本发明提供了基于GeXP遗传分析系统(原理是毛细管电泳技术)平台的检测方法，用于啤酒的混种酵母的增殖规律和混种比例。快速监控混种酵母增殖的方法，包括引物设计、PCR扩增反应、GeXP毛细管电泳检测、制作标准曲线、实时监控发酵液和优化混种酵母比例。根据这种方法，研究人员可以了解混种发酵过程中不同酵母的生长曲线和增殖规律以及不同酵母之间的相互影响，从而进一步为调控混种比例和保持最佳发酵性能提供技术保证。
1.快速监控混种酵母增殖的方法，其特征在于：包括引物设计、PCR扩增反应、GeXP毛细管电泳检测、制作标准曲线和实时监控发酵液；具体检测步骤如下：①引物设计：搜索Lager啤酒酵母基因组序列中的差异片段，并根据差异片段设计区分不同酵母的引物；所设计的上下游引物对应的扩增产物的扩增片段同时具有不同酵母的共有片段和特征片段；保证扩增片段达到GeXP毛细管电泳检测的要求并同时具有共有峰和特征峰；
②PCR扩增反应：分别用提取的纯种酵母DNA和步骤①设计的引物配制PCR反应体系，上PCR反应仪，扩增得到不同纯种酵母的特异产物，即为PCR产物；
③GeXP毛细管电泳检测：采用GeXP毛细管电泳检测稀释后的PCR产物并分析，确定纯种酵母的特征峰；
④制作标准曲线：(a)提取两种纯种酵母的DNA，将二者按照不同比例混合，得到不同混合比例的混种酵母DNA，所述混合比例为质量百分比；(b)对不同混合比例的混种酵母进行GeXP毛细管电泳检测，得到特征峰的峰高HT以及两种酵母共有峰的峰高HB；(c)根据混合比例和HT/HB比值，制作标准曲线；
⑤实时监控发酵液：对由步骤④的两种纯种酵母组成的混种发酵样品提取DNA，进行PCR反应，将稀释后的PCR产物进行GeXP毛细管电泳检测，得到检测样品的HT/HB比值，通过步骤④制作的标准曲线计算酵母中两种酵母的混合比例。
2.根据权利要求1所述的快速监控混种酵母增殖的方法，其特征在于：所述两种纯种酵母为酵母L830和酵母L053，所述酵母L830的特征峰位于289bp，所述两种酵母的共有峰位于286bp。
3.根据权利要求1所述的快速监控混种酵母增殖的方法，其特征在于：所述两种纯种酵母为酵母L830和酵母L820，所述酵母L830的特征峰位于289bp，所述两种酵母的共有峰位于286bp。
4.根据权利要求1所述的快速监控混种酵母增殖的方法，其特征在于：所述两种纯种酵母为酵母L830和酵母WP3470，所述酵母L830的特征峰位于289bp，所述两种酵母的共有峰位于286bp。
5.快速监控混种酵母增殖的方法，其特征在于：包括引物设计、PCR扩增反应、GeXP毛细管电泳检测、制作标准曲线和实时监控发酵液；具体检测步骤如下：①引物设计：搜索Lager啤酒酵母基因组序列中的差异片段，并根据差异片段设计区分不同酵母的引物；所设计的上下游引物对应的扩增产物的扩增片段同时具有不同酵母的共有片段和特征片段；每条引物分别配制成100μM的储存液，使用时稀释成200nM的工作液；
②PCR扩增反应：分别用提取的纯种酵母DNA和步骤①设计的引物配制PCR反应体系，上PCR反应仪，扩增得到不同纯种酵母的特异产物，即为PCR产物；
③GeXP毛细管电泳检测：采用GeXP毛细管电泳检测稀释后的PCR产物并分析，确定纯种酵母的特征峰；
④制作标准曲线：(a)为分别提取纯种酵母的DNA，检测核酸浓度并稀释至相同浓度，按不同体积比混合，即得到不同质量比的混种酵母DNA；(b)对不同混合比例的混种酵母进行GeXP毛细管电泳检测，得到特征峰的峰高HT以及两种酵母共有峰的峰高HB；(c)根据混合比例和HT/HB比值，制作标准曲线；
⑤实时监控发酵液：对由步骤④的两种纯种酵母组成的混种发酵样品提取DNA，进行PCR反应，将稀释后的PCR产物进行GeXP毛细管电泳检测，得到检测样品的HT/HB比值，通过步骤④制作的标准曲线计算酵母中两种酵母的混合比例；所述两种纯种酵母为酵母L830和酵母L053，所述酵母L830的特征峰位于289bp，所述两种酵母的共有峰位于286bp。
