HIV逆转录酶/整合酶双靶点抑制剂6-苯甲酰基取代尿嘧啶类化合物的制备及应用

摘要

本专利涉及新型HIV-1逆转录酶及整合酶双靶点抑制剂6-(3’5’-二取代)苯甲酰基-5取代尿嘧啶类化合物及含有所述化合物的药物组合物作为治疗艾滋病药物和抗病毒药物中的应用，式中各个基团的定义如权利要求书所述。同时还涉及此类化合物的制备方法。R1＝H，CH2ＯH，CHO，CＯＯH，CＯＯCH3，CＯＯCH2CH3，CONHCH3，CONHCH2CH3。R＝CH3，H，F。

权利要求

1.通式I化合物

其中：

R1为：氢，羟甲基，甲醛基，甲酸基，甲酸乙酯基，甲酸甲酯基，N-甲基-甲酸氨基，N-乙基甲酸氨基；

R为：甲基，氢，氟。

2.权利要求1所述的通式I化合物，其具体化合物为：1-苄氧甲基-5-羟甲基-6-苯甲酰基尿嘧啶，1-苄氧甲基-5-羟甲基-6-(3’，5’-二甲基)-苯甲酰基尿嘧啶，1-苄氧甲基-5-羟甲基-6-(3’，5’-二氟)-苯甲酰基尿嘧啶，1-苄氧甲基-5-甲酰基-6-苯甲酰基尿嘧啶，1-苄氧甲基-5-甲酰基-6-(3’，5’-二甲基)-苯甲酰基尿嘧啶，1-苄氧甲基-5-甲酰基-6-(3’，5’-二氟)-苯甲酰基尿嘧啶，1-苄氧甲基-5-羧基-6-苯甲酰基尿嘧啶，1-苄氧甲基-5-羧基-6-(3’，5’-二甲基)-苯甲酰基尿嘧啶。

3.一种如权利要求1或2中所述的化合物的制备方法，其特征在于：按照以下路线合成

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：以2，4-二甲氧基-6-氯尿嘧啶为起始原料，与3，5位取代的苯乙腈在氧化钠和DMF的条件下生成1a-c，以甲醇为溶剂，用36％浓盐酸脱除2，4位的甲氧基，得到2a-c，化合物2a-c在1.25N NaOH的水溶液中与甲醛反应生成5位为羟甲基的尿嘧啶类似物3a-c，之后在叔丁醇和水的混合溶剂中室温条件下用CAN氧化生成5位生成甲酰基取代的产物4a-c，以无水CH3CN为溶剂，将4a-c与BSA、氯甲基苄基醚反应，生成N-1位取代的产物5a-c，5a-c用Pinnick氧化方法得到5位为羧基取代的产物6a-c。

5.一种药物组合物，其含有权利要求1-2中任一项所述的化合物以及至少一种可药用载体。

6.权利要求1-2任一项所述的化合物在制备HIV逆转录酶及整合酶双靶点药物中的用途。

说明书

HIV逆转录酶/整合酶双靶点抑制剂6-苯甲酰基取代尿嘧啶类

化合物的制备及应用

技术领域

[0001] 本专利涉及新型HIV-1逆转录酶及整合酶双靶点抑制剂6-(3’5’-二取代)苯甲酰基-5取代尿嘧啶类化合物及含有所述化合物的药物组合物作为治疗艾滋病药物和抗病毒药物中的应用，式中各个基团的定义如权利要求书所述。同时还涉及此类化合物的制备方法。

