一种槐耳多糖蛋白及其制备方法和用途

摘要

本发明涉及一种槐耳多糖蛋白及其制备方法和用途，本发明的槐耳多糖蛋白的单糖组成为阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖及甘露糖，其质量比为7.4:4.5:2.7:9.4:1.9，该多糖蛋白的重均分子量为7.0×105-2.0×106Da，优选为1.86×106Da。本发明的多糖蛋白可以用于制备治疗肿瘤的药物。

权利要求

1.一种槐耳多糖蛋白，该多糖蛋白的单糖组成为阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖及甘露糖，其质量比为7.4:4.5:2.7:9.4:1.9。

2.根据权利要求1所述的多糖蛋白，其特征在于，所述多糖蛋白的重均分子量为7.0×

105-2.0×106Da。

3.根据权利要求2所述的多糖蛋白，其特征在于，所述多糖蛋白的重均分子量为1.86×

106Da。

4.根据权利要求1或2所述的多糖蛋白，其特征在于，该多糖蛋白的制备方法包括如下步骤：(1)将质量浓度为2％-20％的槐耳菌质提取物水溶液采用Sevage法去除游离蛋白，收集糖类部分；

(2)将步骤(1)得到的糖类部分加入无水乙醇中，使其形成醇体积浓度为30％-80％的糖溶液，离心，得到沉淀物；

(3)将步骤(2)得到的沉淀物加水溶解，过滤，浓缩、透析收集袋内部分；以及(4)使用离子交换柱色谱对步骤(3)收集到的袋内部分进行分离，其中使用的洗脱液为水、0.4Mol/L-0.8Mol/L的NaCl水溶液。

5.根据权利要求4所述的多糖蛋白，其特征在于，在步骤(1)中，所述槐耳菌质提取物水溶液的质量浓度为8％。

6.根据权利要求4所述的多糖蛋白，其特征在于，在步骤(2)中，所述糖溶液的醇体积浓度为30％-50％。

7.根据权利要求4所述的多糖蛋白，其特征在于，在步骤(2)中，所述糖溶液的醇体积浓度为40％。

8.根据权利要求4所述的多糖蛋白，其特征在于，在步骤(4)中，所述洗脱液为0.5Mol/L的NaCl水溶液。

9.根据权利要求4所述的多糖蛋白，其特征在于，所述多糖蛋白的制备方法还包括对NaCl溶液洗脱得到的产品进行透析除盐的步骤。

10.根据权利要求9所述的多糖蛋白，其特征在于，所述多糖蛋白的制备方法还包括采用Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱对透析除盐后的产品进行分离纯化的步骤。

11.一种权利要求1至10中任一项所述的多糖蛋白的制备方法，该制备方法包括如下步骤：(1)将质量浓度为2％-20％的槐耳菌质提取物水溶液采用Sevage法去除游离蛋白，收集糖类部分；

(2)将步骤(1)得到的糖类部分加入无水乙醇中，使其形成醇体积浓度为30％-80％的溶液，离心，得到沉淀物；

(3)将步骤(2)得到的沉淀物加水溶解，过滤，浓缩、透析收集袋内部分；以及(4)使用离子交换柱色谱对步骤(3)收集到的袋内部分进行分离，其中使用的洗脱液为水、0.4Mol/L-0.8Mol/L的NaCl水溶液，即得。

12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述槐耳菌质提取物水溶液的质量浓度为8％。

13.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述糖溶液的醇体积浓度为30％-50％。

14.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述糖溶液的醇体积浓度为40％。

15.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述洗脱液为

0.5Mol/L的NaCl水溶液。

16.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括对NaCl溶液洗脱得到的产品进行透析除盐的步骤。

17.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括采用Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱对透析除盐后的产品进行分离纯化的步骤。

18.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：(1)准确称取槐耳菌质提取物槐耳清膏300g,加入适量蒸馏水将其稀释为质量浓度为

8％的稀溶液，之后采用Sevage法去游离蛋白，重复操作5次，收集糖类部分；

(2)向步骤(1)得到的槐耳菌质糖类部分中缓缓加入无水乙醇使其成为醇体积浓度为

40％的糖溶液，4℃静置24小时后，以3000转/分钟的速度离心10分钟，沉淀，得到沉淀物；

(3)称取适量步骤(2)得到的沉淀物，将其溶解于150ml蒸馏水中，过滤，减压浓缩至体积50ml；透析收集袋内部分,以及(4)使用DEAE-52离子交换柱色谱对步骤(3)收集到的袋内部分进行分离，采用0.5Mol/L的NaCl水溶液进行洗脱，洗脱部分在浓缩后进行透析除盐，透析过程为对流水透析三天，蒸馏水透析两天；以及(5)采用Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱对步骤(4)得到的产品进行分离纯化，直至高效液相色谱法检测为纯品为止。

