)-涂覆的培养皿上，并且在实验操作之前，维持在补充了bFGF(10ng/ml，Invitrogen)和PDGF(10ng/ml，PeproTech，Rocky Hill，NJ)的BDM中。通过A2B5+染色判断了OPC为95％纯。

[0201] 药物和试剂

[0202] 用于免疫印迹和免疫细胞化学实验的抗体是兔抗髓鞘碱性蛋白(MBP，Millipore，Billerica，MA)、小鼠抗髓鞘相关糖蛋白(MAG，abcam，Cambridge，MA)。

[0203] OPC分化试验

[0204] 为了启动OPC分化，首先用0.05％的胰蛋白酶/EDTA处理OPC，并且以2,000至5,000细胞/孔的密度接种于PO-涂覆的384小孔板中。将每种测试化合物以10mM的浓度溶解于DMSO中用于试验。用Echo仪(Thermo，Waltham，MA)将不同浓度的化合物(全剂量曲线，0.3nM-10uM)加入OPC培养物中，一式两份。将OPC在补充了N-乙酰基-L-半胱氨酸(30μM，Sigma)的BDM中培养4天以分化为成熟的少突细胞。BDM包含DMEM(Invitrogen)、N2(100X，Invitrogen)、L-Glu(50X，Invitrogen)、丙酮酸钠(100X，Invitrogen)、BSA(0.1％，Sigma)、生物素(10nM，Sigma)、氢化可的松(10nM，Sigma)。用4％多聚甲醛(Sigma)将所得到的培养物固定，并且用封闭缓冲液(驴血清3％，Sigma；
Triton X-1000.04％，Sigma)将样品封闭。然后，将固定的细胞在第一抗体(抗髓鞘碱性蛋白、MBP抗体，在封闭缓冲液中600X稀释)中在4℃下温育过夜，用PBS彻底洗涤，然后用Alexa488-标记的第二抗体(Molecular Probes，Invitrogen)在室温下温育2h；然后用PBS彻底洗涤，并且用Dapi(1ug/ml，Sigma)染色。

[0205] 数据获取和分析

[0206] 通过基于图像的自动分析系统-Cellomics(Thermo)来读取全平板免疫细胞化学染色，并且如下作为MBP+群的百分比来获取每个孔的原始数据：获取每个孔的八个视野的图片并定量分析；孔数据是8个视野的平均。将细胞溶质中的抗-MBP染色的强度用作阳性目标的标准。基于阳性对照孔的平均强度来设定阳性目标的阈值，为此使用了三碘甲腺原氨酸(15nM)。然后，分析了数据，并以载体对照孔数量的倍数变化示出。通过Microsoft Excel和IDBS XL fit5软件生成曲线图。使用软件XL fit5进行了曲线拟合以得到阳性化合物的EC50。

[0207] 蛋白质印迹(Western blot)

[0208] 处理后，用冰冷PBS将OPC洗涤两次，并且将总的细胞裂解物收集于RIPA裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM原钒酸钠、50mM氟化钠、0.1％2-巯基乙醇、1％triton X-100和蛋白酶抑制剂混合物)中。将裂解物进行简短的声处理，并且在蛋白质印迹分析(Western analysis)之前，储存在-80℃。进行BCA蛋白试验试剂(PIERCE，Thermo)以确定蛋白质浓度。等分每个样品15μg的总蛋白质，在与2X SDS缓冲液(125mM Tris-HCl、4％SDS、20％甘油、100mM DTT)混合后煮沸5min，并且通过Bis-Tris微型凝胶(Invitrogen)上的SDS-PAGE分离。然后将分离的蛋白质转移至硝基纤维素膜上，并在室温下在5％奶/TBS-0.1％吐温中封闭1h。然后在5％奶/TBS-0.1％吐温中稀释的第一抗体的存在下，将膜在4℃下温育过夜。第二天，用TBS-0.1％吐温将膜洗三次，5min，并且在5％奶/TBS-0.1％中在室温下温育1h。

[0209] 吐温含有1:5000稀释的山羊抗-兔或山羊抗-小鼠第二抗体(JacksonImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA)。使用FUJI成像装置(FUJI，Tokyo，日本)，通过增强的化学发光底物混合物(PIERCE)进行了HRP偶联的第二抗体的检测。

[0210] 统计学分析

[0211] 除了图1之外的所有数据以平均值±平均值标准误差(SEM)给出。图1中的数据以平均值±标准偏差(SD)示出。合适时，使用单因素方差分析(one-way ANOVA)或student’s t检验进行了图3b中的统计分析。使用student’s t-检验进行了图1c中的统计分析。如果p<0.05，则推定为统计上显著。