背景技术

[0002] 艾滋病被誉为二十世纪的瘟疫，严重威胁着人类的健康和生存。我国自发现首例艾滋病以来，HIV感染人数不断上升，发展势头迅猛，对我国的经济发展造成了严重威胁，与此同时也带来了一系列社会问题，艾滋病的防治变得刻不容缓。由于HIV是一种变异性很强的病毒，长期服药而产生的耐药及交叉耐药等问题对艾滋病药物的研发带来了一定的困难。目前，临床上广泛采取的治疗策略是抗病毒组合疗法(又称鸡尾酒疗法HAART)可使病毒载量下降到检测水平以下。但由于HIV仍在低水平复制，需终身治疗。而长期用药，使病毒产生耐药性，疗效显著下降。用药剂量大，药物之间产生的毒副作用使病人难以忍受，更重要的是昂贵的价格使得患者特别是发展中国家的患者难以承受。因此，研发具有自主产权的高效低毒的价格便宜的抗HIV药物是摆在我国政府和科学家面前的一个十分迫切和重要的课题。

[0003] 随着系统生物学研究的不断深入发现，多靶点药物治疗可通过协同效应的产生而达到最佳的治疗效果，从而为治疗艾滋病药物研究提供了一种全新的思路。多靶点药物设计可以改善疾病系统对药物产生的耐药性，尤其是在艾滋病治疗方面。基于多靶点配体药物的设计理念，将两种抑制剂的药效团进行高度整合而得到一类具有两种抑制剂药效团的相关结构的新分子。针对HIV病毒复制周期中的不同阶段与靶点的研究发现，由于在人体中不存在逆转录酶(RT)和整合酶(IN)的功能类似物，因此这两个酶是设计高效、低毒的抗HIV药物的理靶点。

[0004] 非核苷类逆转录酶抑制剂是一组与核苷无关、化学结构完全不同的特异性抑制HIV-1逆转录酶的化合物。这组化合物的共同特点是：通过非竞争性结合可高度抑制HIV-1病毒；由于其作用位点不在底物结合区，因此对宿主细胞的DNA聚合酶活性不会产生影响，故毒性很小，有很高的抗病毒选择指数。其中TNK-651作为非核苷类逆转录酶抑制剂而进入临床前研究。与此同时，在HIV病毒复制的过程中，利用整合酶将病毒的遗传物质整合到宿主细胞中进行DNA的复制。由于整合酶只存在于病毒中，哺乳动物类均无对应酶，因此以整合酶为靶标的抑制剂将具有较高的选择性和较低的毒性。作为成功的一类整合酶抑制剂二酮酸类化合物，能与整合酶-DNA复合物(PIC)的催化核心区域DDE基序上的二价金属结合，使其处于一个非活性的状态，从而阻止了催化核心区域上的活性位点与宿主DNA结合，选择性抑制了链转移的过程。其中1，3-二羰基结构，是产生酶抑制活性的关键药效基团。

[0005] 本申请涉及进入临床试验的TNK-651类化合物及对整合酶有明显效果的二酮酸(DKA)类化合物，根据双靶点药物设计的理论将两种抑制剂的药效团进行高度整合，提供一类6(3’5’-二取代)苯甲酰基-5取代尿嘧啶类新分子，使其具有高效的对HIV-1逆转录酶及整合酶的抑制活性。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供6-(3’5’-二取代)苯甲酰基-5取代尿嘧啶类化合物作为治疗艾滋病药物和抗病毒药物中的应用及此类化合物的制备方法。

[0007] 根据多靶点药物设计、生物电子等排原理和氢键作用等相关理论，结合取代基的电性效应、立体效应，以非核苷酸类逆转录酶抑制剂TNK-651和二酮酸类整合酶抑制剂为先导化合物，选取必要的药效团进行高度整合并对其进行合理优化，从而得到6-(3’5’-二取代)苯甲酰基-5取代尿嘧啶类化合物作为对HIV病毒 的逆转录酶及整合酶的双靶点抑制剂。

[0008] 化合物中5位基团为羟甲基、醛基、羧基以及羧酸衍生物，使其能够与4位的羰基，6位苯甲酰基形成二酮酸类结构区域，从而与整合酶-DNA复合物(PIC)的催化核心区域DDE基序上的二价金属离子结合，使其处于一个非活性的状态，从而阻止了催化核心区域的活性位点与宿主DNA结合，选择性抑制了链转移的过程；其他位置则保留有利于抑制逆转录酶的结构。从而提高对HIV病毒及常见耐药株的抑制活性。进一步涉及对此化合物对HIV逆转录酶及整合酶抑制活性的评价以及此类化合物作为HIV-1逆转录酶和整合酶双靶点抑制剂的应用。

