一种快速繁殖美国红栌的培养方法

摘要

本发明属于植物再生领域，提供一种快速繁殖美国红栌的培养方法，包括步骤：1)无菌体系的建立和增殖材料的准备，2)增殖培养：接入植物微扩繁器中的培养容器内进行培养，液体培养基的配方为MS+6-BA+NAA，3)生根培养：置换入液体生根培养基。生根培养基配方为1/2MS+IBA0.5-1.0mg·L-1，培养基体积为100-150ml。本发明采用间歇浸没式培养，使培养物不是全程浸没在液体培养基中，避免了长期浸没在液体中对植物生长和形态发生的不良作用，提高了种苗的质量。间歇浸没式培养可以提供充足的营养和氧气供应，降低美国红栌苗产生的酚类物质等不利因素和不利气体的积累，使培养物快速生长。

权利要求

1.一种快速繁殖美国红栌的培养方法，其特征在于，包括步骤：

1)无菌体系的建立和增殖材料的准备

采集美国红栌当年生带节的幼嫩茎段，用洗涤剂水刷洗外植体表面附着的污物，在自来水下冲洗40min，切割成2.0-3.0cm长，带1-2个节的茎段；在超净工作台上用75％酒精浸泡30s，再用0.1％HgCl2灭菌6min，无菌水漂洗4次，接种在添加了2.0g·L-1聚乙烯吡咯烷酮PVP的MS基本培养基+30g·L-1蔗糖+5.5g·L-1琼脂上；经过10d的培养观察，把无菌且生长状态良好的茎段转接入MS+6-BA 0.1mg·L-1+NAA 0.4mg·L-1+30g·L-1蔗糖+5.5g·L-1琼脂的培养基中，进行腋芽的诱导，待腋芽萌发生长至2.0cm，将其剪下接入组成为MS+6-BA0.8mg·L-1+NAA 0.4mg·L-1+30g·L-1蔗糖+5.5g·L-1琼脂的增殖培养基中诱导产生不定芽，以备后续间歇浸没式培养使用；

2)增殖培养

以步骤1)中得到的美国红栌不定芽为材料，材料长度≥2.0cm，保留2-3片叶片，接入植物微扩繁器中的培养容器内进行培养，使用的液体培养基的配方为：MS+6-BA 0.6mg·L-1+NAA 0.2mg·L-1+20g·L-1蔗糖，pH为6.0；增殖培养阶段的浸没频率为8次/24h、浸没时间为

7min/次，培养容器的容积1.2L，接种不定芽15株，注入液体培养基体积为150ml；

增殖培养40d后，统计得增殖倍数为5，增殖芽平均高度为4.7cm，大于相同条件固体培养中增殖倍数4，远大于相同条件固体培养中的增殖芽高度2.7cm；

3)生根培养

增殖培养结束后，将液体增殖培养基排出，置换入液体生根培养基，使用的生根培养基配方为：1/2MS+IBA 0.5mg·L-1+20g·L-1蔗糖，pH为6.0，培养基体积为150ml；生根阶段，浸没频率为6次/24h、10min/次，培养容器的容积1.2L加入培养基150ml；

以上培养过程中，控制温度为25±1℃，光照强度为40μmol·m-2·s-1，光照时间为16h·d-1，湿度为60％；

生根培养21d后，统计得生根率达90％，平均根数3，与固体培养的结果相似，平均根长为4.5cm，大于相同条件固体培养中的根长3.3cm；

生根培养阶段，根直接从茎段底部发出，基部不积累褐色物质。

说明书

一种快速繁殖美国红栌的培养方法

技术领域

[0001] 本发明属于植物再生领域，具体涉及一种通过组织培养技术进行木本植物再生的方法。

背景技术

[0002] 美国红栌(Cotinus coggygria‘Royal Purple’)是一种木本观赏植物，漆树科(Anacardiaceae)黄栌属(Cotinus)，落叶灌木或小乔木，其树形美观大方，叶片紫红色并保持一年三季常红，且季季有变化：初春时，树体全部叶片为鲜嫩的酒红色；春夏之交，叶色红而亮丽；至盛夏时节，树体下部叶片开始渐渐转为绿色，而顶梢新生叶始终为紫红色；入秋后整体叶色又逐渐转变为深酒红色，秋霜过后，叶色更加红艳。每年的夏季美国红栌在枝条顶端开花，花序絮状鲜红，如烟雾笼罩，所以又有“烟树”之称。与普通黄栌(Cotinus Coggygria Scop.)相比，美国红栌叶片较大，挂树时间较长，观景时间更长。