6.快速监控混种酵母增殖的方法，其特征在于：包括引物设计、PCR扩增反应、GeXP毛细管电泳检测、制作标准曲线和实时监控发酵液；具体检测步骤如下：①引物设计：搜索Lager啤酒酵母基因组序列中的差异片段，并根据差异片段设计区分不同酵母的引物；所设计的上下游引物对应的扩增产物的扩增片段同时具有不同酵母的共有片段和特征片段；每条引物分别配制成100μM的储存液，使用时稀释成200nM的工作液；
②PCR扩增反应：分别用提取的纯种酵母DNA和步骤①设计的引物配制PCR反应体系，上PCR反应仪，扩增得到不同纯种酵母的特异产物，即为PCR产物；
③GeXP毛细管电泳检测：采用GeXP毛细管电泳检测稀释后的PCR产物并分析，确定纯种酵母的特征峰；
④制作标准曲线：(a)为分别提取纯种酵母的DNA，检测核酸浓度并稀释至相同浓度，按不同体积比混合，即得到不同质量比的混种酵母DNA；(b)对不同混合比例的混种酵母进行GeXP毛细管电泳检测，得到特征峰的峰高HT以及两种酵母共有峰的峰高HB；(c)根据混合比例和HT/HB比值，制作标准曲线；
⑤实时监控发酵液：对由步骤④的两种纯种酵母组成的混种发酵样品提取DNA，进行PCR反应，将稀释后的PCR产物进行GeXP毛细管电泳检测，得到检测样品的HT/HB比值，通过步骤④制作的标准曲线计算酵母中两种酵母的混合比例；所述两种纯种酵母为酵母L830和酵母L820，所述酵母L830的特征峰位于289bp，所述两种酵母的共有峰位于286bp。
7.快速监控混种酵母增殖的方法，其特征在于：包括引物设计、PCR扩增反应、GeXP毛细管电泳检测、制作标准曲线和实时监控发酵液；具体检测步骤如下：①引物设计：搜索Lager啤酒酵母基因组序列中的差异片段，并根据差异片段设计区分不同酵母的引物；所设计的上下游引物对应的扩增产物的扩增片段同时具有不同酵母的共有片段和特征片段；每条引物分别配制成100μM的储存液，使用时稀释成200nM的工作液；
②PCR扩增反应：分别用提取的纯种酵母DNA和步骤①设计的引物配制PCR反应体系，上PCR反应仪，扩增得到不同纯种酵母的特异产物，即为PCR产物；
③GeXP毛细管电泳检测：采用GeXP毛细管电泳检测稀释后的PCR产物并分析，确定纯种酵母的特征峰；
④制作标准曲线：(a)为分别提取纯种酵母的DNA，检测核酸浓度并稀释至相同浓度，按不同体积比混合，即得到不同质量比的混种酵母DNA；(b)对不同混合比例的混种酵母进行GeXP毛细管电泳检测，得到特征峰的峰高HT以及两种酵母共有峰的峰高HB；(c)根据混合比例和HT/HB比值，制作标准曲线；
⑤实时监控发酵液：对由步骤④的两种纯种酵母组成的混种发酵样品提取DNA，进行PCR反应，将稀释后的PCR产物进行GeXP毛细管电泳检测，得到检测样品的HT/HB比值，通过步骤④制作的标准曲线计算酵母中两种酵母的混合比例；所述两种纯种酵母为酵母L830和酵母WP3470，所述酵母L830的特征峰位于289bp，所述两种酵母的共有峰位于286bp。
8.根据权利要求5-7中任意一项所述的快速监控混种酵母增殖的方法，其特征在于：
所述混种酵母中，具备特征峰的酵母的质量百分比依次为0、20％、40％、60％、80％、100％。
9.根据权利要求2-4中任意一项所述的快速监控混种酵母增殖的方法，其特征在于：
①取DSS400，加入80倍体积SLS,在涡旋震荡器上震荡30S，转移入上样板的孔中；
②取0.6μl稀释后的PCR产物，加入装有40μlSLS-DSS混合液的上样板的孔中，用移液枪混匀后覆盖一滴石蜡油；
③在缓冲液板的每个孔中加入250μl的分离缓冲液；
快速监控混种酵母增殖的方法
技术领域
[0001] 本发明属于检测方法，具体涉及酵母的检测方法，尤其涉及一种用于啤酒的混种酵母的增殖规律和混种比例的检测方法。
背景技术
[0002] 啤酒是以大麦经发芽制成的大麦芽为主要原料，经糖化、添加酒花、啤酒酵母发酵酿制而成的，含二氧化碳、低酒精浓度的、起泡的酿造酒。酿造啤酒，实际上是将淀粉转换成被称为“麦汁”的含糖液体，再利用酵母将麦汁发酵成含有酒精的啤酒。啤酒发酵过程是啤酒酵母在一定的条件下，利用麦汁中的可发酵性物质而进行的正常生命活动，其代谢的产物就是所要的产品——啤酒。然而，普通的啤酒是利用纯种啤酒酵母将麦汁进行发酵制成的，口味较为单一，保健功能也有限。