[0009] 根据本发明的一个实施方案，本发明涉及通式I类衍生物：

[0010]

[0011] R1＝H，CH2OH，CHO，COOH，COOCH3，COOCH2CH3，CONHCH3，CONHCH2CH3

[0012] R＝CH3，H，F

[0013] 通式I

[0014] 通式I化合物中具体的化合物：1-苄氧甲基-5-羟甲基-6-苯甲酰基尿嘧啶，1-苄氧甲基-5-羟甲基-6-(3’，5’-二甲基)-苯甲酰基尿嘧啶，1-苄氧甲基-5-羟甲基-6-(3’，5’-二氟)-苯甲酰基尿嘧啶，1-苄氧甲基-5-甲酰基-6-苯甲酰基尿嘧啶，1-苄氧甲基-5-甲酰基-6-(3’，5’-二甲基)-苯甲酰基尿嘧啶，1-苄氧甲基-5-甲酰基-6-(3’，5’-二氟)-苯甲酰基尿嘧啶，1-苄氧甲基-5-羧基-6-苯甲酰基尿嘧啶，1-苄氧甲基-5-羧基-6-(3’，5’-二甲基)-苯甲酰基尿嘧啶，1-苄氧甲基-5-羧基-6-(3’，5’-二氟)-苯甲酰基尿嘧啶，1-苄氧甲基-5-羧酸甲酯基-6苯甲酰基尿嘧啶，1-苄氧甲基-5-羧酸甲酯基-6-(3’，5’-二甲基)-苯甲酰基尿嘧啶，1-苄氧甲基-5-羧酸甲酯基-6-(3’，5’-二氟)-苯甲酰基尿嘧啶，1-苄氧甲基-5-羧酸乙酯基-6苯甲酰基尿嘧啶，1-苄氧甲基-5-羧酸乙酯基-6-(3’，5’-二甲基)-苯甲酰基尿嘧啶，1-苄氧甲基-5-羧酸乙酯基-6-(3’，5’-二氟)-苯甲酰基尿嘧啶，1-苄氧甲基-5-(N-甲基)-甲酰胺基-6-苯甲酰基尿嘧啶，1-苄氧甲基-5-(N-甲基)-甲酰胺基-6-(3’，5’-二甲基)-苯甲酰基尿嘧啶，1-苄氧甲基-5-(N-甲基)-甲酰胺基-6-(3’，5’-二氟原子)-苯甲酰基尿嘧啶，1-苄氧甲基-5-(N-乙基)-甲酰胺基-6-苯甲酰基尿嘧啶，1-苄氧甲基-5-(N-乙基)-甲酰胺基-6-(3’，5’-二甲基)-苯甲酰基尿嘧啶，1-苄氧甲基-5-(N-乙基)-甲酰胺基-6-(3’，5’-二氟)-苯甲酰基尿嘧啶

[0015] 本发明的部分化合物可按照以下合成路线制备，通过下列反应式将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容

[0016]

具体实施方式

[0017] 为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。如无特殊说明，下述实施例中“减压旋干溶剂”一般指“水泵减压条件下用旋转蒸发仪蒸干溶剂”。

[0018] 实施例1

[0019] 2，4-二甲氧基-6-氯嘧啶的制备(1a)

[0020] 将4.0(174mmol)的钠粒置于100ml无水甲醇中，制得的甲醇钠溶液缓慢滴加到15.7g(86mml)2，4，6三氯嘧啶中的甲醇(150ml)溶液中，搅拌过夜。过滤除去沉淀，将滤液减压蒸干，加入100ml乙酸乙酯，用水(50ml×2)洗涤，合并有机层，用无水硫酸钠干燥，浓缩。
石油醚重结晶，得到针状结晶12.2g，收率81％；熔点74-76℃。

[0021] 1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ＝6.42(s，1H，Py-H)，4.00(s，3H，2-OCH3)，3.98(s，3H，4-OCH3).