[0212] 结果

[0213] 如通过图1说明的，以一系列剂量(0.3nM-10uM)，在OPC分化试验中测试了各种结构和特征的靶向H3R的实施例化合物。在EC50＝25nM下，用实施例化合物2(其是H3R反向激动剂)的处理以剂量依赖性的方式促进了OPC分化，如由图1a中所示的增加的MBP+群所证实的。相似地，用另一种H3R反向激动剂(实施例化合物3)的处理也以31nM的EC50显示出相似的促进作用。用同样是H3R反向激动剂但结构不同的实施例化合物6、7和8的处理分别以14nM、250nM、48nM的EC50显示出相似的对少突细胞分化的促进作用，如图1c中所示。相反，用中性拮抗剂实施例化合物4和5的处理在所有浓度下都没有显示出对OPC分化的任何作用(图1b)。

[0214] 结论

[0215] H3R的中性拮抗剂只能抑制受体的组胺依赖性的活性；而反向激动剂可以抑制组胺依赖性的活性和不依赖于组胺的固有活性。只有反向激动剂在OPC分化试验中显示出阳性效应，这些结果证明了H3R的固有活性在调控少突细胞分化中起着关键作用。

[0216] 结果

[0217] 选择实施例2的化合物用于蛋白质印迹的进一步分析，如图2所说明的。一致地，蛋白质印迹揭示了用实施例化合物2处理后，成熟少突细胞的两个标志物，髓鞘相关糖蛋白(MAG)和髓鞘碱性蛋白(MBP)，在分化的少突细胞中的表达水平显著提高，这表明了实施例化合物2的处理推动更多的OPC分化(图2)。

[0218] 实施例化合物1，另一种H3R反向激动剂，在OPC分化试验中展示了与其他反向激动剂相似的特性。实施例化合物1的处理以118±49nM的EC50促进了OPC分化(来自两个实验(n＝2)的数据显示于图3a中)，如通过更多的MBP+细胞和提高的MAG和MBP(成熟少突细胞的两个生物标志物)的表达水平所示的。将实验再运行三次，并且将来自五个实验的数据(n＝5)进行统计分析。将方差分析(ANOVA)用于比较10个剂量组(载体和9个活性剂量)之间的差异。ANOVA<0.0001的p-值表明统计上的显著差异。将来自五个实验的数据平均，并且表示为载体对照孔中的百分倍数变化。处理vs载体，*，p<0.05，**，p<0.01，***，p<0.001。如图3b中所示的，实施例化合物1以浓度依赖性的方式在体外促进了OPC分化，具有159±57nM的EC50值，如更多的MBP阳性细胞所显示的(在3uM下，高达对照的1.8±0.1倍)。

[0219] 结论

[0220] 蛋白质印迹的结果与定量免疫细胞化学分析的结果相一致。实施例化合物1和实施例化合物2均以剂量依赖性方式提高了成熟少突细胞标志物的表达水平。

[0221] 实施例10

[0222] H3R敲除实验

[0223] 将H3R特异性小干扰RNA(siRNA)用于敲除OPC中的H3R表达，并且在分化条件下研究所得到的表型。

[0224] 细胞分离

[0225] 由解剖2天大的大鼠幼仔前脑获得了富集的OPC。将幼仔麻醉并斩首。然后，用微解剖剪刀剪开头骨，并用Dumont镊子取出皮层。用精细的尖端取出脑膜。通过细胞滤器重复研磨皮层后，用培养基将细胞重悬浮，所述培养基由补充了20％胎牛血清(Invitrogen，Carlsbad，CA)、谷氨酰胺(4mM，Invitrogen)的DMEM组成，并将细胞接种于多-D-赖氨酸(PDL，100μg/ml，1h)-涂覆的T75烧瓶上。所得到的培养物每周两次供应新鲜的培养基，并且由于高浓度的血清，几乎所有神经元死亡。然后，使混合的胶质细胞接受一系列的摆脱过程以在两周后获得纯的OPC。具体地，混合的胶质细胞最初在100rpm下振荡1小时以除去小胶质细胞，并且在37℃、200rpm下振荡20-22小时以富集OPC。通过在1200rpm下离心5min来收集OPC，重悬浮于基础化学确定培养基(BDM)中。BDM由补充了N2培养基(100X)、谷氨酰胺(4mM)、BSA(0.1mg/ml)、氢化可的松(20nM)、硒(30nM)和生物素(10nM)的DMEM组成。将OPC接种于多鸟氨酸(PO，50μg/ml，1hr)-涂覆的培养皿上，并且在实验操作之前，维持在补充了bFGF(10ng/ml)和PDGF(10ng/ml)的BDM中。通过A2B5+染色判断OPC为95％纯。