[0003] 为了提升啤酒的口感，研发人员使用混种酵母进行啤酒发酵的研究。要研究混种酵母发酵对于酿造啤酒的品质的影响，需要开发监控不同酵母的增殖规律和混种比例的变化。这将有助于了解混种发酵过程中不同酵母的生长曲线和增殖规律以及不同酵母之间的相互影响，从而进一步为调控混种比例和保持最佳发酵性能提供技术保证，然而，目前还没有这样一种检测方法。
发明内容
[0004] 本发明提供了基于GeXP遗传分析系统(原理是毛细管电泳技术)平台的检测方法，用于啤酒的混种酵母的增殖规律和混种比例。
[0005] 本发明的技术方案：
[0006] 快速监控混种酵母增殖的方法，包括引物设计、PCR扩增反应、GeXP毛细管电泳检测、制作标准曲线、实时监控发酵液和优化混种酵母比例。具体检测步骤如下：
[0007] ①引物设计：搜索Lager啤酒酵母基因组序列中的差异片段，并根据差异片段设计区分不同酵母的引物；所设计的上下游引物对应的扩增产物的扩增片段同时具有不同酵母的共有片段和特征片段；保证扩增片段达到GeXP毛细管电泳检测的要求并同时具有共有峰和特征峰；每条引物分别配制成100μM的储存液，使用时稀释成200nM的工作液；
[0008] ②PCR扩增反应：分别用提取的纯种酵母DNA和步骤①设计的引物配制PCR反应体系，上PCR反应仪，扩增得到不同纯种酵母的特异产物，即为PCR产物，将PCR产物稀释50倍后待检；
[0009] ③GeXP毛细管电泳检测：采用GeXP毛细管电泳检测稀释后的PCR产物并分析，确定纯种酵母的特征峰；具体步骤包括：
[0010] A.取DSS 400(分子量内标-400)，加入80倍体积SLS(上样缓冲液，甲酰胺)，在涡旋震荡器上震荡30S，转移至上样板的孔中；
[0011] B.取0.6μl PCR产物稀释液加到分装有40μl的SLS和DSS混合液的上样板的孔中，用移液枪混匀后覆盖一滴石蜡油；
[0012] C.在缓冲液板的每个孔中加入250μl的分离缓冲液；
[0013] D.上机进行GeXP毛细管电泳检测(使用Freg-3分离方法)，利用GeXP系统参数对毛细管电泳结果进行分析，记录结果；
[0014] ④制作标准曲线：(a)分别提取纯种酵母的DNA，检测核酸浓度并稀释至相同浓度，按不同体积比混合，即得到具备特征峰的纯种酵母的质量百分比依次为0、20％、40％、60％、80％、100％的混种酵母DNA；(b)对不同混合比例的混种酵母进行GeXP毛细管电泳检测，得到特征峰的峰高HT以及两种酵母共有峰的峰高HB；(c)根据混合比例和HT/HB比值，制作标准曲线；
[0015] ⑤实时监控发酵液：提取混种发酵的酵母样品DNA，进行PCR反应，将稀释后的PCR产物进行GeXP毛细管电泳检测，得到检测样品的HT/HB比值，通过步骤④制作的标准曲线计算两种酵母的混合比例。
[0016] 优选的是，所述两种纯种酵母为酵母L830和酵母L053，所述酵母L830的特征峰位于289bp，所述两种酵母的共有峰位于286bp。
[0017] 优选的是，所述两种纯种酵母为酵母L830和酵母L820，所述酵母L830的特征峰位于289bp，所述两种酵母的共有峰位于286bp。
[0018] 优选的是，所述两种纯种酵母为酵母L830和酵母WP3470，所述酵母L830的特征峰位于289bp，所述两种酵母的共有峰位于286bp。
[0019] 其中，L830的拉丁文名称为Saccharomyces pastorianus，购买自美国White Labs，编 号为WLP830GERMAN LAGER YEAST。L053的 拉丁 文名 称为 Saccharomyces pastorianus，购买自芬兰VTT技术研究中心，编号为A-78053。L820的拉丁文名 称 为 Saccharomyces pastorianus，购 买 自 美 国 White Labs，编 号 为 WLP820 OKTOBERFEST/ LAGER YEAST。WP3470的 拉 丁 文 名 称 为 Saccharomyces pastorianus，购买自德国魏恩施蒂芬高等专业学院，编号为Weihenstephan 34/70。
[0020] 本发明的有益效果：本发明提供了一种快速监控混种酵母的增殖规律和混种比例的变化的方法。根据这种方法，研究人员可以了解混种发酵过程中不同酵母的生长曲线和增殖规律以及不同酵母之间的相互影响，从而进一步为调控混种比例和保持最佳发酵性能提供技术保证。
