牛樟芝培养方法及牛樟芝酒萃物的制备方法

摘要

一种提升樟芝酸C及樟菇酸C含量的牛樟芝培养方法，包含：提供一牛樟树椴木；提供一牛樟芝菌体，将该牛樟芝菌体接种于该牛樟芝椴木，使每公斤的该牛樟芝椴木含有干重为0.162克的菌丝及菌丝球；及再以波长为600至700nm的一光源照射该接种有牛樟芝菌体的牛樟树椴木，以获得一牛樟芝子实体；其中，该接种有牛樟芝菌体的牛樟树椴木以该光源每天照射8至12小时，且连续照射30至40天。此种牛樟芝培养方法，可以产生大量樟芝酸C及樟菇酸C，以提升牛樟芝的营养价值。又可以缩短牛樟芝的培养时间，降低栽培成本，进而利于进行牛樟芝的大量生产。

权利要求

1.一种提升樟芝酸C及樟菇酸C含量的牛樟芝培养方法，其特征在于，包含：提供牛樟树椴木；

提供牛樟芝菌体，将该牛樟芝菌体接种于该牛樟芝椴木，使每公斤的该牛樟芝椴木含有干重为0.162克的菌丝及菌丝球；及再以波长为660nm的光源，每天照射该接种有牛樟芝菌体的牛樟树椴木8小时，连续照射30天，以获得牛樟芝子实体。

2.如权利要求1所述的牛樟芝培养方法，其特征在于，该牛樟芝菌体呈液态，且每公升的该牛樟芝菌体含有8.1克干重的菌丝和菌丝球。

3.如权利要求1所述的牛樟芝培养方法，其特征在于，该光源来自发光二极管。

4.一种具有高含量樟芝酸C及樟菇酸C的牛樟芝酒萃物的制备方法，其特征在于，包含：提供如权利要求1所述的牛樟芝子实体；及

于25℃下，利用95%乙醇以超声波震荡萃取该牛樟芝子实体，以获得一个牛樟芝酒萃物。

说明书

牛樟芝培养方法及牛樟芝酒萃物的制备方法

技术领域

[0001] 本发明是关于一种牛樟芝培养方法，特别是一种能够提升牛樟芝的樟芝酸C及樟菇酸C含量的牛樟芝培养方法，本发明更关于一种牛樟芝萃取方法，可以获得含有较高含量的樟芝酸C及樟菇酸C含量的牛樟芝酒萃物，以及该牛樟芝酒萃物用以抑制肿瘤细胞生长的用途。

背景技术

[0002] 牛樟芝(Antrodia cinnamomea)为台湾特有珍贵药材，仅生长于台湾保育类的牛樟树(Cinnamomum kanehirai)的中空芯材内壁，野生牛樟芝含有丰富的三萜类(Triterpenoids)，三萜类具有抑制肿瘤细胞生长、修复肝脏及促进肝功能、降低血脂及血压、提升免疫能力等功能，而使野生牛樟芝价格水涨船高。

[0003] 然而，由于野生牛樟芝量少且不易取得，因此业界是以人工培育牛樟芝的方式，获得牛樟芝菌丝体或子实体，以进一步萃取该牛樟芝菌丝体或子实体内的生理活性物质(如三萜类化合物)。

[0004] 现有牛樟芝培养方法包含有：液态发酵法、固态培养法及椴木栽培法，其中，现有液态发酵法生长速度较快，但是由于发酵菌丝体的生化及生理代谢途径与野生牛樟芝不同，生成的营养成分与野生牛樟芝也相去甚远；现有固态培养法虽然可以生成与野生牛樟芝较为相似的子实体，但以现有固态培养法生成的子实体的营养成分仍然与野生牛樟芝子实体有些许不同。

[0005] 现有椴木栽培法是利用枯死的牛樟树椴木，将牛樟芝菌体接种于该牛樟树椴木中，使该牛樟芝菌体可以于该牛樟树椴木中生长，借此采取子实体，其优点在于可以生成与野生牛樟芝子实体相同的成分。然而，现有椴木栽培法须经过长达2至3年的培养时间，且培养过程必须维持适当的环境温度，因此，现有椴木栽培法具有栽培成本高、栽培时间长等问题，因而不利进行量产。