[0226] OPC转染

[0227] 使用如下的方案，用siRNA转染OPC：用0.05％胰蛋白酶-EDTA消化OPC，并且在100g相对离心力下沉淀15min。将OPC重悬浮于DMEM中，并且再次沉淀以清洗掉所有胰
6
蛋白酶。将总共2-3×10等份的OPC重悬浮于100μl的含有100pmol的SMARTpool大鼠Hrh3(L-093904-01，Dharmacon)或100pmol的si-对照非靶向小干扰RNA(siRNA)库(D-001810-10，Dharmacon)的Amaxa OPC核转染试剂(VPG-1009；Amaxa，Lonza)中，然后用Amaxa核转染装置使用O-17程序电穿孔。将转染的OPC接种于PO-涂覆的6-孔板中，并且在补充了三碘甲腺原氨酸(30nM)和N-乙酰基-L-半胱氨酸(30μM)的BDM中培养4天。
收集细胞，并且用蛋白质印迹分析蛋白质样品。

[0228] 试剂

[0229] 用于免疫印迹实验的抗体是兔抗-髓鞘碱性蛋白(MBP，Millipore)、小鼠抗-髓鞘相关糖蛋白(MAG，abcam)和兔抗-H3R(Millipore)。所有siRNA smartpool购自Dharmacon，Thermo。

[0230] 蛋白质印迹

[0231] 处理后，用冰冷PBS将OPC洗涤两次，并且将总细胞裂解物收集于RIPA裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM原钒酸钠、50mM氟化钠、0.1％2-巯基乙醇、1％triton X-100和蛋白酶抑制剂混合物)中。将裂解物进行简短的声处理，并且在蛋白质分析之前储存在-80℃。进行BCA蛋白试验试剂(PIERCE，Thermo)以确定蛋白质浓度。等分每个样品15μg的总蛋白质，在与2X SDS缓冲液(125mM Tris-HCl、4％SDS、20％甘油、100mM DTT)混合后煮沸5min，并且通过Bis-Tris微型凝胶(Invitrogen)上的SDS-PAGE分离。然后将分离的蛋白质转移至硝基纤维素膜上，并在室温下在5％奶/TBS-0.1％吐温中封闭1h。然后在5％奶/TBS-0.1％吐温中稀释的第一抗体的存在下，将膜在4℃下温育过夜。第二天，用TBS-0.1％吐温将膜洗三次，5min，并且在5％奶/TBS-0.1％中在室温下温育1h。

[0232] 吐温含有1:5000稀释的山羊抗-兔或山羊抗-小鼠第二抗体(JacksonImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA)。使用FUJI成像装置(FUJI，Tokyo，日本)，通过增强的化学发光底物混合物(PIERCE)进行了HRP偶联的第二抗体的检测。

[0233] 定量实时RT-PCR

[0234] 根据制造商的说明，使用RNeasyMini试剂盒(Qiagen)分离了总RNA，并且使用Sensiscript RT试剂盒(Qiagen)合成第一链cDNA。使用SYBR Green Master混合物，在标准热循环仪(Applied Biosystems)条件下，通过实时PCR测定了mRNA表达。并在ABI Prism7900序列检测系统(Applied Biosystems)上收集数据并定量分析。PCR引物对的序列为：β-肌动蛋白(内部对照)：正向5’-GCGTCCACCCGCGAGTACAAC-3’，反向5’-CGACGACGAGCGCAGCGATA-3’；Hrh3：正向5’-TACTGTGTGCCTCCTCGGTCTT-3’和反向5’-AGCTCGAGTGACTGACAGGAATC-3’。

[0235] 统计分析

[0236] 所有数据以平均值±平均值标准误差(SEM)给出。合适时，使用单因素方差分析或student’s t检验进行了图4b中的统计分析。如果p<0.05，则推定为统计上显著。

[0237] 结果

[0238] 为了确认H3R参与少突细胞分化，使用特异性siRNA来敲除H3R表达。如图4a中所示，H3R的敲除(降至正常的～40％，RT-PCR)导致髓鞘碱性蛋白(MBP)和髓鞘相关糖蛋白(MAG)(成熟少突细胞的生物标志物)的表达水平提高。进行统计分析，并且如图4b中所示，用siRNA敲除H3R显著降低了内源性H3R的表达，导致两种成熟少突细胞生物标志物表达的统计上显著的提高：髓鞘碱性蛋白MBP(18kDa条带)，si-对照的1.7±0.1倍，p<0.01。与18kDa条带一起测量时，MBP的其他条带(21、17和14kDa)显示与si-对照相比，1.9±0.1倍的变化，p<0.01；以及髓鞘相关糖蛋白MAG，si-对照的1.8±0.2倍，(n＝5)，**，p<0.01，siHrh3vs.si-对照。