[0022] 实施例2

[0023] 2，4-二甲氧基-6-(3，5-二甲基)苯甲酰基嘧啶的制备(2a)

[0024] 将3，5-二甲基苯乙腈(725mg，5mmol)溶于40mlDMF中，冰浴条件下，加入NaH(120mg，5mmol)。氮气保护搅拌1小时，体系由无色变为酒红色，之后加入2.4-二甲氧基-6-氯嘧啶(924mg，6mmol)。室温搅拌48小时，向反应体系中通入空气，继续搅拌48～72小时。停止反应，减压蒸除溶剂后，加入200ml水，用盐酸调节PH到中性。乙酸乙酯(100ml×3)萃取，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥。柱层析分离纯化(石油醚/乙酸乙酯)得到淡黄色固体。收率89％；熔点110-112℃；MS(ES+)m/z：273.22[M+H]

[0025] 2，4-二甲氧基-6苯甲酰基嘧啶的制备(2b)

[0026] 用合成化合物2a的方法，通过和苯乙腈反应得到固体化合物2b。收率81％；熔点89-91℃；MS(ES-)m/z：243.11[M]

[0027] 2，4-二甲氧基-6-(3，5-二氟)-苯甲酰基嘧啶的制备(2c)

[0028] 用合成化合物2a的方法，通过和3，5-二氟苯乙腈反应得到固体化合物2c。收率72％；熔点73-75℃；MS(ES+)m/z：281[M+H]

[0029] 实施例3

[0030] 6-(3，5-二甲氧基)苯甲酰基尿嘧啶的制备(3a)

[0031] 将化合物2a(500mg，1.85mmol)溶于50ml甲醇中，加入10ml浓盐酸HCl，加热回流4小时。TLC检测反应结束后，冷却反应，有淡黄色固体析出，抽滤，分别用石油醚(10ml×3)，水(10ml×3)淋洗。得到白色固体化合物3a。收率86％；熔点244-246℃；MS(ES-)m/z：271.05[M]

[0032] 1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ＝11.37(s，1H，N3-H)，11.20(s，1H，N1-H)5.67(s，1H，5-H)，2.32(6H，CH3)；

[0033] 13C-NMR(125MHz，DMSO-d6)δ＝189.4，164.29，151.45，148.37，138.84，136.47，103.59，21.10.

[0034] 6-苯甲酰基尿嘧啶的制备(3b)

[0035] 用合成化合物3a的方法，通过和化合物2b反应得到白色固体3b。收率81％；熔点234-236℃；MS(ES-)m/z＝215.11[M]

[0036] 1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ＝11.39(s，1H，N3-H)，11.22(s，1H，N1-H)，7.60-7.92(m，5H，Ph-H)，5.71(s，5-H)；

[0037] 3C-NMR(400Mhz，DMSO-d6)δ＝189.33，164.26，151.45，148.08，135.03，134.58，130.34，129，44，103.98.6-(3’，5’-二氟)苯甲酰基尿嘧啶的制备(3c)

[0038] 用合成化合物3a的方法，通过和化合物2c反应得到白色固体3c。收率82％；熔点240-242℃。

[0039] MS(ES-)m/z＝251.03[M]

[0040] 1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ＝11.40(s，1H，N3-H)，11.21(s，1H，N1-H)，7.62-7.71(m，3H，Ph-H)，5.82(s，1H，5-H)；

[0041] 13C-NMR(400Mhz，DMSO-d6)δ＝187.36，163.95，164.28，161.48，151.42，146.81，137.82，113.60，110.37，105.31.