19.权利要求1至10中任一项所述的多糖蛋白在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

说明书

一种槐耳多糖蛋白及其制备方法和用途

技术领域

[0001] 本发明涉及一种槐耳多糖蛋白及其制备方法和用途。

背景技术

[0002] 槐耳为多孔菌科真菌槐栓菌（Trametes robiniophila Murr.）的子实体，是一种重要的民间药用真菌，在中国具有1600余年的用药历史。Ainsworth真菌分类系统将其归属于真菌门、担子菌亚门、层菌纲、多孔菌科、栓菌属。槐耳子实体中等至较大，木栓质，无菌柄，生于槐、刺槐等阔叶树的树干上，分布于河北、陕西、辽宁、湖南、广西、福建等地，是一种可以导致树木心材腐朽的木腐菌。本品味苦、辛，性平无毒,有“治风”、“破血”、“益力”的功效，临床上用于治疗多种疾病。由于老龄中国槐日益稀少，槐耳药材资源濒于枯竭，难以满足临床用药需求，更无法满足工业化生产需求。为了解决槐耳的资源问题，启东盖天力药业有限公司经过长期的研究和实践，攻克了槐耳菌丝体大规模发酵难题，实现了菌丝体的工业化生产，并以槐耳菌质（槐耳菌丝体发酵物）提取物为原料开发了槐耳颗粒和槐杞黄颗粒等药品，满足了临床用药需求。

[0003] 近年来大量的化学成分及药理活性研究资料证实槐耳菌质提取物的有效成分为槐耳多糖蛋白，其主要功效是治疗或辅助治疗肿瘤性疾病。然而，目前对于槐耳多糖蛋白的组成、结构及其制备方法研究很少，在化学成分研究方面仅有粗多糖的单糖组成及比例分析的文献报道，缺乏对其均一多糖的分离纯化和结构研究，如均一多糖蛋白所含的糖残基种类、比例、在主链中的排列次序等信息，而这些信息对于阐明槐耳菌质真正的药效成分、槐耳多糖蛋白的作用机制及构效关系等至关重要。同样在槐耳多糖蛋白的生物活性研究方面，多以粗多糖作为研究对象，缺乏应用均一多糖组分获得的体内、体外药理学研究数据，从而无法深入了解槐耳多糖蛋白与人体免疫细胞或肿瘤细胞表面相关多糖受体的作用过程，因而无法深入的阐明其作用原理。

发明内容

[0004] 为了克服现有技术的缺陷，本发明提供一种槐耳多糖蛋白及其制备方法和用途。

[0005] 本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的。

[0006] 一方面，本发明提供一种槐耳多糖蛋白，该多糖蛋白的单糖组成为阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖及甘露糖，其质量比为7.4：4.5：2.7：9.4：1.9。

[0007] 优选地，所述多糖蛋白的重均分子量为7.0×105-2.0×106Da，优选为1.86×6
10Da。

[0008] 优选地，该多糖蛋白的制备方法包括如下步骤：

[0009] （1）将浓度为2%-20%（质量/体积），优选为8%（质量/体积）的槐耳菌质提取物（例如槐耳清膏）水溶液采用Sevage法去除游离蛋白，收集糖类部分；

[0010] （2）将步骤（1）得到的糖类部分加入无水乙醇中，使其形成醇浓度为30%-80%（体积），优选30%-50%（体积），最优选为40%（体积）的糖溶液，离心，得到沉淀物；

[0011] （3）将步骤（2）得到的沉淀物加水溶解，过滤，浓缩、透析收集袋内部分；以及[0012] （4）使用离子交换柱色谱对步骤（3）收集到的袋内部分进行分离，其中使用的洗脱液为水、0.4Mol/L-0.8Mol/L NaCl水溶液，优选为0.5Mol/L的NaCl水溶液

[0013] 优选地，所述多糖蛋白的制备方法还包括对NaCl溶液洗脱得到的产品进行透析除盐的步骤。

[0014] 优选地，所述多糖蛋白的制备方法还包括采用Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱对透析除盐后的产品进行分离纯化的步骤。

[0015] 另一方面，本发明提供一种上述多糖蛋白的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

[0016] （1）将浓度为2%-20%（质量/体积），优选为8%（质量/体积）的槐耳菌质提取物（例如槐耳清膏）水溶液采用Sevage法去除游离蛋白，收集糖类部分；

[0017] （2）将步骤（1）得到的糖类部分加入无水乙醇中，使其形成醇浓度为30%-80%（体积），优选30%-50%（体积），最优选为40%（体积）的糖溶液，离心，得到沉淀物；

[0018] （3）将步骤（2）得到的沉淀物加水溶解，过滤，浓缩、透析收集袋内部分；以及[0019] （4）使用离子交换柱色谱对步骤（3）收集到的袋内部分进行分离，其中使用的洗脱液为水、0.4Mol/L-0.8Mol/LNaCl水溶液，优选为0.5Mol/L的NaCl水溶液，即得。