[0239] 这些发现表明H3R，作为具有固有活性的几个GPCR之一，负面地调节少突细胞分化，这与图1至3所示结果是一致的。

[0240] 结论

[0241] 通过siRNA降低H3R表达水平促进了OPC分化，如MBP和MAG提高的表达所证明的。结果证明了H3R的固有活性在少突细胞分化中的负面作用。

[0242] 临床前实验

[0243] 根据Institutional Animal Care and Use Committee of GSK R&D China批准的方案并按照关于实验室动物的护理和使用以及相关的操作规程的GlaxoSmithKline公司政策，依照获得的项目许可进行所有的体内研究。

[0244] 实施例11

[0245] 使用小鼠双环己酮草酰二腙-诱导的脱髓鞘模型测定了实施例1的化合物体内增强髓鞘再生的能力。

[0246] 双环己酮草酰二腙处理

[0247] 使用如下方案实施了双环己酮草酰二腙模型：给8周大的C57BL/6小鼠饲喂新混合0.2％双环己酮草酰二腙(w/w)的粉末小鼠食物，持续5周，以诱导脱髓鞘，然后使动物恢复(从膳食中除去双环己酮草酰二腙)并且以0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg体重口服施用实施例化合物1，每日两次，在牺牲之前持续另外9天。收集大脑样品用于评价髓鞘形成。使用1％甲基纤维素水溶液作为载体，将实施例1的化合物配制成悬浮液。

[0248] 髓鞘染色和定量

[0249] 将小鼠深度麻醉，并且经由左心室快速灌注0.9％盐水以排出血液。将整个大脑取出并放入含有4％多聚甲醛(PFA)的15ml试管中用于后固定过夜，然后在30％蔗糖中浸泡24-48h以脱水。为了冷冻包埋，将大脑在混有干冰的异戊烷中立即快速冷冻，然后包埋在最佳切割温度溶液(OCT)中。使用低温恒温器(MICROM HM525)，以30μm的厚度，根据Paxinos and Franklin(The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates_第3版)所描述的小鼠图集，从前囟-2.46mm至1.18mm，在头颅位置对整个大脑进行切片。将所有切片放入装满了抗冻液[溶解于500ml0.1M PB溶液(结合11.505g Na2HPO4和2.275g NaH2PO4，用蒸馏水稀释至1L，调节pH至7.4)中的300g蔗糖加上300ml乙二醇，并用蒸馏水稀释至1L]的96-孔板中。对于黑-金II染色，根据Paxinos and Franklin所描述的小鼠图集，分别选择每只小鼠的前囱0.86mm周围的前脑的2个切片和前囱-1.58mm周围的后脑的2个切片。根据制造商(AG105，Millipore)调整的方案进行了用于检测髓鞘形成的黑-金II染色。简而言之，将来自前脑的2个自由漂浮切片和来自后脑的2个切片在MilliQ水中再水化2X，每次2分钟，然后在24-孔板中，在60℃下，用0.3％黑-金II溶液染色20分钟。监控切片以确定染色的程度。当最细的有髓鞘纤维从深红色染成黑色时，停止染色过程。然后将切片在MilliQ水中冲洗2X，每次2分钟。然后，在60℃下，用硫代硫酸钠溶液(1％)处理切片6分钟。在PBST(0.05％Triton X100的PBS溶液)中冲洗后，将切片固定在载玻片(Leica Microsystems Plus Slides)上，并且在37℃加热台上进一步空气干燥2-4小时。用自动式玻片盖片机(CV5030，Leica)给脱水的载玻片盖上盖玻片。通过Scanscope(Aperio Technologies Inc.)扫描染色的载玻片。在20x的放大倍数下，用ImageScope(Aperio Technologies Inc.)捕获了接近扣带的中央胼胝体或皮层的数字图像。

[0250] 将Image-Pro6.3软件(Media Cybernetics，Bethesda，MD20814USA)用于随后的定量评价。对每个门控的胼胝体中的黑-金II染色设定阈值，并且对于在处理的载玻片上以相同物镜和光强度下获得的图像保持恒定。在此使用了两个参数：面积和IOD(积分光密度)。对于脱髓鞘面积的测量，在转化成8的灰度值后，所有数字图像设定在相同的颜色范围下。通过没有黑-金染色来表示脱髓鞘，并且对每个图像单独测量了在20x放大倍数下的中央胼胝体的总面积。平均脱髓鞘面积计算为：(脱髓鞘面积/中央胼胝体的总面积)x100。对于平均强度的测量，所有数字图像设定在相同颜色范围下后，计算了中央胼胝体或皮层中的面积和IOD。平均强度计算为：IOD/中央胼胝体或门控的皮层的总面积。将结果表示为天然对照的平均强度的百分比。分别将每只动物来自前脑的两个切片的数据、来自后脑的两个切片的数据和来自前脑和后脑两者的四个切片的数据取平均并且分析。组数据表示为平均值±SEM。通过GraphPad5PRISM软件(GraphPad Software，Inco，San Diego，Calif.USA)生成了曲线图。