[0003] 美国红栌有较强的耐寒和抗旱性，对培养基质和pH要求不严，在沙土、壤土，pH酸性、盐碱性和中性土壤上均能生长。其根系发达，萌蘖性强，且对病虫害和污染能力有较强的抗性。由于它具有独特的生物学特性，优于彩叶树种紫叶李、紫叶小檗和红花檵木等，是一个极具观赏价值的树种。近几年，随着造林，森林旅游和园林绿化的发展，对美国红栌苗木的需求量越来越大。

[0004] 美国红栌种子萌发困难，且彩叶性状易分化变异，不能确保能保留其优异的观赏性；扦插较难生根，嫁接的成活率较低等，诸方面因素限制了该种苗的生产和供应。通过植物组织培养技术繁殖美国红栌，既能加快这一优良树种的繁殖速度，又能保持其优良性状。美国红栌的体外繁殖目前仅采用传统固体组织培养技术，已有的技术有，申请号为
03106827.8的“红栌高频率试管植株再生与工厂化育苗方法”和申请号为200410053515.4的“红栌的组培快繁方法”。但传统固体培养法费时费工，生产成本高，不能适应工厂化生产的需求。在植物离体培养过程中，外植体褐化是影响扩繁结果的重要因素。褐化现象主要是由于PPO(polyphenol oxidase，多酚氧化酶)作用于天然底物酚类物质，其被氧化产生醌类物质，这类物质聚合后呈棕褐或黑褐色，积累在培养物底部或扩散到培养基中，毒害培养的外植体材料，导致材料褐化，生长停顿，直至死亡(姚洪军等，1999)。许多木本植物组织中含有较多的酚类化合物，褐化现象较为严重。通常漆树科黄栌属植物含酚类物质多。本研究中的试验材料C.coggygria也是如此，在培养物的切口处通常产生大量酚类物质，其氧化后形成褐色醌类物质并逐渐扩散到培养基中或包裹在愈伤或分化了的组织的表面。这些褐色物质一般会抑制酶的活性，影响细胞代谢而阻碍新生组织的生长和分化。采用固体培养，C.coggygria的离体培养物分泌的褐色物质易在切口处积累，并包裹在愈伤或分化了的组织的表面，延迟了不定芽的生成，特别是阻碍了基部切口处根的发生，延长了扩繁周期。

[0005] 利用自动化、机械化方法进行植物体外再生来提高效率和降低生产成本已成为当前的研究热点。采用液体培养易于实现自动化控制，但培养物长期浸润在液体中易出现超度含水(hyperhydricity，又被称为玻璃化)现象，使用受限。间歇浸没式液体培养不仅能为培养的植物器官或幼小植物提供一个良好的生长环境，还能减少培养时的人力投入，提高种苗生产过程中的自动化程度。已有的技术有申请号为201110111047.1的“半夏属植物的组培快繁方法”、申请号为200910114406.1的“利用间歇浸没式生物反应器进行甘蔗组织培养快繁”及我们发明团队申请号为201310175520.1的“一种草莓微扩繁的液体培养方法”。上述专利所公开的技术内容并未涉及美国红栌的间歇浸没式微扩繁技术。利用间歇浸没式组织培养技术建立高效的美国红栌体外再生体系，为实现该树种种苗工厂化生产奠定基础，有利于该树种在中国园林及生态环境建设中的应用。

发明内容

[0006] 针对本领域存在的不足之处，本发明提出了一种美国红栌微扩繁的液体培养方法。

[0007] 为实现本发明目的的技术方案为：

[0008] 一种快速繁殖美国红栌的培养方法，包括步骤：

[0009] 1)无菌体系的建立和增殖材料的准备

[0010] 采集美国红栌当年生带节的幼嫩茎段，清洗后切割成2.0-3.0cm长，带1-2个节的-1茎段；灭菌处理后接种在添加了2.0g·L 聚乙烯吡咯烷酮PVP的MS基本培养基(Murashige and Skoog,1962)上；经过10d左右的培养观察，把无菌且生长状态良好的茎段转接入MS+6-BA0.1mg·L-1+NAA0.4mg·L-1培养基中，进行腋芽的诱导，待腋芽萌发生长至1.5-2.2cm，将其剪下接入增殖培养基MS+6-BA0.8mg·L-1+NAA0.4mg·L-1中诱导产生不定芽，以备后续间歇浸没式培养使用；