发明内容

[0006] 本发明的主要目的是提供一种牛樟芝培养方法，可以产生大量樟芝酸C及樟菇酸C，以提升牛樟芝的营养价值。

[0007] 本发明的再一目的是提供一种牛樟芝培养方法，可以缩短牛樟芝的培养时间，降低栽培成本，进而利于进行牛樟芝的大量生产。

[0008] 本发明的又一目的是提供一种牛樟芝酒萃物的制备方法，该牛樟芝酒萃物具有高含量的樟芝酸C及樟菇酸C，可以降低肿瘤细胞的存活率。

[0009] 本发明的再一目的是提供一种牛樟芝酒萃物的用途，以该牛樟芝酒萃物作为一有效成分，用以抑制肿瘤细胞的生长。

[0010] 为达到前述发明目的，本发明所运用的技术手段及借助该技术手段所能达到的功效包含有：

[0011] 一种提升樟芝酸C及樟菇酸C含量的牛樟芝培养方法，包含：提供一牛樟树椴木；提供一牛樟芝菌体，将该牛樟芝菌体接种于该牛樟芝椴木，使每公斤的该牛樟芝椴木含有干重为0.162克的菌丝及菌丝球；然后以波长为600至700nm的一光源照射该接种有牛樟芝菌体的牛樟树椴木，以获得一牛樟芝子实体；其中，该接种有牛樟芝菌体的牛樟树椴木是以该波长为600至700nm的光源每天照射8至12小时，且连续照射30至40天。

[0012] 本发明的牛樟芝培养方法，其中，该牛樟芝菌体呈液态，且每公升的该牛樟芝菌体含有8.1克干重的菌丝和菌丝球。

[0013] 本发明的牛樟芝培养方法，其中，该光源的波长较佳选择为660nm。

[0014] 本发明的牛樟芝培养方法，其中，该光源较佳可以来自发光二极管。

[0015] 本发明的牛樟芝培养方法，其中，以该光源每天照射该接种有牛樟芝菌体的牛樟树椴木的时间较佳选择为8小时。

[0016] 本发明的牛樟芝培养方法，其中，较佳以该光源选择连续照射该接种有牛樟芝菌体的牛樟树椴木30天。

[0017] 本发明还提供一种具有高含量樟芝酸C及樟菇酸C的牛樟芝酒萃物的制备方法，包含：提供如前述的牛樟芝子实体；及于25℃下，利用95％乙醇以超声波震荡萃取该牛樟芝子实体，以获得一牛樟芝酒萃物。

[0018] 本发明还提供一种牛樟芝酒萃物用于抑制肝肿瘤细胞生长的用途，是将如前述的牛樟芝酒萃物作为一活性成分，应用于制备用以治疗肝肿瘤的药物组成分。

[0019] 本发明还提供一种牛樟芝酒萃物用于抑制肺肿瘤细胞生长的用途，是将如前述的牛樟芝酒萃物作为一活性成分，应用于制备用以治疗肺肿瘤的药物组成分。

[0020] 本发明还提供一种牛樟芝酒萃物用于抑制大肠肿瘤细胞生长的用途，是将如前述的牛樟芝酒萃物作为一活性成分，应用于制备用以治疗大肠肿瘤的药物组成分。

[0021] 本发明还提供一种牛樟芝酒萃物用于抑制肉瘤细胞生长的用途，是将如前述的牛樟芝酒萃物作为一活性成分，应用于制备用以治疗肉瘤的药物组成分。

[0022] 本发明还提供一种牛樟芝酒萃物用于抑制乳房肿瘤细胞生长的用途，是将如前述的牛樟芝酒萃物作为一活性成分，应用于制备用以治疗乳房肿瘤的药物组成分。

[0023] 本发明的牛樟芝培养方法，可以使培养出的牛樟芝含有大量樟芝酸C及樟菇酸C，进而达到提升牛樟芝的营养价值的功效。

[0024] 本发明的牛樟芝培养方法，可以缩短牛樟芝的培养时间，进而达到提升牛樟芝的经济价值的功效。

[0025] 经本发明的牛樟芝酒萃物的制备方法所制备的牛樟芝酒萃物，具有高含量的樟芝酸C及樟菇酸C，可以降低肿瘤细胞的存活率，可以作为抑制肿瘤细胞生长的有效成分，为本发明的功效。