[0251] 统计分析

[0252] 通过GraphPad5PRISM软件(GraphPad Software，Inco，San Diego，Calif.USA)生成了曲线图。将通过R软件的T-检验用于组之间的差异的分析。认为P值<0.05是统计上显著的。通过星号*p<0.05，**p<0.01在图中表示显著性。

[0253] 结果

[0254] 实施例化合物1对双环己酮草酰二腙模型中的髓鞘再生的作用

[0255] 用双环己酮草酰二腙膳食处理5周，接着9天的正常膳食，导致胼胝体中严重的脱髓鞘，通过如与天然组相比时，在载体对照组中的黑-金II染色损失所观察到的(图5a和5b)。

[0256] 通过两个不同的定量参数(通过黑-金II染色表明的脱髓鞘面积和平均染色强度)来确定体内髓鞘再生。如图5a-5d中所示，用实施例化合物1处理(10mg/kg，9天)，与载体对照组相比，显著提高了病变中的髓鞘-特异性黑-金II染色的强度，并且降低了前脑和后脑二者中胼胝体的脱髓鞘面积；实施例化合物1的作用随着递增的剂量而提高(除了3mg/kg)。

[0257] 实施例12

[0258] 使用小鼠双环己酮草酰二腙/雷帕霉素诱导的脱髓鞘模型，测定了实施例化合物2增强体内髓鞘再生的能力。

[0259] 双环己酮草酰二腙加雷帕霉素处理

[0260] 按照以下的方案实施了双环己酮草酰二腙加雷帕霉素模型：将雷帕霉素溶解于100％乙醇中，并且存储在-20℃直至使用。就在注射前，将雷帕霉素稀释于载体溶液中以在5％PEG-400、5％吐温80和4％乙醇中获得最终浓度。给8周大的C57BL/6小鼠饲喂新混合了0.2％双环己酮草酰二腙(w/w)的粉末小鼠食物，并且每日接受腹膜内注射雷帕霉素(10mg/kg体重)，持续5周，以诱导脱髓鞘，然后使动物恢复(除去膳食中的双环己酮草酰二腙和雷帕霉素注射)并且用实施例化合物2给药，口服30mg/kg体重，每日两次，在处死之前持续另外9天。收集大脑样品用于病理学分析。使用1％甲基纤维素水溶液作为载体将实施例化合物2配制成悬浮液。

[0261] 髓鞘染色和定量

[0262] 将小鼠深度麻醉，并且经由左心室快速灌注0.9％盐水以排出血液。将整个大脑取出并放入含有4％多聚甲醛(PFA)的15ml试管中用于后固定过夜，然后在30％蔗糖中浸泡24-48h以脱水。为了冷冻包埋，将大脑在混有干冰的异戊烷中立即快速冷冻，然后包埋在最佳切割温度溶液(OCT)中。使用低温恒温器(MICROM HM525)，以30μm的厚度，根据Paxinos and Franklin(The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates_第3版)所述的小鼠图集，从前囟-2.46mm至1.18mm，在头颅位置对整个大脑进行切片。将所有切片放入装满了抗冻液[溶解于500ml0.1M PB溶液(结合11.505g Na2HPO4和2.275g NaH2PO4，用蒸馏水稀释至1L，调节pH至7.4)中的300g蔗糖加上300ml乙二醇，并用蒸馏水稀释至1L]的96-孔板中。对于黑-金II染色，根据Paxinos and Franklin所述的小鼠图集，分别选择每只小鼠的前囱0.86mm周围的前脑的4个切片(2个来自胼胝体，2个来自皮层)。根据制造商(AG105，Millipore)调整的实验方案，进行了用于检测髓鞘形成的黑-金II染色。简而言之，将来自前脑的4个自由漂浮切片(2个用于胼胝体，2个用于皮层)在MilliQ水中再水化2X，每次2分钟，然后在24-孔板中，在60℃下，用0.3％黑-金II溶液染色20分钟。监控切片以确定染色的程度。当最细的有髓鞘的纤维从深红色染成黑色时，停止染色过程。然后将切片在MilliQ水中冲洗2X，每次2分钟。然后，在60℃下，用硫代硫酸钠溶液(1％)处理切片6分钟。在PBST(0.05％Triton X100的PBS溶液)中冲洗后，将切片固定在载玻片(Leica Microsystems Plus Slides)上，并且在37℃加热台上进一步空气干燥2-4小时。用自动式玻片盖片机(CV5030，Leica)给脱水的载玻片盖上盖玻片。通过Scanscope(Aperio Technologies Inc.)扫描染色的载玻片。在20x的放大倍数下，用ImageScope(Aperio Technologies Inc.)获取接近扣带的中央胼胝体或皮层的数字图像。