[0020] 优选地，所述制备方法还包括对NaCl溶液洗脱得到的产品进行透析除盐的步骤。

[0021] 优选地，所述制备方法还包括采用Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱对透析除盐后的产品进行分离纯化的步骤。

[0022] 在一个具体实施方案中，所述制备方法包括如下步骤：

[0023] （1）准确称取槐耳菌质提取物槐耳清膏300g,加入适量蒸馏水将其稀释为浓度约为8%（质量/体积）的稀溶液，之后采用Sevage法去游离蛋白，重复操作5次，收集糖类部分；

[0024] （2）向步骤（1）得到的槐耳菌质糖类部分中缓缓加入无水乙醇使其成为醇浓度为40%（体积）的糖溶液，4℃静置24小时后，以3000转/分钟的速度离心10分钟，沉淀，得到沉淀物；

[0025] （3）称取适量步骤（2）得到的沉淀物，将其溶解于150ml蒸馏水中，过滤，减压浓缩至体积50ml；透析收集袋内部分,以及

[0026] （4）使用DEAE-52离子交换柱色谱对步骤（3）收集到的袋内部分进行分离,采用0.5Mol/L NaCl溶液进行洗脱，洗脱部分在浓缩后进行透析除盐，透析过程为对流水透析三天，蒸馏水透析两天；以及

[0027] （5）采用Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱对步骤（4）得到的产品进行分离纯化，直至高效液相色谱法检测为纯品为止。

[0028] 又一方面，本发明提供上述多糖蛋白在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

[0029] 与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

[0030] 本发明首次采用系统的水提取、醇沉淀、去蛋白、透析小分子、离子交换色谱及凝胶分子量排阻色谱分离的手段从槐耳菌质中分离获得了一个均一的多糖蛋白组分，并综合应用分子量分析、单糖组成及氨基酸组成分析、红外光谱分析及甲基化分析等手段，对其进行了化学结构特点的确认，明确了其重均分子量、单糖组成及比例、氨基酸组成及比例，以及所含糖残基的连接方式。这样一个结构特点明晰、分子量均一的槐耳菌质多糖组分，是研究槐耳多糖有效成分及其生物活性的理想分子模型，为阐明槐耳多糖的免疫调节及抗肿瘤的有效成分及其作用机制奠定了基础，本发明将为槐耳菌质进一步开发利用和相关制剂的质量控制提供科学依据。

附图说明

[0031] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

[0032] 图1为槐耳菌质提取物槐耳清膏分级醇沉淀流程图；

[0033] 图2为槐耳菌质提取物槐耳清膏40%乙醇沉淀部位TCP-40柱色谱纯化流程图；

[0034] 图3为槐耳多糖蛋白TP-2分子量（Mw）测定标准曲线；

[0035] 图4为槐耳多糖蛋白TP-2单糖组分分析中对照品溶液的离子色谱图；

[0036] 图5为槐耳多糖蛋白TP-2的超高效液相-凝胶色谱（UPLC-GPC）图谱；

[0037] 图6为槐耳多糖蛋白TP-2单糖组成分析离子色谱图；

[0038] 图7为3H-TdR掺入法检测小鼠脾细胞增殖，其中，TCP：粗多糖；TP-1：槐耳多糖蛋白-1；TP-2：槐耳多糖蛋白-2；TP-3：槐耳多糖蛋白-3；TP-4：槐耳多糖蛋白-4；To-1：槐耳低分子量组分-1；To-2：槐耳低分子量组分-2；To-3：槐耳低分子量组分-3；To-4：槐耳低分子量组分-4；TFP：槐耳粗总游离蛋白部分；

[0039] 图8为3H-TdR掺入法检测小鼠T、B淋巴细胞增殖，其中，图A为CD19+细胞；图B为CD3+细胞；图C为小鼠T淋巴细胞；图D为小鼠B淋巴细胞；Dex：葡聚糖；TCP：粗多糖；TP-1：槐耳多糖蛋白-1；TP-2：槐耳多糖蛋白-2；TP-3：槐耳多糖蛋白-3；TP-4：槐耳多糖蛋白-4；LPS：脂多糖；

[0040] 图9为槐耳多糖刺激后小鼠及人T、B淋巴细胞比例变化，其中，图A为小鼠T淋巴细胞；图B为小鼠B淋巴细胞；图C为人类T淋巴细胞；图D为人类B淋巴细胞；Dex：葡聚糖（Dextran）；TCP：粗多糖；TP-1：槐耳多糖蛋白-1；TP-2：槐耳多糖蛋白-2；TP-3：槐耳多糖蛋白-3；TP-4：槐耳多糖蛋白-4；LPS：脂多糖；