[0026] 本发明的牛樟芝酒萃物可以作为一活性成分，可以有效抑制肝肿瘤细胞、肺肿瘤细胞、大肠肿瘤细胞、肉瘤细胞、乳房肿瘤细胞等肿瘤细胞的生长，具有使肿瘤细胞发生毒杀作用而无法增生或扩散的功效。

附图说明

[0027] 图1为樟芝酸C的化学结构图。

[0028] 图2为樟菇酸C的化学结构图。

具体实施方式

[0029] 为让本发明的上述及其他目的、特征及优点能更明显易懂，下文特举本发明的较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下：

[0030] 本发明的提升樟芝酸C及樟菇酸C含量的牛樟芝培养方法，包含以下步骤：提供一牛樟树椴木；提供一牛樟芝菌体，将该牛樟芝菌体接种于该牛樟芝椴木，使每公斤的该牛樟芝椴木含有干重为0.162克的菌丝及菌丝球；及然后以波长为600至700nm的一光源照射该接种有牛樟芝菌体的牛樟树椴木，以获得一牛樟芝子实体。

[0031] 上述提供一牛樟树椴木的步骤，包括将该牛樟树椴木可以隔水培养于一培养箱中，维持该培养箱的温度为28～30℃，且湿度为80％以上；较佳地，为避免其他微生物的竞争，可以将该牛樟树椴木及该培养箱进行灭菌后，再进行后续步骤。

[0032] 上述提供一牛樟芝菌体的步骤，是将该牛樟芝菌体接种于该牛樟树椴木。举例而言，本发明所使用的牛樟芝菌体可以选择为购自中国台湾食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心的牛樟菌菌株，如该牛樟菌菌株编号为BCRC 35396，但并不以此为限；本较佳实施例中，可以于接种时，选择使用液态的该牛樟芝菌体，并且将1公升的该牛樟芝菌体(每公升约含有8.1克干重的菌丝和菌丝球)接种于50公斤的该牛樟树椴木，使该牛樟芝菌体能够自该牛樟树椴木中获得足够的生长空间及养分；此外，本实施例的接种方式可以选择将该牛樟芝菌体以喷洒方式均匀地洒在该牛樟树椴木表面。

[0033] 完成上述步骤后，再以波长为600至700nm的一光源照射该接种有牛樟芝菌体的牛樟树椴木，较佳地，该光源选择为红光，且该光源的波长为660nm，该光源较佳可以选择来自于发光二极管，其具有高光电转换效率、波长固定及低发热等多项优点，并且容易调整其光量、光质(红/蓝光比例)，因而适用于封闭式生长环境；于本较佳实施例中，可选择以波长为660nm的光源，每天照射接种有该牛樟芝菌体的该牛樟树椴木8至12小时，且连续照射30至
40天，使接种的该牛樟芝菌体可以于该牛樟树椴木成长为一牛樟芝子实体；据此，可以提高该牛樟芝子实体所含樟芝酸C及樟菇酸C的含量。

[0034] 此外，本发明也提供一种牛樟芝酒萃物的制备方法，可以提升该牛樟芝酒萃物的樟芝酸C及樟菇酸C的含量，包含：提供如上述的牛樟芝子实体；及于25℃下，利用95％乙醇以超声波震荡萃取该牛樟芝子实体。

[0035] 详而言之，于本较佳实施例中，取5克牛樟芝子实体，置于600毫升的95％乙醇，于25℃环境下，以频率为40KHz的超声波进行震荡萃取，使该牛樟芝子实体中的有效成份(如三萜类)可以溶出至乙醇；较佳地，该萃取时间为8小时，并重复萃取3次，可以提高总萃取量，以获得该牛樟芝酒萃物；另外也可以再通过冷冻干燥以获得一浓缩的牛樟芝酒萃物。

[0036] 为证实本发明的牛樟芝培养方法，确实可以提升樟芝酸C及樟菇酸C的含量，并可以提升牛樟芝对于肿瘤的抑制效果，遂进行以下试验：

[0037] (A)三萜类含量检测

[0038] 本试验可以取如第1表所示的牛樟芝酒萃物，第A1组经本较佳实施例的牛樟芝培养方法所获得的牛樟芝酒萃物，第A2组则为于牛樟芝培养过程中，未以波长为600至700nm的光源照射获得的牛樟芝酒萃物。分别秤取0.2克的该等牛樟芝酒萃物至一螺旋试管中，加入5毫升甲醇，以超声波震荡15分钟，再以3000转离心10分钟后，取5毫升上清液，置入一干净试管，再以100℃水浴加热至干燥。