附图说明
[0021] 图1为纯种酵母L830的检测峰图；
[0022] 图2为纯种酵母L053的检测峰图；
[0023] 图3为纯种酵母L820的检测峰图；
[0024] 图4为纯种酵母WP3470的检测峰图；
[0025] 图5为根据L830和L053的混种比例和特征峰高比值H289/H286制作的标准曲线；
[0026] 图6为L830-L053混种体系中酵母的比例随时间的变化；
[0027] 图7为根据L830和L820的混种比例和特征峰高比值H289/H286制作的标准曲线；
[0028] 图8为L830-L820混种体系中酵母的比例随时间的变化；
[0029] 图9为根据L830和WP3470的混种比例和特征峰高比值H289/H286制作的标准曲线；
[0030] 图10为L830-WP3470混种体系中酵母的比例随时间的变化。
具体实施方式
[0031] 下面结合附图对本发明做进一步的说明。
[0032] 实施例1：
[0033] 选择L830酵母与L053酵母进行混种发酵的10L发酵实验，分别在发酵开始后64h，70.5h，92h，160h，280h取发酵液进行混种酵母检测。
[0034] ①引物设计：使用SSR Hunter软件搜索Lager啤酒酵母(Saccharomyces pastorianus)基因组序列中的微卫星序列(SSR)并设计相应引物，其部分序列为：
[0035] AGCTCGCGCAGCAAAACCCGCTGCCAGAGCCACTGCTAGCGCCAACACCAAATCGGAAGACATGAAATACCTGTTGTCCGGCTACGATTACTTCGACGTGAGCGTGTCCGGTTGAGTTTATGCTGAGTTTTTGCGCATCAATATTATTTTTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACATACTATTAAATATACTAAATAAGAGGAAAACGCTTTGGAAGTGACTGGCGCCGCCGCTGGCTACTATAATAGCAGCGACTGTAATTTAATCTCATCCCGTCATTTGGATTACCTCTTTTACTCGC……
[0036] 序列中斜体加粗处为设计引物所在位置，两端各自加上GeXP专用接头后全长引物序列为：
[0037] 上游引物：5’—AGGTGACACTATAGAATACACCAAATCGGAAGACA—3’[0038] 下游引物：5’—GTACGACTCACTATAGGGAAAATGACGGGATGAGAT—3’[0039] 将每条引物分别配制成100μM的储存液，使用时稀释成200nM的工作液。
[0040] ②PCR扩增反应：分别采用纯种酵母和步骤①设计的引物配制PCR反应体系，上PCR反应仪，扩增得到不同纯种酵母的特异产物，即为PCR产物，将PCR产物稀释50倍后待检；使用Roche DNA提取试剂盒(High Pure PCR Template Preparation Kit,Cat.No.11796828001)提取混种酵母样品的DNA。PCR反应体系的组成详见表1，PCR反应程序详见表2。
[0041] 表1 PCR反应体系的组成
[0042]
[0043] 表2 PCR反应程序
[0044]
[0045] ③GeXP毛细管电泳检测：采用GeXP毛细管电泳检测稀释后的PCR产物并分析，确定纯种酵母的特征峰；其中，GeXP毛细管电泳检测采用的是Beckman生产的GeXP遗传分析系统。下述具体步骤中的试剂均在该仪器自身所附的试剂盒中；具体步骤包括：
[0046] A.取DSS 400(分子量内标-400)，加入80倍体积SLS(上样缓冲液，甲酰胺)，在涡旋震荡器上震荡30S，转移至上样板的孔中；
[0047] B.取0.6μl PCR产物稀释液加到分装有40μl的SLS和DSS混合液的上样板的孔中，用移液枪混匀后覆盖一滴石蜡油；
[0048] C.在缓冲液板的每个孔中加入250μl的分离缓冲液；