[0041] 图10为槐耳多糖刺激后T、B淋巴细胞表面CD69的表达，图A为槐耳多糖刺激后T淋巴细胞表面CD69的表达，图B为槐耳多糖刺激后B淋巴细胞表面CD69的表达，其中Dex：葡聚糖（Dextran）；TCP：粗多糖；TP-1：槐耳多糖蛋白-1；TP-2：槐耳多糖蛋白-2；TP-3：槐耳多糖蛋白-3；TP-4：槐耳多糖蛋白-4；LPS：脂多糖；

[0042] 图11为槐耳多糖刺激后小鼠腹腔巨噬细胞NO释放变化，其中Dex：葡聚糖（Dextran）；TCP：粗多糖；TP-1：槐耳多糖蛋白-1；TP-2：槐耳多糖蛋白-2；TP-3：槐耳多糖蛋白-3；TP-4：槐耳多糖蛋白-4；To-1：槐耳低分子量组分-1；To-2：槐耳低分子量组分-2；To-3：槐耳低分子量组分-3；To-4：槐耳低分子量组分-4；TFP：槐耳粗总游离蛋白部分；LPS：脂多糖；

[0043] 图12槐耳多糖蛋白对肿瘤血管形成内皮细胞增值的抑制作用，其中TP-2：槐耳多糖蛋白-2。

具体实施方式

[0044] 下面通过实施例详细说明本发明，应当理解，下述实施例仅用于说明本发明，而不以任何方式限制本发明的范围。

[0045] 实施例1：槐耳多糖蛋白（TP-2）的分离纯化方法

[0046] 准确称取槐耳菌质提取物槐耳清膏（由启东盖天力药业有限公司提供）300g,加入适量蒸馏水将其稀释为浓度约为8%（质量/体积）的稀溶液，之后采用Sevage法去游离蛋白，重复操作5次，分别收集糖类部分（TCP）及槐耳粗总游离蛋白部分（TFP），槐耳粗总游离蛋白部分真空干燥备用，槐耳菌质糖类物质部分（TCP）在减压浓缩去除残存的氯仿及正丁醇后，进行分级醇沉淀。首先向TCP中缓缓加入无水乙醇使其成为醇体积浓度为40%（体积）的糖溶液，4℃静置24小时后，3000转/分钟离心10分钟，沉淀编号为TCP-40，减压干燥以备进一步分离纯化，之后向上清液中继续加入适量无水乙醇使其成为含醇60%（体积）的糖溶液，4℃静置24小时后，3000转/分钟离心10分钟，沉淀编号为TCP-60，减压干燥以备进一步分离纯化，在此之后继续向上清液中加入适量无水乙醇至乙醇浓度达到80%（体积），4℃静置24小时后，3000转/分钟离心10分钟，沉淀编号为TCP-80，减压干燥以备进一步分离纯化，具体分级醇沉淀流程图见图1。

[0047] 称取适量的槐耳清膏40％（体积）乙醇沉淀部位TCP-40，将其溶解于150ml蒸馏水中，过滤，减压浓缩至体积50ml,透析收集袋内部分及袋外部分，袋外部分为槐耳低分子量组分-1（TO-1），袋内部分通过DEAE-52离子交换柱色谱分离，分别采用蒸馏水及0.1M NaCl溶液、0.5M NaCl洗脱，每个部位收集3.0L，水洗脱部分直接浓缩至干，氯化钠洗脱部分均在浓缩后进行透析除盐，透析过程为对流水透析三天，蒸馏水透析两天。然后各段分别采用Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱进行分离纯化，直至高效液相色谱法检测为纯品为止，经过上述柱色谱分离过程，分别从TCP-40离子交换柱色谱0.1Mol/L NaCl洗脱部位纯化获得了UPLC（超高效液相色谱）验证为均一组分的多糖蛋白TP-1（397mg）以及从0.5Mol/L NaCl洗脱部位获得了均一多糖蛋白TP-2（1212mg）,分离流程图见图2。

[0048] 称取适量的槐耳清膏60％（体积）乙醇沉淀部位TCP-60，将其溶解于150ml蒸馏水中，过滤，经减压浓缩至体积50ml，透析收集袋内部分及袋外部分，袋外部分为槐耳低分子量组分-2（TO-2），袋内部分通过DEAE-52离子交换柱色谱分离，分别采用蒸馏水及1.0Mol/LNaCl溶液洗脱，每个部位收集3.0L，水洗脱部分直接浓缩至干，氯化钠洗脱部分均在浓缩后进行透析除盐，透析过程为对流水透析三天，蒸馏水透析两天。然后各段分别采用Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱进行分离纯化，直至高效液相色谱法检测为纯品为止，经过上述柱色谱分离过程，分别从TCP-60离子交换柱色谱1.0Mol/L NaCl洗脱部位纯化获得了UPLC（超高效液相色谱）验证为均一组分的多糖蛋白TP-3（12.1g）。