[0042] 实施例4

[0043] 5-羟甲基-6-(3’，5’-二甲基)-苯甲酰基尿嘧啶的制备(4a)

[0044] 将化合物3a(500mg，2.04mmol)溶于15ml1.25NNaOH的水溶液中，于上述反应液中滴加0.6g的CH2O(37-40％)溶液，室温搅拌48h。用3NHCl调节PH为4，乙酸乙酯(50ml×3)萃取，合并有机层，用无水硫酸钠干燥。柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝9∶1)分离纯化。得到白色固体4a。收率90.1％；熔点116-118℃；MS(ES-)m/z：273.07[M]

[0045] 1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ＝11.20(s，1H，N3-H)，11.09(s，1H，N1-H)，6.92-7.12(m，3H，Ph-H)，4.86(dd，2H，CH2OH)，4.06(s，1H，CH2OH)，2.33(s，6H，CH3)；

[0046] 13C-NMR(125Mhz，DMSO-d6)＝189.14，164.44，160.99，153.33，138.83，137.32，136.49，127.52，124.61，109.76，67.65，21.42.

[0047] 5-羟甲基-6-苯甲酰基尿嘧啶的制备(4b)

[0048] 用合成化合物4a的方法，和化合物3b反应得到白色固体4b。收率87.3％；熔点125-127℃；MS(ES-)m/z：245.15[M]

[0049] 1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ＝11.23(s，1H，N3-H)，11.19(s，1H，N1-H)，7.72(s，1H，CH2OH)，6.90-7.22(m，3H，Ph-H)，4.87(dd，2H，CH2OH)；

[0050] 13C-NMR(125Mhz，DMSO-d6)δ＝163.67，160.65，162.29，154.07，153.08，145.29，110.38，69.06.

[0051] 5-羟甲基-6-(3’，5’-二氟)苯甲酰基尿嘧啶(4c)

[0052] 用合成化合物4a的方法，和化合物3c反应得到白色固体4c。收率86.1％；熔点128-130℃；MS(ES-)m/z：281.14[M]

[0053] 1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ＝11.42(s，1H，N3-H)，11.17(s，1H，N1-H)，7.90(s，1H，CH2OH)，6.90-7.22(m，3H，Ph-H)，4.87(dd，2H，CH2OH)；

[0054] 13C-NMR(125Mhz，DMSO-d6)δ＝163.67，160.65，161.29，152.07，153.07，145.19，110.38，69.06.

[0055] 实施例5

[0056] 5-甲酰基-6-(3’，5’-二甲基)苯甲酰基尿嘧啶(5a)

[0057] 将化合物4a(548mg，2mmol)溶于90ml混合溶液(t-BuOH∶H2O＝2∶1)中，与上述反应液中加入4g硝酸铈铵，室温搅拌，反应液由酒红色变为淡黄色。24小时后停止反应，向反应体系中加入50ml水，用乙酸乙酯(100ml×3)萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥过夜，减压蒸除有机溶剂，柱层析(石油醚/乙酸乙酯)分离纯化，得到淡黄色固体产物5a。收率80％；熔点129-131℃。

[0058] MS(ES-)m/z：271.05[M]

[0059] 1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ＝12.35(s，1H，N-3)，11.78(s，1H，N-1)，9.76(s，1H，CHO-H)7.39-7.59(m，3H，ph-H)，2.32(s，6H，CH3H)；

[0060] 13C-NMR(125Mhz，DMSO-d6)δ＝189.68，186.97，163.68，157.41，150.48，138.98，136.70，126.97，21.07.

[0061] 5-甲酰基-6-苯甲酰基尿嘧啶(5b)的制备

[0062] 用合成化合物5a的方法，和化合物4b反应的到淡黄色固体5b，收率79％；熔点280-282℃。

[0063] MS(ES-)m/z：243.15[M]

[0064] 1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ＝12.44(s，1H，N-3)，11.75(s，1H，N1-H)，9.79(s，1H，CHO-H)7.51-7.92(m，5H，ph-H)；

[0065] 13C-NMR(400Mhz，DMSO-d6)δ＝189.24，187.05，163.58，157.14，150.44，135.27，133.92，129.29.