[0049] D.上机进行GeXP毛细管电泳检测(使用Freg-3分离方法)，利用GeXP系统参数对毛细管电泳结果进行分析，记录结果；由图1和图2可知，L830酵母与L053酵母的PCR扩增产物均出现了286bp的主产物峰。同时，L830中还出现了289bp的特征峰，而L053中未检出该特征峰，因此，289bp处的特征峰可以用于区分两种酵母。
[0050] ④制作标准曲线：分别提取纯种酵母的DNA，检测核酸浓度，稀释至相同浓度后分别按不同体积混合，即得到具备特征峰的纯种酵母的质量百分比依次为0、20％、40％、60％、80％、100％的混种酵母DNA。对不同比例的L830酵母-L053酵母组成的混种酵母进行GeXP检测，根据混种比例和相对定量的特征峰高比值H289/H286制作标准曲线，见图5。
[0051] 拟合得到的公式为：y＝0.2707x+0.0595，R2＝0.9621。因此，标准曲线的线性相关系数达到0.9621，表明利用GeXP技术建立的监控方法准确性较高。
[0052] ⑤实时监控发酵液：对不同时间的L830酵母-L053酵母组成的混种发酵的酵母样品进行GeXP毛细管电泳检测，得到检测样品的H289/H286比值，通过步骤④制作的标准曲线计算两种酵母的混合比例，结果详见图6。由图6可知，L830所占比例高，且随着时间推移不断提高，逐步达到70％左右。表明在发酵条件下L830酵母的生长较L053占优势，在发酵性能和风味物质产生等方面L830所占权重也较大。
[0053] 实施例2：
[0054] 与实施例1不同的是，实施例2选择L830酵母与L820酵母进行混种发酵的10L发酵实验，分别在发酵开始后64h，70.5h，92h，160h，280h取发酵液进行混种酵母检测。
[0055] ④制作标准曲线：分别提取纯种酵母的DNA，检测核酸浓度，稀释至相同浓度后分别按不同体积混合，即得到具备特征峰的纯种酵母的质量百分比依次为0、20％、40％、60％、80％、100％的混种酵母DNA。对不同比例的L830酵母-L820酵母组成的混种酵母进行GeXP检测，根据混种比例和相对定量的特征峰高比值H289/H286制作标准曲线，见图7。拟合得到的公式为：y＝0.0027x+0.0457，R2＝0.9994。标准曲线的线性相关系数达到0.9994，表明利用GeXP技术建立的监控方法准确性较高。
[0056] ⑤实时监控发酵液：对不同时间的L830酵母-L820酵母组成的混种发酵的酵母样品进行GeXP毛细管电泳检测，得到检测样品的H289/H286比值，通过步骤④制作的标准曲线计算两种酵母的混合比例，结果详见图8。由图8可知，92h前二者比例相当(50％左右)，后期L830逐渐占优势，稳定在57％左右。表明在发酵早期，两种酵母生长能力相当，但随着发酵进程的不断发展，L830的生长优势逐渐体现出来，在发酵后期的发酵性能和物质代谢方面占主导地位。
[0057] 实施例3：
[0058] 与实施例1不同的是，选择L830酵母与WP3470酵母进行混种发酵的10L发酵实验，分别在发酵开始后64h，70.5h，92h，160h，280h取发酵液进行混种酵母检测。
[0059] ④制作标准曲线：分别提取纯种酵母的DNA，检测核酸浓度，稀释至相同浓度后分别按不同体积混合，即得到具备特征峰的纯种酵母的质量百分比依次为0、20％、40％、60％、80％、100％的混种酵母DNA。对不同比例的L830酵母-WP3470酵母组成的混种酵母进行GeXP检测，根据混种比例和相对定量的特征峰高比值H289/H286制作标准曲线，见图9。
[0060] 拟合得到的公式为y＝22776/(65316x+6769)；R2＝0.97384，标准曲线的相关系数达到0.97384，表明利用GeXP技术建立的监控方法准确性较高。
[0061] ⑤实时监控发酵液：对不同时间的L830酵母-WP3470酵母组成的混种发酵的酵母样品进行GeXP毛细管电泳检测，得到检测样品的H289/H286比值，通过步骤④制作的标准曲线计算两种酵母的混合比例，结果详见图10。由图10可知，WP3470所占比例高，且随着时间推移不断提高，逐步达到80％左右。表明在发酵条件下WP3470酵母的生长较L830占优势，且随着发酵的进行优势不断增大，在发酵性能和风味物质产生等方面WP3470所占权重较大。