[0011] 2)增殖培养

[0012] 以步骤1)中得到的美国红栌不定芽为材料(长度≥2.0cm，保留2-3片叶片)，接入植物微扩繁器中的培养容器内进行培养。使用的液体培养基的配方为：MS+6-BA(0.6-0.8)mg·L-1+NAA(0.2-0.4)mg·L-1。增殖培养阶段的浸没频率为8-12次/24h、浸没时间为5-10min/次；

[0013] 3)生根培养

[0014] 增殖培养结束后，将液体增殖培养基排出，置换入液体生根培养基。使用的生根培养基配方为：1/2MS+IBA(0.5-1.0)mg·L-1，生根阶段浸没频率为6-10次/24h、5-10min/次；

[0015] 步骤1)中的清洗是用洗涤剂水刷洗外植体表面附着的污物，在自来水下冲洗30-60min。

[0016] 其中，所述步骤1)中的灭菌处理，用70-80％酒精浸泡20-40s，再用0.1％HgCl2灭菌5-8min，无菌水漂洗3-5次。

[0017] 优选地，所述步骤1)中的MS基本培养基、MS+6-BA0.1mg·L-1+NAA0.4mg·L-1培养基、增殖培养基MS+6-BA0.8mg·L-1+NAA0.4mg·L-1中均加有1中培养基均含有30g·L-1蔗糖和5.5g·L-1琼脂。pH

[0018] 优选地，所述步骤2)中，按照培养容器的容积每1.2L，接种不定芽10-15株。注入液体培养基体积为100-150ml。

[0019] 优选地，所述步骤2)中，增殖培养周期为28-30d。

[0020] 优选地，所述步骤3)中，按照培养容器的容积每1.2L加入培养基100-150ml；生根阶段的周期为18-20d。

[0021] 其中，所述步骤2)和步骤3)中的液体培养基和生根培养基中均含有20-30g·L-1蔗糖。所述步骤2)和步骤3)使用的培养基不含琼脂，pH为6.0。

[0022] 其中，培养过程中，控制温度为(25±1)℃，光照强度为35-50μmol·m-2·s-1，光照时间为16h·d-1，湿度为60％。

[0023] 培养过程中固、液的培养基pH都为6.0。配制培养基时，激素加完后测量其pH值，如果较低，可用1mol·L-1NaOH溶液调节。

[0024] 进一步地，本发明可采用间歇浸润式植物微扩繁器(专利名称为“一种可自动换液的间歇浸润式植物微扩繁器”，专利号：201220470675.9)进行材料的微扩繁实验。该植物微扩繁器主要由若干组并联连接的植物生长器单元、电控制的液泵、真空泵及多个电磁阀组成。每一组所述植物生长器单元均包括一植物培养瓶、一液体瓶、一截止阀、两个滤菌器及若干三通管。利用液泵和真空泵实现培养液对植物材料的间歇浸没及培养液的自动更换。

[0025] 本发明的有益效果在于：

[0026] 1.本发明采用的间歇浸没式培养方式，使培养物不是全程浸没在液体培养基中，其在间断液体浸没时可与气体接触，避免了长期浸没在液体中对植物生长和形态发生的不良作用；其次，间歇浸没式培养可以提供充足的营养和氧气供应，降低不利气体在培养环境中的积累；同时由于液体培养基的流动性和更换简易，也降低了美国红栌产生的酚类物质等不利因素在培养苗基部的褐化和积累，从而能使其快速生长，既增加了微扩繁产量，又提高了种苗的质量；且光合和呼吸代谢增强，提高了扩繁苗的适应性，可缩短甚至省去炼苗的时间。