[0066] 5-甲酰基-6-(3’，5’-二氟)苯甲酰基尿嘧啶(5c)的制备

[0067] 用合成化合物5a的方法，和化合物4c反应得到淡黄色固体5c。收率81％；熔点238-240℃。

[0068] MS(ES-)m/z：279.05[M]

[0069] 1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ＝11.78(s，1H，N-3)，11.21(s，1H，N1-H)，9.74(s，1H，CHO-H)，7.21-7.88(m，3H，ph-H)；

[0070] 13C-NMR(400Mhz，DMSO-d6)δ＝189.31，187.41，165.35，152.06，151.39，133.27，128.28.

[0071] 实施例6

[0072] 1-苄氧甲基-5-甲酰基-6-(3’-5’-二甲基)-苯甲酰基尿嘧啶(6a)

[0073] 将化合物5a(200mg，0.73mmol)与0.38mlBSA(312mg，1.46mmol)加入15ml无水乙腈中，室温搅拌半小时，于澄清的反应液中加入氯甲基苄基醚(68.7mg，0.73mmol)与催化剂碘化铯(189mg，0.73mmol)，室温搅拌反应1.5小时。停止反应，向反应体系中加入20ml饱和碳酸氢钠溶液猝灭反应，用乙酸乙酯(30ml×3)萃取，合并有机层，用无水硫酸钠干燥。柱层析(石油醚/乙酸乙酯)分离纯化。得到白色固体产物6a。收率51.5％；熔点182-184℃；MS(ES+)m/z：415.26[M+Na]

[0074] 1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ＝10.01(s，1H，N1-H)，9.90(s，1H，CHO)，7.33-7.40(m，5H，N1-Ph-H)，6.97(s，2H，C6-Ar-H2，H5)，5.29(s，2H，NCH2O)，4.43(s，2H，OCH2Ph)，2.38(s，
6H，CH3Ph).

[0075] 13C-NMR(400Mhz，DMSO-d6)δ＝188.61，185.99，162.61，157.55，148.97，138.94，136.92，134.27，127.99，126.44，73.56，71.57，21.13.

[0076] 1-苄氧甲基-5-甲酰基-6苯甲酰基尿嘧啶的制备(6b)

[0077] 用合成化合物6a的方法，和化合物5b反应生成化合物6b。收率52％；熔点76-78℃。

[0078] MS(ES-)m/z：363.10[M]

[0079] 1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ＝12.19(s，1H，N3-H)，9.81(s，1H，CHO)，7.53-8.02(m，5H，N1-Ph-H)，6.96-7.22(m，5H，C6-Ph-H)，5.12(m，2H，NCH2O)，4.33(m，2H，OCH2Ph).[0080] 13C-NMR(400Mhz，DMSO-d6)δ＝189.46，187.36，162.67，.156.46，150.62，137.10，
134.92，129.35，127.97110.24，73.55，70.65.

[0081] 1-苄氧甲基-5-甲酰基-6-(3’-5’-二氟)-苯甲酰基尿嘧啶(6c)

[0082] 用合成化合物6a的方法，和化合物5c反应得到白色固体化合物6c。收率53％；熔点74-76℃；

[0083] 1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ＝10.01(s，1H，N3-H)，9.70(s，1H，CHO)，6.96-7.35(m，8H，Ph-H)，5.01(m，2H，NCH2O)，4.33(m，2H，OCH2Ph).

[0084] 13C-NMR(400Mhz，DMSO-d6)δ＝186.24，161.06，151.99，149.77，146.75.127.94，127.41，128.33，112.03，56.36，54.44.