[0049] 称取适量的槐耳清膏80％（体积）乙醇沉淀部位TCP-80，将其溶解于150ml蒸馏水中，过滤，减压浓缩至体积50ml，透析收集袋内部分及袋外部分，袋外部分为槐耳低分子量组分-3（TO-3），袋内部分通过DEAE-52离子交换柱色谱分离，分别采用蒸馏水及1.0Mol/L NaCl水洗脱，每个部位收集3.0L，水洗脱部分直接浓缩至干，氯化钠洗脱部分均在浓缩后进行透析除盐，透析过程为对流水透析三天，蒸馏水透析两天。然后各段分别采用Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱进行分离纯化，直至高效液相色谱法检测为纯品为止，经过上述柱色谱分离过程，分别从TCP-80离子交换柱色谱1.0Mol/LNaCl洗脱部位纯化获得了UPLC（超高效液相色谱）验证为均一组分的多糖蛋白TP-4（10.0g），收集槐耳清膏80％（体积）乙醇沉淀上清液部分得槐耳低分子量组分-4（TO-4）（图2）。

[0050] 实施例2：槐耳多糖蛋白（TP-2）化学结构的研究

[0051] 本实施例研究了实施例1制备的槐耳多糖蛋白TP-2的化学结构。

[0052] 一、槐耳多糖蛋白（TP-2）化学结构研究方法

[0053] 1、纯度及分子量的测定

[0054] 超高效液相-凝胶色谱-蒸发光散射检测器（UPLC-GPC-ELSD）仪器配置及色谱条件：美国Waters UPLC，TSK-3000GPC色谱柱，自动进样器，Millipore超纯水离子交换器制备高纯水（0.45μm醋酸纤维素膜过滤）；流速0.3ml/min。

[0055] 标准曲线的制备：分别称取适量的右旋糖苷标准品，加入去离子水，将其配置成浓度0.5mg/ml的对照品溶液，之后逐一进行UPLC检测，结果见图3。

[0056] 样品溶液制备：分别称取一定量的实施例1制备的多糖蛋白TP-2，加入适量去离子水，将其配制成浓度为1mg/ml的溶液，Millipore0.22μm水系滤膜过滤，进样检测。

[0057] 2、单糖组成分析

[0058] 完全酸水解：精密称取实施例1制备的多糖蛋白TP-2(10mg)放入厚壁耐压瓶中，加入4ml的2Mol/L三氟乙酸（TFA），充氮气，封管后，100℃水解2小时，减压蒸干。

[0059] 样品的离子色谱分析

[0060] 仪器配置及色谱条件：Dionex ICS3000型离子色谱，CarboPac PA20分析柱，150×3mm，S/N002823，CarboPac PA20保护柱，50*3mm，S/N002652，淋洗液组成及流速1-25min，1m Mol/L KOH；25.1-32min，30m Mol/L KOH,；32.1-35min，1m Mol/L KOH；0.45mL/min，进样10μL。

[0061] 对照品溶液的制备：取阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖对照品适量，用去离子水溶解成各含10.0mg/L的对照品溶液，摇匀，即得。

[0062] 标准曲线制备：精密吸取对照品混合贮备液适量，分别用去离子水将其稀释成0.5mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L的标准溶液，0.45μm微孔滤膜过滤后，依次进行离子色谱测定，离子色谱条件为：Dionex ICS3000型离子色谱，CarboPac PA20分析柱，150×
3mm，S/N002823，CarboPac PA20保护柱，50*3mm，S/N002652，淋洗液组成及流速1-25min，1m Mol/L KOH；25.1-32min，30m Mol/L KOH,；32.1-35min，1m Mol/L KOH；0.45mL/min，进样10μL。以峰面积积分值为纵坐标（Y）、以各标准品浓度为横坐标（X），绘制各对照品标准曲线并计算回归方程，结果见表1和图4。

[0063] 表1线性关系考察结果

[0064]

[0065] 供试品溶液制备：将实施例1制备的多糖蛋白TP-2完全酸水解产物复溶于50ml去离子水，超声10分钟使溶解，取溶液适量，过孔径0.22μm水系滤膜及DIONEX RPⅡ固相萃取小柱。

