一种利用合相色谱同时检测烟草中四溴菊酯及溴氰菊酯的分析方法，其特征在于：首先利用乙腈对烟草基质中残留的四溴菊酯和溴氰菊酯进行提取，加入一定量的硫酸镁、氯化钠、脱水柠檬酸钠、柠檬酸氢钠物质进行振荡，离心后吸取一定量的上清液进行氮吹浓缩，达到一定浓度后，进行固相萃取对其进行净化处理，氮气吹干后利用乙腈溶剂进行复溶，过0.22μm有机相滤膜后，利用超高效合相色谱仪对其中的四溴菊酯和溴氰菊酯进行浓度分析。本方法首次利用UPC2建立了一种同时检测烟草中四溴菊酯和溴氰菊酯的同时快速测定方法。本技术以CO2为主要流动相，能够在8分钟内实现2种化合物的分离与定量分析，可以为该指标的相关检验提供依据。
1.一种利用合相色谱同时检测烟草中四溴菊酯及溴氰菊酯的分析方法，其特征在于：首先利用乙腈对烟草基质中残留的四溴菊酯和溴氰菊酯进行提取，加入一定量的硫酸镁、氯化钠、脱水柠檬酸钠、柠檬酸氢钠进行振荡，离心后吸取一定量的上清液进行氮吹浓缩，达到一定浓度后，进行固相萃取对其进行净化处理，氮气吹干后利用乙腈溶剂进行复溶，过
0.22 μm有机相滤膜后，利用超高效合相色谱仪对其中的四溴菊酯和溴氰菊酯进行浓度分析,具体步骤如下：
首先称取2.0 g已粉碎的烟草样品于50 mL具塞离心管中，加入10 mL超纯水浸润样品，静置10 min，取10 mL乙腈到离心管中，于旋涡混合器上以2000 rpm速度振荡1 min，把离心管放入-20°C冰箱冷冻10 min，然后向离心管中加入含4 g无水硫酸镁、1 g氯化钠、1 g柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸氢钠的盐析试剂包，立即于旋涡混合器上以2000 rpm振荡
2 min，以5000 rpm离心3 min，取5mL上清液氮吹浓缩至1mL；
采用弗罗里硅土小柱作为固相萃取柱，以v/v为95:5的正己烷与丙酮的混合液作为洗脱液，对浓缩好的样品进行固相萃取净化处理，具体操作步骤分为：首先，利用6 mL洗脱液对弗罗里硅土小柱进行活化处理；其次，将上一步所获得的1mL浓缩液注入至弗罗里硅土小柱上；第三步，利用5 ml洗脱液对小柱进行洗涤，收集全部洗涤液；第四步，注入3 mL空气以排净小柱上残留的液体；
首先以氮吹仪对收集的洗脱液浓缩近干，然后加入1 mL乙腈复溶，并利用0.22 μm有机相滤膜对样品进行过滤，作为样品待测液；
四溴菊酯和溴氰菊酯的系列标准溶液浓度均为：0.1 μg/mL、0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.5 μg/mL，5.0 μg /mL；
采用超高效合相色谱仪对标准工作溶液和样品待测液进行浓度分析，紫外检测器进行检测，外标法定量；
色谱条件：采用色谱柱为Acquity UPC CSH Fluoro-Phenyl色谱柱；ABPR压力为1800 psi；色谱柱温度为40 ℃；进样量为5-10 μL；流动相分别为流动相A:CO2和流动相B:甲醇，流速为1.5 mL/min，流动相梯度洗脱程序如表1；紫外检测波长为215 nm；
2.根据权利要求1所述的利用合相色谱同时检测烟草中四溴菊酯及溴氰菊酯的分析方法，其特征在于：标准工作溶液配制的具体方法如下：四溴菊酯和溴氰菊酯单标储备液：准确称取10.0 mg精确到0.1 mg的标准品，置于
10 mL容量瓶中，用乙腈溶解定容，配制成质量浓度为1000.0 μg/mL的单标储备液，贮存在-20°C冰箱中备用；
混合标准工作溶液：分别取四溴菊酯和溴氰菊酯单标储备液0.5ml于100 mL容量瓶中，用乙腈稀释定容，配制成两种农药组分质量浓度分别为5.0 μg/mL的混合工作储备液，储存在4°C冰箱中备用；
系列标准溶液配制：准确移取0.2 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL、5 mL的混合标准工作溶液，置于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，即得系列标准工作溶液，具体浓度为：0.1 μg/mL、0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.5 μg/mL，5.0 μg /mL。