[0085] 实施例7

[0086] 1-苄氧甲基-5-羧基-6-(3’-5’-二甲基)-苯甲酰基尿嘧啶(7a)的制备

[0087] 将化合物6a(100mg，0.26mmol)溶解于15ml混合溶剂(THF∶CH3CN∶H2O＝2∶2∶1)中，加入磷酸二氢钠80mg、次氯酸钠50mg，和一滴30％的双氧水。室温下搅拌，反应体系变成黄绿色。2小时后TLC检测停止反应。碳酸氢钠调节PH为弱碱性，用乙酸乙酯(15×2)萃取。将分离得到的水层用3NHCl调节PH为4，再用乙酸乙酯(15×3)萃取，合并有机层，用无水硫酸钠干燥。蒸除溶剂，得到白色固体产物7a。收率83％；熔点108-110℃；MS(ES-)m/z：407.29[M][0088] 1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ＝10.79(s，1H，N3-H)，6.967.35(m，8H，Ph-H)，4.94(m，2H，NCH2O)，4.64(m，2H，OCH2Ph)，2.43(s，6H，CH3)；

[0089] 13C-NMR(400Mhz，DMSO-d6)δ＝172.34，161.36，157.84，153.80，138.21，135.56，71.01，70.42，21.13.

[0090] 1-苄氧甲基-5-羧基-6-苯甲酰基尿嘧啶(7b)的制备

[0091] 用合成化合物7a的方法，和化合物6b反应得到白色固体化合物7b。收率75％；熔点95-97℃；

[0092] MS(ES-)m/z：363.26[M]

[0093] 1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ＝10.81(s，1H，N3-H)，6.96-7.30(m，8H，Ph-H)，5.14(m，2H，NCH2O)，4.64(m，2H，OCH2Ph)；

[0094] 13C-NMR(400Mhz，DMSO-d6)δ＝172.02，161.36，157.84，138.21，135.56，130.22，129.27，128.52，127.92，68.83，66.53.

[0095] 实施例8

[0096] 1-苄氧甲基-5-羟甲基-6-(3’-5’-二甲基)-苯甲酰基尿嘧啶(9a)的制备

[0097] 将5-羟甲基-6-(3’-5’-二甲基)-苯甲酰基尿嘧啶200mg投入乙腈15ml中，不溶解，之后加入300g的BSA之后化合物溶液变澄清，室温搅拌半小时后，加入氯甲基苄基醚114mg，并且加入碘化铯150mg。室温搅拌反应3h后停止反应。向反应体系加入饱和碳酸氢钠溶液20ml后，用乙酸乙酯(30ml×3)萃取。乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥。柱层析(石油醚/乙酸乙酯)分离纯化。得到白色固体产物6a。收率51％；熔点81-83℃；MS(ES-)m/z：393.18[M][0098] 1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ＝10.00(s.1H，N3-H)，7.25-7.51(m，5H，N1-Ph-H)，
6.96-7.20(m，3H，C6-Ph-H)5.35(m，2H，NCH2O)，4.32(m，2H，OCH2Ph)4.22(dd，2H，CH2OH)，
2.29(s，6H，CH3Ph)；

[0099] 13C-NMR(400Mhz，DMSO-d6)δ＝188.61，151.37，148.35，139.06，137.26，128.18，127.41，113.20，73.20，70.90，55.34，21.09.

[0100] 1-苄氧甲基-5-羟甲基-6-苯甲酰基尿嘧啶(9b)的制备

[0101] 用合成化合物9a的合成方法，和化合物4b反应生成化合物9b。收率49.2％；熔点157-159℃；

[0102] MS(ES-)m/z：365.19[M]

[0103] 1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ＝11.61(s，1H，N3-H)，7.69-7.89(m，5H，N1-Ph-H)，6.99-7.25(m，5H，C6-Ph-H)5.46(m，2H，NCH2O)，4.83(dd，2H，OCH2Ph)，4.26(dd，2H，CH2OH)；

[0104] 13C-NMR(400Mhz，DMSO-d6)δ＝188.72，160.79，153.46，152.13，140.71，138.13，128.52，126.60，110.67，70.46，67.43.

[0105] 1-苄氧甲基-5-羟甲基-6-(3’-5’-二氟)-苯甲酰基尿嘧啶(9c)的制备

[0106] 用合成化合物9a的方法，和化合物4c反应生成白色固体化合物9c。收率47％；熔点79-81℃；

[0107] 1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ＝11.67(s，1H，N3-H)，8.26(s，1H，CH2OH)，6.99-7.13(m，2H，C6-Ph-H)，7124-7.24(m，5H，N1-Ph-H)，5.01(m，2H，NCH2O)，4.85(dd，2H，OCH2Ph)，4.26(dd，2H，CH2OH).