[0066] 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入离子色谱仪，即得。

[0067] 3、甲基化分析

[0068] 多糖蛋白完全甲基化：称取适量实施例1制备的多糖蛋白TP-2于反应瓶中，放入真空干燥箱中干燥5h（50℃），加入经过分子筛处理过的DMSO 2ml，超声振荡5分钟，待样品完全溶解后，加入研磨成粉状NaOH20mg，同时用氮气赶尽瓶中空气，室温下超声10分钟，静置90分钟，待反应瓶中的DMSO完全冰冻后，逐滴加入0.1ml碘甲烷（此过程大约需要15～20分钟），同时反应物会慢慢解冻，并逐渐澄清，直至成为亮黄色。然后超声10分钟，静置30分钟。
室温减压蒸馏，去尽过量的碘甲烷，用水透析一天，减压蒸至2ml左右。冷冻干燥后再于干燥器中干燥5小时，重复上述操作2次后，取少量样品进行红外检测，如果红外光谱中原
3300cm-1处强而宽的羟基峰消失，而2900cm-1处甲基峰显著增强，表明样品的全甲基化反应已经完成。

[0069] 部分甲基化阿尔迪醇乙酰酯制备：将已经完全甲基化的样品溶于3mL90%（体积）的甲酸溶液中，封管，100℃下解聚6h，向反应瓶中加入2～3mL甲醇，40℃下减压浓缩蒸干，重复以上操作三次以除尽过量甲酸，然后向解聚后的样品中加入2Mol/LTFA溶液4mL，密封后于110℃下水解2h，反应瓶中的溶液于40℃下减压蒸干，再加入2～3mL甲醇，蒸干，重复以上操作多次以除尽过量的TFA。水解后的样品用3～4mL蒸馏水溶解后，加入约20mg NaBH4于室温下还原3h，然后用冰醋酸调pH值到5左右，加入1～2mL甲醇及一滴冰醋酸后，再减压蒸干，重复上述操作多次以除尽过量的乙酸。经上述处理的样品置于P2O5真空干燥器中减压干燥一天，再于110℃干燥10～15min后，加入3mL醋酐，110℃反应1h，向反应液中加入2mL甲苯，振荡后40℃下减压蒸去未反应的醋酐，如此重复多次以除尽醋酐。然后将乙酰化后的样品溶于氯仿中，再加入等体积的蒸馏水洗涤氯仿层3次，除尽水层，氯仿层加入无水硫酸钠干燥10min，过滤，将氯仿溶液室温减压浓缩至0.1mL左右后，进行气质联用分析（GC-MS）。气质的条件为：起始温度50℃，升温程序为40℃/min，至215℃，保持40min，检测器温度250℃,DB-5毛细管GC-MS色谱柱检测。

[0070] 4、氨基酸分析：

[0071] 称取适量实施例1制备的多糖蛋白TP-2放入试管中，加入4ml的6Mol/L HCl在100℃下水解6小时，蒸去HCl，离心，过滤，滤液用氨基酸分析仪进行分析。

[0072] 5、IR光谱分析：

[0073] 称取1mg实施例1制备的多糖蛋白TP-2，真空干燥过夜，次日用溴化钾压片法进行IR检测。

[0074] 二、槐耳多糖蛋白（TP-2）化学结构研究结果

[0075] 根据第一部分的研究方法对实施例1制备的槐耳多糖蛋白（TP-2）的化学结构进行了研究，研究结果如下：

[0076] 1、纯度及分子量

[0077] TP-2为深褐色粉末状物质，易溶于水、DMSO，不溶于高浓度的甲醇、乙醇等有机溶剂，该多糖蛋白的UPLC-GPC-ESLD图谱呈现一个对称的窄的色谱峰，提示其为一个纯的多糖蛋白物质与分子量标准品对比，该多糖蛋白的分子量为1.86×106Da（图5）,Lowry反应呈阳性，紫外扫描280nm处有弱的吸收，表明该物质含有蛋白。

[0078] 2、单糖组成分析

[0079] TP-2完全酸水解之后，水解产物一部分直接进行了离子色谱分析，与标准单糖对照，分析结果表明该多糖由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖及甘露糖组成，在检测过程中没有发现与糖醛酸及氮乙酰氨基糖相关的色谱峰显示出来，提示其为一中性多糖（表2，图6）。

[0080] 表2槐耳多糖蛋白TP-2单糖组成及质量比例离子色谱分析结果

[0081]

[0082] 通过单糖组成分析可以看出，槐耳多糖蛋白TP-2含有5种单糖，其中以阿拉伯糖、木糖的含量最高，其次为葡萄糖、半乳糖，甘露糖含量较少。

[0083] 3、甲基化分析

[0084] 为了确认TP-2中的糖残基连接方式，采用Needs法对TP-2进行了甲基化，在三次甲基化之后，将其用90%的甲酸解聚，以2Mol/L TFA完全酸水解，NaBH4还原和醋酐乙酰化制备成阿尔迪醇乙酸酯衍生物，进行GC-MS分析，结果见表3。

[0085] 表3TP-2甲基化分析结果

[0086]

[0087]