[0263] Image-Pro6.3软件(Media Cybernetics，USA)用于随后的定量评价。对每个门控的胼胝体中的黑-金II染色设定阈值，并且对于在处理的载玻片上以相同物镜和光强度获得的图像保持恒定。在此使用了两个参数：面积和IOD(积分光密度)。对于平均强度的测量，所有数字图像设定在相同颜色范围下后，计算了中央胼胝体或皮层中的面积和IOD。平均强度计算为：IOD/中央胼胝体或门控的皮层的总面积。将结果表示为天然对照的平均强度的百分比。分别将每只动物来自前脑胼胝体的两个切片的数据、来自前脑皮层的两个切片的数据取平均并且分析。组数据表示为平均值±SEM。通过GraphPad5PRISM软件(GraphPad Software，Inco，USA)生成了曲线图。

[0264] 统计分析

[0265] 通过GraphPad5PRISM软件(GraphPad Software，Inc.，USA)生成了曲线图。将通过GraghPad的未配对t检验用于组之间的差异的分析。认为P值<0.05是统计上显著的。通过星号*p<0.05，**p<0.01在图中表示显著性。

[0266] 实施例化合物2对双环己酮草酰二腙加雷帕霉素模型中的髓鞘再生的作用[0267] 在另一批双环己酮草酰二腙加雷帕霉素模型中，用双环己酮草酰二腙膳食结合腹膜内注射雷帕霉素处理小鼠5周，接着9天的化合物给药。双环己酮草酰二腙膳食加腹膜内注射雷帕霉素诱导了胼胝体和皮层二者中严重的脱髓鞘，且与载体对照组相比，实施例化合物2的处理(30mg/kg，9天)显著提高了前脑中胼胝体和皮层病变中的髓鞘特异性的黑-金II染色的强度(图5e和5f)。

[0268] 结果(图5)

[0269] 图5a的代表性图显示了实施例化合物1的处理，双环己酮草酰二腙模型(5周的双环己酮草酰二腙膳食+9天的化合物处理)中前脑胼胝体中降低的脱髓鞘面积和提高的黑-金II染色的平均强度。

[0270] 图5b的代表性图显示了实施例化合物1的处理，双环己酮草酰二腙模型(5周的双环己酮草酰二腙膳食+9天的化合物处理)中后脑胼胝体中降低的脱髓鞘面积和提高的黑-金II染色的平均强度。

[0271] 图5c显示了实施例化合物1对髓鞘再生的治疗作用的统计分析，如由脱髓鞘面积的降低所证实的。分析了每只动物的前脑和后脑的四个切片。每个组的数据表示为平均值±SEM。**p<0.01，相对于载体对照组。

[0272] 图5d显示了实施例化合物1对髓鞘再生的治疗作用的统计学分析，如由胼胝体中提高的黑-金II染色平均强度所表明的。分析了每只动物的前脑和后脑的四个切片。每个组的数据表示为平均值±SEM。**p<0.05，相对于载体对照组。

[0273] 图5e显示了用实施例化合物2的处理，促进双环己酮草酰二腙加雷帕霉素模型(5周的双环己酮草酰二腙膳食和雷帕霉素注射+9天的化合物处理)中前脑胼胝体中的髓鞘再生。代表性图象(上图)和定量分析(下图)表明，与载体对照组相比，在恢复期中用实施例化合物2处理9天显著提高了前脑胼胝体中的黑-金II染色的平均强度。将每只动物的前脑胼胝体的两个切片取平均并进行了分析。每个组的数据表示为平均值±SEM。**p<0.05，相对于载体对照组。

[0274] 图5f显示了实施例化合物2的处理，促进双环己酮草酰二腙加雷帕霉素模型(5周的双环己酮草酰二腙膳食和雷帕霉素注射+9天的化合物处理)中前脑皮层中的髓鞘再生。代表性图象(上图)和定量分析(下图)表明，与载体对照组相比，在恢复期中用实施例化合物2处理9天显著提高了前脑皮层中的黑-金II染色的平均强度。将每只动物的前脑皮层的两个切片取平均并进行了分析。每个组的数据表示为平均值±SEM。**p<0.05，相对于载体对照组。

[0275] 如图5a中所示，实施例化合物1的处理，与载体对照相比，在双环己酮草酰二腙模型(5周的双环己酮草酰二腙膳食加9天的化合物处理)中的前脑胼胝体中，降低脱髓鞘面积(没有黑-金染色)和提高黑-金II染色的平均强度(如通过A和C中的代表性图象所示的)。B和D是显示如何进行分析的实例。B是通过Image-Pro6.3软件(Media Cybernetics，USA)转化的从A衍生的图像，B中的红色区域测定为脱髓鞘面积。D是通过Image-Pro转化的从A衍生的图像，D中的红色强度测定为髓鞘强度。