[0027] 2.液体培养基的使用，使培养物更有效的吸收养分和激素。相比固体培养，不仅节约了耗材(比如少加蔗糖)，而且只需添加低浓度的激素水平就能达到很好的植株再生效果。适宜的低浓度激素配比既能使苗大量扩繁，又能维持苗的优良性状，更适于美国红栌组培扩繁的实际大规模生产。

[0028] 3.从实验准备到把苗接入培养瓶比传统组培方式节省了5-6个小时，而且只需一次接种，之后就只需定时更换培养液即可，不再需要转接工作，从而节省了大量劳动力，降低了生产成本。

[0029] 本发明利用自制的间歇浸没式装置进行美国红栌无菌苗的微扩繁培养，此培养体系自动化程度高，能够实现液体培养基的自动注入和排出，无需人工操作；另外培养单元两端都分别有一个0.2μm的过滤器，减少了污染率，且由于各培养单元采用的是并联的方式，使培养时的染菌现象终止简易，防止交叉污染。

附图说明

[0030] 图1为间歇浸没式培养产生的美国红栌增殖芽，基部不积累褐色物质。

[0031] 图2为间歇浸没式培养产生的美国红栌生根苗，基部不积累褐色物质。

[0032] 图3为实施例3间歇浸没式培养中美国红栌芽照片。

[0033] 图4为对比例中固体增殖培养的美国红栌增殖芽(容器测视角度的照片)，基部产生褐化物质。

[0034] 图5为对比例中固体生根培养的美国红栌苗(容器仰视角度的照片)，基部产生褐化物质。

具体实施方式

[0035] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0036] 实施例中使用的美国红栌，为北京林业大学苗圃内种植(在北京林业大学苗圃内生长十年的植株)。

[0037] 实施例中采用的培养装置为本实验室自制的可自动换液的间歇浸润式植物微扩繁器(专利名称为“一种可自动换液的间歇浸润式植物微扩繁器”，专利号：201220470675.9)进行材料的微扩繁实验。该植物微扩繁器主要由若干组并联连接的植物生长器单元、电控制的液泵、真空泵及多个电磁阀组成。每一组所述植物生长器单元均包括一植物培养瓶(红栌苗接种在植物培养瓶中，该瓶体积1.2L)、一液体瓶、一截止阀、两个滤菌器及若干三通管。该扩繁器的营养液进出量、浸润时间和间歇时间由自动控制系统进行控制，利用液泵和真空泵实现培养液对植物材料的间歇浸没及培养液的自动更换。植物培养瓶、液体瓶和真空泵的气体进口导管上设置有滤膜孔径0.2μm的滤菌器。

[0038] 增殖倍数和生根率的计算：

[0039] 增殖倍数＝增殖的不定芽数/接种的芽数          (1)

[0040] 生根率＝(生根的株数/接种的总株数)×100％    (2)

[0041] 实施例1

[0042] 1)无菌体系的建立和增殖材料的准备

[0043] 采集美国红栌当年生带节的幼嫩茎段，用洗涤剂水刷洗外植体表面附着的污物，在自来水下冲洗30min。切割成2.0-3.0cm长，带1-2个节的茎段；在超净工作台上用75％酒精浸泡30s，再用0.1％HgCl2灭菌6min，无菌水漂洗4次。接种在添加了2.0g·L-1聚乙烯吡咯烷酮PVP的MS基本培养基(Murashige and Skoog,1962)+30g·L-1蔗糖+5.5g·L-1琼脂(pH为6.0)上；经过10d左右的培养观察，把无菌且生长状态良好的茎段转接入MS+6-BA0.1mg·L-1+NAA0.4mg·L-1+30g·L-1蔗糖+5.5g·L-1琼脂的培养基(pH为6.0)中，进行腋芽的诱导，待腋芽萌发生长至2.0cm，将其剪下接入组成为MS+6-BA0.8mg·L-1+NAA0.4mg·L-1+30g·L-1蔗糖+5.5g·L-1琼脂的增殖培养基(pH为6.0)中诱导产生不定芽，以备后续间歇浸没式培养使用；

[0044] 2)增殖培养

[0045] 以步骤1)中得到的美国红栌不定芽为材料(长度≥2.0cm，保留2-3片叶片)，接入植物微扩繁器中的培养容器内进行培养。使用的液体培养基的配方为：MS+6-BA0.8mg·L-1+NAA0.4mg·L-1+30g·L-1蔗糖，pH为6.0。增殖培养阶段的浸没频率为12次/24h、浸没时间为5min/次，培养容器的容积1.2L，接种不定芽10株。注入液体培养基体积为100-150ml。