一种利用合相色谱同时检测烟草中四溴菊酯及溴氰菊酯的
分析方法
[0001] 技术领域：
[0002] 本发明涉及农药残留检测技术领域，具体是一种利用合相色谱同时检测烟草中四溴菊酯和溴氰菊酯残留的定量分析方法。
[0003] 背景技术：
[0004] 四溴菊酯是一种溴氰菊酯与溴通过加成反应所获得的具有高活性的防虫类农药，共包含两个异构体。该农药对于防治鞘翅目、双翅目、半翅目等烟草中多发的害虫具有十分显著的效果，因此被广泛用于烟草的种植。溴氰菊酯本身也是一种杀虫剂，对鳞翅目幼虫具有良好的防治效果，常被用于种植过程对烟草作物的保护。四溴菊酯和溴氰菊酯不但对鱼、虾等水生生物以及有益昆虫具有危害，在烟草中的残留也会加重对吸烟者及周围人群的健康危害风险。因此，对烟草中存在的这两种农残进行监控具有重要意义。
[0005] 四溴菊酯和溴氰菊酯在结构上具有很大的相似性，同时检测具有较高的难度。目前，国内外报道的四溴菊酯的检测方法主要为气相色谱法(GC)、气相色谱－质谱法(GC－MS)以及高效液相色谱法（HPLC）。其中，气相色谱的应用最为广泛。但是，由于在气相色谱的进样口280℃左右的高温作用下，四溴菊酯发生分解生成溴氰菊酯，利用气相色谱法实际上测得的只能是四溴菊酯转化溴氰菊酯以及本身所存在的溴氰菊酯的总量，并不能对这两种农药残留进行分别定量。而合相色谱运行温度一般控制在50 ℃左右，在此温度下，四溴菊酯性质稳定，未发现转化成溴氰菊酯的现象，因此，利用合相色谱同时检测烟草中的四溴菊酯及溴氰菊酯具有一定的实际应用价值，可以更好地了解烟草中农药残留情况。
[0006] 发明内容：
[0007] 本发明的目的正是基于上述现有技术状况而提供的一种利用合相色谱同时检测烟草中四溴菊酯及溴氰菊酯的分析方法，是以新兴的合相色谱技术完成烟草中四溴菊酯和溴氰菊酯的同时快速分析，主要是先利用QuRChERS前处理技术以及固相萃取技术进行预处理，然后采用超高效合相色谱仪对四溴菊酯及溴氰菊酯进行同时检测，并通过外标法进行定量分析。本方法仪器分析快速，有机溶剂用量极少，是一种集高效、灵敏、绿色等多种优点于一体的分析方法。
[0008] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0009] 一种利用合相色谱同时检测烟草中四溴菊酯及溴氰菊酯的分析方法，首先利用乙腈对烟草基质中残留的四溴菊酯和溴氰菊酯进行提取，加入一定量的硫酸镁、氯化钠、脱水柠檬酸钠、柠檬酸氢钠进行振荡，离心后吸取一定量的上清液进行氮吹浓缩，达到一定浓度后，进行固相萃取对其进行净化处理，氮气吹干后利用乙腈溶剂进行复溶，过0.22 μm有机相滤膜后，利用超高效合相色谱仪对其中的四溴菊酯和溴氰菊酯进行浓度分析,具体步骤如下：
[0010] 1)样品的提取
[0011] 为获得良好的提取效果，首先称取2.0 g已粉碎的烟草样品于50 mL具塞离心管中，加入10 mL超纯水浸润样品，静置10 min，取10 mL乙腈到离心管中，于旋涡混合器上以2000 rpm速度振荡1 min，把离心管放入-20°C冰箱冷冻10 min，以防止盐析过程中的产热造成某些目标物质分解。然后向离心管中加入盐析试剂包（含4 g无水硫酸镁，1 g氯化钠，1 g柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸氢二钠），立即于旋涡混合器上以2000 rpm振荡2 min，以
5000 rpm离心3 min，取5mL上清液氮吹浓缩至1mL；
[0012] 2)样品的固相萃取净化
[0013] 采用弗罗里硅土小柱作为固相萃取柱，正己烷与丙酮的混合液（95:5，v/v）作为洗脱液，对浓缩好的样品进行固相萃取净化处理，具体操作步骤分为：首先，利用6 mL洗脱液对弗罗里硅土小柱进行活化处理；其次，将上一步所获得的1mL浓缩液注入至弗罗里硅土小柱上；第三步，利用5 ml洗脱液对小柱进行洗涤，收集全部洗涤液；第四步，注入3 mL空气以排净小柱上残留的液体；该步骤能有效地降低烟草样品中的基质干扰。