[0276] 如图5b中所示，实例化合物1的处理，与载体对照相比，在双环己酮草酰二腙模型(5周的双环己酮草酰二腙膳食加9天的化合物处理)中的后脑胼胝体中，降低脱髓鞘面积(没有黑-金染色)和提高黑-金II染色的平均强度(如通过A和C中的代表性图象所示的)。B和D是显示如何进行分析的实例。B是通过Image-Pro6.3软件(Media Cybernetics，USA)转化的A衍生的图像，B中的红色区域测定为脱髓鞘面积。D是通过Image-Pro转化的A衍生的图像，D中的红色强度测定为髓鞘强度。

[0277] 如图5c中所示，定量分析显示出，实施例化合物1的处理，在10mg/kg下显著降低脱髓鞘面积(载体组：54.81％±7.27％；0.3mg/kg组：46.82％±3.54％；1mg/kg组：38.45％±7.55％；3mg/kg组：41.22％±11.14％；10mg/kg组：27.62％±5.20％；分析了来自每只动物4个切片的数据；2个前脑切片，2个后脑切片)。

[0278] 如图5d中所示，定量分析显示，实施例化合物1的处理，在10mg/kg下，显著提高了前脑和后脑二者中胼胝体的髓鞘染色强度(载体组：15.75％±2.08％；0.3mg/kg组：18.61％±1.01％；1mg/kg组：22.00％±3.41％；3mg/kg组：28.32％±7.76％；10mg/kg组：
26.36％±3.10％；分析了来自每只动物4个切片的数据；2个前脑切片，2个后脑切片)。

[0279] 如图5e中所示，实施例化合物2的处理，在30mg/kg下，促进了双环己酮草酰二腙加雷帕霉素模型(5周的双环己酮草酰二腙膳食和雷帕霉素注射+9天的化合物处理)中的前脑胼胝体中的髓鞘再生。代表性图象(上图)和定量分析(下图)表明，与载体对照组相比，在恢复期中用实施例化合物2处理9天显著提高了前脑胼胝体中的黑-金II染色的平均强度(平均强度：载体：14.65％±1.96％；cpd：27.68％±5.44％。载体，n＝9，实施例化合物2，n＝7，分析了来自每只动物2个切片的数据)。

[0280] 如图5f中所示，实施例化合物2的处理，在30mg/kg下，促进了双环己酮草酰二腙加雷帕霉素模型(5周的双环己酮草酰二腙膳食和雷帕霉素注射+9天的化合物处理)中的前脑皮层中的髓鞘再生。代表性图象(上图)和定量分析(下图)表明，与载体对照组相比，在恢复期中用实施例化合物2处理9天显著提高了前脑皮层中的黑-金II染色的平均强度(平均强度：载体：40.79％±3.60％；cpd：60.05％±6.28％。载体，n＝9，实施例化合物2，n＝7，分析了来自每只动物2个切片的数据)。

[0281] 结论

[0282] 这些结果表明，本发明实施例化合物1和实施例化合物2的处理可以增强内源性的髓鞘再生，其与体外发现非常一致。因此，本文中呈现的体内和体外数据强烈地支持H3R的反向激动剂作为多发性硬化的新疗法，其通过提高的OPC分化促进CNS髓鞘修复。

[0283] 实施例13

[0284] 使用OPC的组胺H3R功能性反向激动剂试验(cAMP试验)

[0285] 在细胞表面上表达的组胺受体3(H3R)与刺激环化AMP(cAMP)形成的腺苷酸环化酶负偶联。在组胺不存在的情况下，固有活性的H3R将抑制cAMP的胞内水平。阻断H3R的固有活性的H3R反向激动剂因此将升高cAMP水平。在细胞cAMP试验中测定了实施例化合物2抑制H3R的固有活性的能力。

[0286] 对于受试的每种化合物，将OPC以20000细胞/孔的密度接种于PO涂覆的96-孔板中，并且在具有bFGF(10ng/ml Petrotech)和PDGF(10ng/ml Petrotech)的BDM中培养24小时。首先用不同浓度的实施例化合物(30nM至3M)将细胞处理30分钟。然后，在实施例化合物存在的情况下，用毛喉素(3M，Sigma)刺激细胞15分钟。通过cAMP化学发光免疫分析试剂盒(Invitrogen，Cat.No.C10557)测量了cAMP浓度。用裂解缓冲液(60μL，Invitrogen试剂盒试剂)将细胞在37℃下裂解30分钟。将裂解物转移至预先涂覆的微板(Invitrogen试剂盒试剂)中，并且与cAMP-AP(30μL，Invitrogen试剂盒试剂)和cAMP抗体(60μL，Invitrogen试剂盒试剂)混合。1小时温育后，用洗涤缓冲液(Invitrogen试剂TM
盒试剂)将孔洗涤5次。将 底物/Sapphire-II 增强剂溶液(100μL，Invitrogen试剂盒试剂)加入每个孔中并温育30分钟。在SpectraMax M5Multi-Mode微板阅读器(Molecular Devices)中测量化学发光信号，每个孔1秒钟。