[0046] 增殖培养28d后，增殖倍数达到7，85％的增殖芽高度≥2.0cm，增殖阶段基本完成，可进行下一步的生根培养。

[0047] 增殖培养阶段，美国红栌芽基部产生的褐色物质随着液体培养基的流动而不积累在芽基部(图1，间歇浸没式培养的美国红栌芽，基部不积累褐色物质)。

[0048] 3)生根培养

[0049] 增殖培养结束后，将液体增殖培养基排出，置换入液体生根培养基。使用的生根培养基配方为：1/2MS+IBA1.0mg·L-1+30g·L-1蔗糖，pH为6.0，培养基体积为150ml。生根阶段，浸没频率为8次/24h、10min/次，培养容器的容积1.2L加入培养基100-150ml。

[0050] 以上培养过程中，控制温度为(25±1)℃，光照强度为40μmol·m-2·s-1，光照时间为16h·d-1，湿度为60％。

[0051] 生根培养18d后，生根率达95％，生根率高于固体培养20％。

[0052] 生根培养阶段，因上部芽基部没有褐色物质的积累，芽一般不需要进行处理。而对比固体培养中，增殖培养产生的芽基部形成大量褐色物质，若不剪掉直接接入生根培养基，则美国红栌芽不生根。

[0053] 整个扩繁周期所用时间为46d，所用时间比固体培养至少节省14d。

[0054] 实施例2

[0055] 1)无菌体系的建立和增殖材料的准备

[0056] 采集美国红栌当年生带节的幼嫩茎段，用洗涤剂水刷洗外植体表面附着的污物，在自来水下冲洗40min。切割成2.0-3.0cm长，带1-2个节的茎段；在超净工作台上用75％酒精浸泡30s，再用0.1％HgCl2灭菌6min，无菌水漂洗4次。接种在添加了2.0g·L-1聚乙烯吡咯烷酮PVP的MS基本培养基(Murashige and Skoog,1962)+30g·L-1蔗糖+5.5g·L-1琼脂(pH-1为6.0)上；经过10d的培养观察，把无菌且生长状态良好的茎段转接入MS+6-BA0.1mg·L +NAA0.4mg·L-1+30g·L-1蔗糖+5.5g·L-1琼脂的培养基(pH为6.0)中，进行腋芽的诱导，待腋芽萌发生长至2.0cm，将其剪下接入组成为MS+6-BA0.8mg·L-1+NAA0.4mg·L-1+30g·L-1蔗糖+5.5g·L-1琼脂的增殖培养基(pH为6.0)中诱导产生不定芽，以备后续间歇浸没式培养使用；

[0057] 2)增殖培养

[0058] 以步骤1)中得到的美国红栌不定芽为材料(长度≥2.0cm，保留2-3片叶片)，接入植物微扩繁器中的培养容器内进行培养。使用的液体培养基的配方为：MS+6-BA0.6mg·L-1+NAA0.2mg·L-1+20g·L-1蔗糖，pH为6.0。增殖培养阶段的浸没频率为8次/24h、浸没时间为7min/次，培养容器的容积1.2L，接种不定芽15株。注入液体培养基体积为150ml。

[0059] 增殖培养40d后，统计得增殖倍数为5，增殖芽平均高度为4.7cm，大于相同条件固体培养中增殖倍数(4)，远大于相同条件固体培养中的增殖芽高度(2.7cm)。

[0060] 3)生根培养

[0061] 增殖培养结束后，将液体增殖培养基排出，置换入液体生根培养基。使用的生根培养基配方为：1/2MS+IBA0.5mg·L-1+20g·L-1蔗糖，pH为6.0，培养基体积为150ml。生根阶段，浸没频率为6次/24h、10min/次，培养容器的容积1.2L加入培养基150ml。