[0108] 13C-NMR(400Mhz，DMSO-d6)δ＝161.51，159.83，152.94，150.68，145.51，137.84，127.29，110.67，70.60，68.39.

[0109] 实施例9对所合成的化合物进行HIV-1逆转录酶的生物活性评价

[0110] 一.实验原理

[0111] 1.逆转录酶：逆转录酶是以单链DNA为模版，合成双链DNA聚合酶。是多功能酶，拥有分别以RNA和DNA为模版合成聚合酶及核糖核酸酶H活性。

[0112] 2.核苷酸微孔板共价键交联：核酸分子杂家按作用环境氛围固相杂交和液相杂交两种类型。固相杂交是将参加反应的一条核酸固定在固相支持物上，另一条核酸反应链游离在溶液中。本实验将作为引物的oligo(dT)15的5’端磷酸化后与NUNC公司的96孔氨基板的表面发生共价交联，从而使反应在固相支持物上进行。

[0113] 3.反应原理：以olig(ddT)为引物，polyA(mRNA3’端聚腺苷酸)为模板，dTTP和生物素标记的dUTP为底物，在逆转录酶的作用下，掺入合成DNA。生物素标记的dUTP和碱性磷脂酶(ALP)标记的链亲和素(SA)特异性结合，而与链亲和素共轭的碱性磷脂酶与PNPP能发生显色反应，在405nm可根据吸光度的 大小，判定逆转录酶的反应活性。

[0114] 二.实验方法

[0115] 1.将Oligo(dT)15溶于100mM的1-甲基-咪唑的盐酸缓冲(pH＝7.4)，加入96孔酶标板中，与水溶性碳化二亚胺混均，于50℃水浴中反应4小时，反应结束后用洗液(50mmol/Tris-HCl，pH＝7.5)洗三遍，除去为结合的Oliga(dT)15，将包被后的96孔板置4℃保存。

[0116] 2.HIV-1RT活性测试

[0117] 反应系统总体积为100ul，含50mmol/lTris-HCl，pH＝8.3，3mmol/LMgCl2.75mmol/LKCl，5mmol/LDTT，0.13Mg/ml BSA(小牛血清白蛋白)，10ug/m lpoly(A)，0.75uMbiotin-dUTP，1.5uMdTTP及适量酶，37℃水浴1小时，用洗液(50mmol/l Tris-HCl，pH＝7.5，0.15mol/lNaCl，0.05mmol/lMgCl2，0.02％tween20)洗三次，除去未结合的游离底物；没孔加入100ul 1％BSA，室温封闭30min，住址生物素与链亲和索蛋白的非特异性结合，洗板；没孔加入50ul的SA-ALP稀释液(100ng/ml)，37水浴1小时，洗板；每孔加入50ulPNPP(1mg/ml，pH＝9.5)，37℃水浴30min；每孔加入0.5mol/l的NaOH终止反应，酶标仪测定405nm波长处A值，以确定HIV-RT的活性；同时设置不加酶的阴性对照，计算实验孔/阴性孔A值.[0118] 三.实验结果(见表1)

[0119]化合物编号 R1 R IC50(μM)
6a CHO CH3 4.57
6b CHO H 7.88
6c CHO F 1.15
NVP(奈韦拉平) -- -- 3.20

[0120] 实施例10对所合成的化合物进行HIV-1整合酶的生物活性评价

[0121] 一.实验原理

[0122] 供体底物带有一个5’P的突出端，这样可以使底物的一端与酶标板相连，充分暴露出整合酶的作用位点CAGT-3’，经过酶蛋白的3’加工暴露出5’端CA羟基末端后，整合酶继续进行使链转移活性，将3’端标记biotin的靶底物连到板上，用avidin标记的碱性磷酸酶系统检测反应底物。

[0123] 二.实验方法：