[0039] 第1表、本试验各组别所选用的牛樟芝酒萃物

[0040]组别 光源照射 分析结果
A1 + 第2表
A2 － 第3表

[0041] 接着选用Purospher STAR(Merck)RP-18e(5μm)250mm×4mm管柱进行分析，以47：53的体积比混合乙腈(Acetonitrile，简称ACN)及0.085％的磷酸溶液作为流动相，流速为
1ml/min，检测波长为254nm的吸光值以进行后续分析。

[0042] 第2表、第A1组的牛樟芝酒萃物中三萜类成分定量表

[0043]

[0044]

[0045] 第3表、第A2组的牛樟芝酒萃物中三萜类成分定量表

[0046]

[0047] 请参照第2及3表所示，相较于第A2组，第A1组的牛樟芝酒萃物具有较高含量的樟芝酸C及樟菇酸C，显示本发明的牛樟芝培养方法的确可以提升牛樟芝子实体中樟芝酸C及樟菇酸C的含量。

[0048] (B)对肿瘤细胞株存活率的影响

[0049] 本试验选用如第4表所示的肿瘤细胞株，该肿瘤细胞株包含购自食品工业发展研究所的肝肿瘤(HepG2细胞，第B1-1及B1-2组)、肺肿瘤(A549细胞，第B2-1及B2-2组)、大肠肿瘤(HCT-116细胞，第B3-1及B3-2组)、肉瘤(S-180细胞，第B4-1及B4-2组)及乳房肿瘤(MDA-MB-231细胞，第B5-1及B5-2组)细胞株，该等肿瘤细胞株均培养于含有10％胎牛血清(FBS，购自Biological Industries，Kibbutz beit haemek)、2mmol/L L-麸氨酸(L-Glutamine，购自HyClone，USA)、1×非必须胺基酸(购自HyClone，USA)、100μg/ml链霉素(Streptomycin)及100U/ml青霉素(Peniccilin，购自HyClone，USA)的培养液(Dulbecco's Modified Eagle Medium；DMEM)，将该等肿瘤细胞株置于37℃、5％二氧化碳、湿度为95％的培养箱，每隔两天更换一次新鲜培养液。

[0050] 第4表、本试验各组别的肿瘤细胞株及其存活率

[0051]组别 细胞株 牛樟芝酒萃物 细胞存活率(％)*
B1-0 肝肿瘤 － 100
B1-1 肝肿瘤 第A1组 36.21±1.87
B1-2 肝肿瘤 第A2组 52.46±1.36
B2-0 肺肿瘤 － 100
B2-1 肺肿瘤 第A1组 9.75±1.06
B2-2 肺肿瘤 第A2组 37.64±2.13
B3-0 大肠肿瘤 － 100
B3-1 大肠肿瘤 第A1组 12.85±1.92
B3-2 大肠肿瘤 第A2组 30.95±2.37
B4-0 肉瘤 － 100
B4-1 肉瘤 第A1组 17.48±2.04
B4-2 肉瘤 第A2组 28.52±2.26
B5-0 乳房肿瘤 － 100
B5-1 乳房肿瘤 第A1组 29.05±1.73
B5-2 乳房肿瘤 第A2组 42.34±2.63

[0052] *细胞存活率的换算公式「：各组别吸光值」/「未经任何药物处理的控制组吸光值」×100％

[0053] 上述肿瘤细胞株于继代培养时，可以先将培养液与细胞以1000转进行离心5分钟，5
去除上清液后，再加入新鲜培养液，并且使10厘米培养皿中维持细胞数为约1×10 至1×
106cells/ml。试验进行时，可以取出已经长8至9分满的上述肿瘤细胞株的10厘米培养皿，去除已变色的培养液，加入8毫升PBS缓冲溶液冲洗细胞，加入胰蛋白酶/乙二胺乙酸(Trypsin/EDTA)，反应1至3分钟后，轻摇培养皿使细胞自壁上脱落，加入已回温的培养液，轻轻将细胞冲散，再将含细胞的培养液分别置入离心管内，以1500转离心10分钟，除去上清液后，再加入含血清的培养液，使细胞分散均匀，并取出20μl该等肿瘤细胞，加入20μl0.04％的锥虫蓝(Trypan Blue)进行染色，放入细胞计数器，并于显微镜下计数活细胞数，细胞存活率必须大于85％才可以进行后续试验。