[0062] 以上培养过程中，控制温度为(25±1)℃，光照强度为40μmol·m-2·s-1，光照时间-1为16h·d ，湿度为60％。

[0063] 生根培养21d后，统计得生根率达90％，平均根数(3)与固体培养的结果相似，平均根长为4.5cm，大于相同条件固体培养中的根长(3.3cm)。

[0064] 生根培养阶段，根直接从茎段底部发出，基部不积累褐色物质(图2，间歇浸没式培养产生的美国红栌生根苗)。

[0065] 实施例3

[0066] 1)无菌体系的建立和增殖材料的准备

[0067] 采集美国红栌当年生带节的幼嫩茎段，用洗涤剂水刷洗外植体表面附着的污物，在自来水下冲洗30min。切割成2.0-3.0cm长，带1-2个节的茎段；在超净工作台上用75％酒精浸泡30s，再用0.1％HgCl2灭菌6min，无菌水漂洗4次。接种在添加了2.0g·L-1聚乙烯吡咯烷酮PVP的MS基本培养基(Murashige and Skoog,1962)+30g·L-1蔗糖+5.5g·L-1琼脂(pH为6.0)上；经过10d左右的培养观察，把无菌且生长状态良好的茎段转接入MS+6-BA0.1mg·L-1+NAA0.4mg·L-1+30g·L-1蔗糖+5.5g·L-1琼脂的培养基(pH为6.0)中，进行腋芽的诱导，待腋芽萌发生长至2.0cm，将其剪下接入组成为MS+6-BA0.8mg·L-1+NAA0.4mg·L-1+30g·L-1 -1蔗糖+5.5g·L 琼脂的增殖培养基(pH为6.0)中诱导产生不定芽，以备后续间歇浸没式培养使用；

[0068] 2)增殖培养

[0069] 以步骤1)中得到的美国红栌不定芽为材料(长度≥2.0cm，保留2-3片叶片)，接入-1植物微扩繁器中的培养容器内进行培养。使用的液体培养基的配方为：MS+6-BA0.8mg·L +NAA0.4mg·L-1+20g·L-1蔗糖，pH为6.0。增殖培养阶段的浸没频率为24次/24h、浸没时间为
15min/次，培养容器的容积1.2L，接种不定芽15株。注入液体培养基体积为150ml。增殖培养周期28d。

[0070] 增殖培养阶段，由于浸没频率和浸没时间过高，导致美国红栌芽出现严重的褐化和超度含水现象(图3)，降低了增殖倍数(≤3)，且增殖芽质量较低。

[0071] (3)生根培养

[0072] 增殖培养结束后，将液体增殖培养基排出，置换入液体生根培养基。使用的生根培养基配方为：1/2MS+IBA0.5mg·L-1+20g·L-1蔗糖，pH为6.0，培养基体积为150ml。生根阶段，浸没频率为24次/24h、15min/次，培养容器的容积1.2L加入培养基100-150ml。由于增殖阶段芽褐化现象和超度含水现象的发生，导致不定芽质量较低，影响了其生根率(生根率为49％)。

[0073] 以上培养过程中，控制温度为(25±1)℃，光照强度为40μmol·m-2·s-1，光照时间为16h·d-1，湿度为60％。

[0074] 对比例固体培养

[0075] 步骤1)同实施例1。

[0076] 2)增殖培养

[0077] 以步骤1)中得到的美国红栌不定芽为材料(长度≥2.0cm，保留2-3片叶片)，接入玻璃瓶中(容积为150ml)进行培养。使用的固体培养基配方为：MS+6-BA0.6mg·L-1+NAA0.2mg·L-1+30g·L-1蔗糖+5.5g·L-1的琼脂，pH为6.0。增殖培养周期40d。

[0078] 增殖培养阶段，培养基中的芽基部切口处积累褐色物质。

[0079] 3)生根培养

[0080] 增殖培养结束后，将不定芽(长度≥2.0cm)切下转入固体生根培养基，固体生根培养基配方为1/2MS+IBA0.5mg·L-1+30g·L-1蔗糖+5.5g·L-1琼脂。

[0081] 其他培养条件同实施例1。

[0082] 增殖倍数为4。生根率为67％。基部褐色物质积累率为95％。增殖培养中褐色物质的积累影响增殖芽的质量和后续的生根培养；生根培养中褐色物质的积累阻碍根的发生，是导致生根率低下的重要原因(图4和图5)。

[0083] 虽然，上文中已经用一般性说明和具体实施方式，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。