[0088] 甲基化分析表明，槐耳多糖蛋白-2的结构非常复杂。含有14种不同连接的糖残基，分别为：其中阿拉伯糖以1位，1,5位羟基与其它糖残基形成糖苷键形成连接，木糖以1位，1,3位羟基与其它糖残基形成糖苷键形成连接，甘露糖以1位，1,6-位和1,3,6位羟基与其它糖残基形成糖苷键形成连接，葡萄糖以1位，1,3位，1,4位和1,6位羟基与其它糖残基形成糖苷键形成连接，半乳糖以1位，1,3位，1,3,6位羟基与其它糖残基形成糖苷键形成连接。注：上述结果中五碳糖与六碳糖残基所占比例与单糖组成分析存在差别，这与反应过程中不同糖残基损失程度不同有关（表3）。

[0089] 为了进一步确认TP-2链结构，对其进行了部分酸水解（0.3Mol/L TFA，8小时），将水解产物进行了透析，冷冻干燥之后，获得了TP-2的降解产物，命名为TP-2-in,同TP-2一样，对TP-2-in进行了单糖组成分析及甲基化分析，结果如表4。

[0090] 表4TP-2-in甲基化分析结果

[0091]

[0092] 单糖组成分析发现，TP-2-in由甘露糖：葡萄糖：半乳糖按照4.1：4.3：1.6的比例组成，说明TP-2中所含的木糖、阿拉伯糖均分布于支链之中，TP-2的主链由三种六碳糖构成，甲基化分析发现，TP-2-in主要由五种糖残基构成，分别为非还原末端连接甘露糖、非还原末端连接葡萄糖、1,4位连接葡萄糖、1,6位连接甘露糖、1,3,6位连接半乳糖，对比原型多糖TP-2,TP-2-in中1,3,6连接的甘露糖残基消失，1,6连接的甘露糖残基比例上升，说明TP-2的主链通过1,3,6连接的甘露糖残基的O-3位置形成分支，而非O-6位置，另外TP-2中原有的1,3连接半乳糖残基消失，未有新的1,3半乳糖残基产生，说明TP-2中的1,3,6连接的半乳糖残基可能通过O-3位置形成分支，而非O-6位置形成分支，另外1,3,6连接的半乳糖残基比例的上升说明该位点位于不易被水解的位置。

[0093] 综合分析TP-2及TP-2-in的甲基化分析结果可以发现，槐耳多糖蛋白TP-2的主链由1,4连接葡萄糖残基、1,6连接甘露糖残基、1,3,6连接甘露糖残基，1,3,6连接半乳糖残基组成，并且通过1,3,6连接甘露糖残基以及1,3,6连接半乳糖残基的O-3位置形成分支，支链则由多种五碳糖和六碳糖残基共同构成。

[0094] 由于甲基化反应重复四次，反应过程不同糖残基损失程度不同，造成糖残基比例与离子色谱检测所得单糖组成比例存在一定差异。

[0095] 4、氨基酸分析：

[0096] 为了分析槐耳多糖蛋白TP-2中的氨基酸组成及比例，采用盐酸水解结合日立自动氨基酸分析仪，对其进行了氨基酸组成及比例分析结果见表5。

[0097] 表5槐耳多糖蛋白TP-2氨基酸组成分析结果

[0098]

[0099]

[0100] 5、IR光谱分析：

[0101] TP-2的红外光谱在1735cm-1处无吸收，提示TP-2不含糖醛酸。

[0102] 实施例3槐耳清膏及所含化学成分体内免疫活性研究

[0103] 1、样品来源

[0104] 槐耳清膏由启东盖天力药业有限公司提供。粗多糖TCP，均一多糖TP-1、TP-2、TP-3、TP-4，低分子量组分TO-1、TO-2、TO-3、TO-4由实施例1制备。

[0105] 2、促进小鼠脾细胞增殖

[0106] 1）检测槐耳多糖是否能刺激小鼠脾细胞增殖

[0107] 方法：槐耳清膏各组分（粗多糖TCP；槐耳多糖TP-1、TP-2、TP-3、TP-4；低分子量组分TO-1、TO-2、TO-3、TO-4；槐耳粗总游离蛋白部分TFP）及阴性对照药品葡聚糖（Dextran）与小鼠脾细胞共培养，42h后，掺入3H-TdR，48h后采用细胞收集器Filtermate harvester检测其增殖指数。结果如图7。

[0108] 结论：从3H-TdR结果看，由槐耳清膏中提取的多糖成分（包括粗多糖TCP，多糖组分TP-1，TP-2，TP-3，TP-4）均能刺激小鼠脾细胞增殖；低分子量组分除TO-3外均不能刺激脾细胞增殖。

[0109] 2）槐耳多糖能刺激小鼠B细胞增殖，而非T细胞

[0110] 方法：粗多糖TCP、槐耳多糖TP-1、TP-2、TP-3、TP-4与阴性对照品葡聚糖（Dextran）（浓度梯度为100μg/ml，30μg/ml，10μg/ml）、阳性对照脂多糖（LPS）与纯化的T、B淋巴细胞共培养，42h掺入3H-TdR，48h后采用细胞收集器Filtermate harvester检测其增殖指数。结果见图8。