[0054] 以含血清的培养液将上述肿瘤细胞株的浓度调整为1x105cell/ml，并且各取100μl的该等肿瘤细胞株接种于96孔盘，使每个槽孔含有1x104细胞，并于37℃、含5％二氧化碳的培养箱进行隔夜培养。

[0055] 经过24小时培养后，加入如第4表所示的牛樟芝酒萃物(浓度为125g/ml)，混合均匀后，于37℃，含5％的二氧化碳培养箱隔夜培养24小时。

[0056] 24小时后，移除培养液，以磷酸缓冲液冲洗后，再加入100μl含有CCK-8的新鲜培养液，置于37℃，含5％的二氧化碳培养箱反应2小时后，震摇5分钟后，检测每个槽孔于450nm波长下的吸光值。

[0057] 请参照第4表所示，不论是肝肿瘤(第B1-1及B1-2组)、肺肿瘤(第B2-1及B2-2组)、大肠肿瘤(第B3-1及B3-2组)、肉瘤(第B4-1及B4-2组)或乳房肿瘤(第B5-1及B5-2组)细胞，提供牛樟芝酒萃物(第A1或A2组)均可以降低该肿瘤细胞的存活率，并且，经光源照射的牛樟芝酒萃物(第A1组)具有更佳的降低肿瘤细胞存活率的效果(比较第B1-1及B1-2组、第B2-1及B2-2组、第B3-1及B3-2组、第B4-1及B4-2组或第B5-1及B5-2组)。

[0058] (C)对肿瘤小鼠的肿瘤抑制效力评估

[0059] 本试验选用购自国立成功大学医学院动物中心的Balb/C雄性小鼠，该小鼠皆在8周周龄以上，体重20-25g之间。该小鼠饲养于成功大学医学院的SPF动物中心，维持室温在25±1℃的动物室，光照时间与黑暗时间各为12小时。而且，小鼠可自由的进食与饮水；饲料(购自美国LabDiet,Inc.)及饮水皆由成功大学医学院动物中心供应。

[0060] 将肉瘤细胞株(如前述的S-180细胞株，购自食品工业发展研究所)以生理食盐水稀释至浓度为5×106cell/ml后，将该肉瘤细胞株于小鼠腋下部位进行皮下注射。

[0061] 接着，如第5表所示，将本较佳实施例的牛樟芝酒萃物分别通过胃管灌食到该小鼠，每天于固定时间灌食两次，连续投予30天，并且以x光照射纪录肿瘤面积。

[0062] 第5表、本试验各组别的小鼠及其肿瘤尺寸

[0063]

[0064] 请参照第5表所示，相较于未喂食牛樟芝酒萃物的小鼠(第C0组)，喂食本发明较佳实施例的牛樟芝酒萃物(第A1组)的小鼠的肿瘤体积缩小53.4±6.7％(第C1组)，而喂食未照射光源的牛樟芝酒萃物(第A2组)的小鼠的肿瘤体积缩小31.6±8.7％(第C2组)；可以得知，由本较佳实施例培养的牛樟芝具有较佳的抑制肿瘤生长的效果。

[0065] 综合上述，本发明的牛樟芝培养方法，可以培养出含有大量樟芝酸C及樟菇酸C的牛樟芝，进而达到提升牛樟芝的营养价值的功效。

[0066] 再者，本发明的牛樟芝培养方法，可以缩短牛樟芝的培养时间，进而达到提升牛樟芝的经济价值的功效。

[0067] 又，经本发明的牛樟芝酒萃物的制备方法所制备的牛樟芝酒萃物，具有高含量的樟芝酸C及樟菇酸C，可以降低肿瘤细胞的存活率，可以作为抑制肿瘤细胞生长的有效成分，为本发明的功效。

[0068] 此外，本发明的牛樟芝酒萃物可以作为一活性成分，可以有效抑制肝肿瘤细胞、肺肿瘤细胞、大肠肿瘤细胞、肉瘤细胞、乳房肿瘤细胞等肿瘤细胞的生长，具有使肿瘤细胞发生毒杀作用而无法增生或扩散的功效。

[0069] 只是以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，当不能以此限定本发明实施范围；因此，凡依本发明申请专利范围及创作说明书内容所作的简单的等效变化与修饰，皆应仍属本发明专利涵盖的范围内。