[0287] 结果

[0288] 如图6a和6b中所示，实施例化合物2以剂量依赖性方式提高了原代少突细胞前体细胞中毛喉素刺激的cAMP水平。

[0289] 结论

[0290] 实施例化合物2以剂量依赖性方式提高了少突细胞前体细胞(在H3R激动剂不存在的情况下)中的毛喉素刺激的胞内cAMP水平。结果表明实施例化合物2是H3R的反向激动剂。

[0291] 实施例14

[0292] 在GTPγS结合试验中测定了实施例化合物1对H3R受体的基础GTPγS结合的作用。

[0293] 细胞维持和Bacmam病毒感染

[0294] 将稳定表达G蛋白GαO的人胚胎肾293细胞(HEK-293-GO)在潮湿的环境中，在37-8℃，5％CO2下，维持于补充了Earle’s盐、2mM L-谷氨酰胺、400mg/ml遗传毒素和10％胎牛血清的最低限度必需培养基(MEM)中。如下，用编码人重组H3受体的BacMam病毒(Biocat：病毒96801)感染指数生长的细胞。在PBS中将细胞从烧瓶脱离，并通过在室温下在200X g下离心5min来收集。然后将细胞重悬浮于含有感染复数(m.o.i.)为100的病毒的生长培养基中，重新接种，然后在正常生长条件下温育24h。

[0295] GTPγS结合试验

[0296] 使用如上描述的以人H3R-编码BacMam病毒转导的HEK293-GαO细胞进行GTPγS结合试验。温育过夜后，将细胞收集至10ml PBS中，并且在200X下旋转5min。除去上清液后，将沉淀重悬浮并且在含有3mM MgCl2和100mM NaCl的20mM HEPES(pH7.4)中均质化，在50,000X g下离心20min，然后再次均质化并离心。然后将膜沉淀重悬浮，并且测定蛋白质浓度。

[0297] 将细胞膜在分析缓冲液(20mM HEPES、100mM NaCl、10nM MgCl2，pH7.4)中稀释至～1mg/ml，并且用麦胚凝集素闪烁邻近试验(SPA)珠(Amersham Biosicences)温育45min，之后加入GDP(40mM)。将各种浓度的实施例化合物1(以半对数增量，100nM-0.001nM)和10ml试验缓冲液一起加入96-孔板中。通过包含0.6mM GTPγS测定了非特异性结合。然后将六十微升(～55mg蛋白/孔)的膜/SPA珠/GDP混合物加入每个孔中，并将板在室温下在定轨摇床上温育30min。然后将[35S]-GTPγS(0.3mM)加入每个孔中，将板在摇床上再温育
30min，并且通过在真空下经由Whatman GF/B滤器的快速过滤来停止温育。用4ml冰冷的水将滤器洗涤两次，并且在Wallac1450Microbeta Trilux计数器上通过闪烁计数来测量滤器上结合的[35S]-GTPγS。

[0298] 数据获取和分析

[0299] 分析了数据并以载体对照孔数量(DMSO)的倍数变化示出。通过软件Microsoft Excel和GraphPad Prism5.0生成了曲线图。使用软件GraphPad进行了曲线拟合，以导出实施例化合物1的pEC50值。通过软件中嵌入的逻辑模型进行了曲线拟合(S形剂量-反应：Y＝底部+(顶部-底部)/(1+10^((LogEC50-X))))。

[0300] 统计分析

[0301] 所有数据作为平均值±平均值标准偏差(SEM)给出。合适时，使用单因素方差分析或student’s t检验进行了统计分析。如果p<0.05，则推定为统计上显著。

[0302] 结果

[0303] 实施例化合物1在HEK-293-GO细胞中表达的人H3R处呈现出反向激动剂特性。实施例化合物1(100nM-0.001nM)以剂量依赖性方式抑制基础GTPγS结合(在H3R激动剂不存在的情况下)，pEC50＝9.95±0.07，来自3个独立的实验(图7)。将单因素方差分析(ANOVA)用于比较11个剂量组(载体和10个活性剂量)之间的差异。ANOVA的p-值
9.375e-10<0.0001表明统计上的显著差异。将α-甲基组胺(H3R激动剂)用作对照来验证该试验。将来自GTPγS试验的3个独立批次的数据取平均并且表示为载体对照孔中的百分倍数变化。实施例1对载体，*，p<0.05，**，p<0.01，***，p<0.001，α-甲基组胺vs载体，#，p<0.05。

[0304] 结论

[0305] 实施例化合物1以剂量依赖性方式抑制在HEK293细胞的膜上表达的H3R(在H3R激动剂不存在的情况下)的基础GTPγS结合。结果表明实施例化合物1是H3R的反向激动剂。