[0111] 结论：磁珠分选获得高纯度的T、B细胞，与槐耳多糖共孵育48h后，3H-TdR结果显示，槐耳多糖组分TP-1、TP-2、TP-3、TP-4、TCP刺激的是B细胞，而非T细胞。且这种刺激作用呈剂量相关性。

[0112] 3）槐耳多糖刺激小鼠脾细胞及人外周血单个核细胞（PBMC）后，T、B细胞比例变化[0113] 方法：粗多糖TCP、槐耳多糖TP-1、TP-2、TP-3、TP-4与葡聚糖（Dextran）（浓度为50μg/ml）、脂多糖（LPS）与小鼠脾细胞及人外周血PBMC共培养，24小时后，流式检测T、B细胞比例。结果见图9。

[0114] 结论：槐耳多糖TP-1、TP-2、TP-3、TP-4刺激小鼠脾细胞或人外周血PBMC后，与对照药物葡聚糖（Dextran）相比，B细胞比例明显上调，而T细胞比例无明显变化。

[0115] 4）槐耳多糖刺激小鼠脾细胞后，T，B细胞上CD69的表达

[0116] 方法：粗多糖TCP、槐耳多糖TP-1、TP-2、TP-3、TP-4与对照多糖葡聚糖（Dextran）（浓度为50μg/ml）、脂多糖（LPS）与小鼠脾细胞共培养，6小时后，流式检测T、B细胞表面CD69的表达。结果见图10。

[0117] 结论：槐耳多糖刺激小鼠脾细胞6h后，B细胞开始高表达CD69，而T细胞无明显变化。

[0118] 3、促进巨噬细胞释放NO

[0119] 方法：小鼠腹腔巨噬细胞体外培养，加入粗多糖TCP、槐耳多糖TP-1、TP-2、TP-3、TP-4、低分子量组分TO-1、TO-2、TO-3、TO-4、槐耳粗总游离蛋白部分TFP与对照多糖葡聚糖（Dextran）、脂多糖（LPS）共培养，48小时后，用格里斯试剂盒（Griess Reagent kit）检测细胞培养上清中NO的含量，结果见图11。

[0120] 结论：NO检测结果显示，槐耳多糖能够刺激小鼠巨噬细胞分泌NO，且分泌量与多糖浓度呈剂量相关性。低分子量组分刺激后NO的分泌则没有显著变化。

[0121] 实施例4槐耳多糖蛋白对肿瘤血管形成内皮细胞增值的抑制作用

[0122] 一、实验方法与步骤：

[0123] 1、实验材料

[0124] 细胞：人类肿瘤来源的血管内皮细胞

[0125] 试剂：M199培养基，双抗，胎牛血清（FBS），碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），明胶（gelatin）。

[0126] 待测样品：TP-2：槐耳多糖蛋白-2

[0127] 2、实验步骤：

[0128] （1）用排枪将0.2%明胶加入96孔板内，每孔40微升，摇匀。放入培养箱孵育30分钟以上。

[0129] （2）取出96孔板，用排枪吸出明胶，用PBS洗一遍，放于超净台备用。

[0130] （3）配制20%FBS，加双抗的M199培养液。

[0131] （4）取复苏的人类肿瘤来源的血管内皮细胞，吸出培养液，用PBS洗一次，离心后用10%血清的M199重悬计数，调整细胞浓度为40000-50000/ml。

[0132] （5）用排枪将细胞加入96孔板，每孔100微升，边缘孔加等量PBS。放入培养箱。

[0133] （6.）12小时后，配制含1%-5%FBS，10-100ng/ml bFGF的M199培养基。

[0134] （7.）取出96孔板，用排枪吸出培养基，加入含1%-5%FBS以及bFGF的M199与药物，每孔100微升，设对照组与调零组。并加入待测样品，分别为TCP、TP-1、TP-2、TP-3与TP-4。每一样品设4个浓度，分别为10μg/L、100μg/L、500μg/L、与1000μg/L。然后在37°C，5%的CO2下连续孵育。

[0135] （8）72小时后，吸去培养基，加MTT(浓度0.5mg/ml，过滤除菌)，孵育4-6小时。

[0136] （9）吸去MTT，加100微升DMSO，570nm测OD.

[0137] 二、实验结论：

[0138] 槐耳多糖蛋白-2（TP-2）对肿瘤血管内皮细胞的增殖具有显著的抑制作用。结果见图12。图中数值显示为均数±标准差。各给药组与对照组相比较后，并经方差分析及事后T检验。*P＜0.05,表示两组比较有显著性差异。**P＜0.01，表示两组比较有很显著差异。***P＜0.001，表示两组比较有极显著差异。