[0014] 3)浓缩、复溶及过滤
[0015] 为保证超高效合相色谱仪分析工作的顺利进行，同时实现精确定量，需将提取液溶剂更换为1 mL乙腈，具体的做法为：首先以氮吹仪对收集的洗脱液浓缩近干，然后加入1 mL乙腈复溶，并利用0.22 μm有机相滤膜对样品进行过滤，作为样品待测液；
[0016] 4)标准工作溶液配制
[0017] 标准工作溶液配制的具体方法如下：
[0018] 四溴菊酯和溴氰菊酯单标储备液：准确称取10.0 mg（精确到0.1 mg）标准品，置于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解定容，配制成质量浓度为1000.0 μg/mL的单标储备液，贮存在-20°C冰箱中备用；
[0019] 混合标准工作溶液：分别取四溴菊酯和溴氰菊酯单标储备液0.5ml于100 mL容量瓶中，用乙腈稀释定容，配制成两种农药组分质量浓度分别为5.0 μg/mL的混合工作储备液，储存在4°C冰箱中备用；
[0020] 系列标准溶液配制：准确移取0.2 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL、5 mL的混合标准工作溶液，置于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，即得系列标准工作溶液，具体浓度为：0.1 μg/mL、0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.5 μg/mL，5.0 μg /mL。
[0021] 5)合相色谱分析
[0022] 采用超高效合相色谱仪对标准工作溶液和样品待测液进行浓度分析，紫外检测器进行检测，外标法定量；
[0023] 色谱条件：采用色谱柱为Acquity UPC2 CSH Fluoro-Phenyl色谱柱；ABPR压力为1800 psi；色谱柱温度为40 ℃；进样量为5-10 μL；流动相分别为CO2（流动相A）和甲醇（流动相B），流速为1.5 mL/min，流动相梯度洗脱程序如表1；紫外检测波长为215 nm；
[0024] 表1 梯度洗脱程序
[0025]
[0026] 6）方法评价
[0027] 在上述合相色谱条件下，对本方法进行评价，四溴菊酯和溴氰菊酯成分的线性方程、线性范围、相关系数、平均回收率、定量限等见表2：
[0028]
[0029] 本方法首次利用UPC2建立了一种同时检测烟草中四溴菊酯和溴氰菊酯的同时快速测定方法。以超临界CO2为主，结合少量乙腈作为流动相，提高了色谱分析的效率，且较大程度地降低了有机溶剂使用量，减少了对环境的污染，减轻分析过程对操作人员的健康威胁。能够在8分钟内实现四溴菊酯和溴氰菊酯的同时定量分析，填补了目前常采用的气相色谱法不能同时分别定量分析这两种目标物的不足。本方法可以为上述两种目标物的相关检验提供依据。
[0030] 附图说明：
[0031] 图1：样品前处理及合相色谱检测流程图。
[0032] 图2：合相色谱图。其中，1为溴氰菊酯；2、3为四溴菊酯两种异构体(为突出表明进样时四溴菊酯未发生转化反应生成溴氰菊酯，未将两类目标化合物放在同一色谱图上)。
[0033] 具体实施方式：
[0034] 本发明结合实例做进一步描述，但并不是限制本发明。
[0035] 实例1：
[0036] 1．仪器与试剂：
[0037] 四溴菊酯和溴氰菊酯：均为标准品；乙腈、丙酮、正己烷，均为色谱级试剂。
[0038] 美国Waters合相色谱仪（UPC2），瑞士Mettler AE 163电子天平（感量：0.0001g）；美国Labnet VtexMixer VX200振荡器；德国Sigma高速冷冻离心机。
[0039] 2．样品处理：
[0040] 对某种白肋烟样品进行分析，首先进行样品的提取：分别称取2.0 g已粉碎的烟草样品于50 mL具塞离心管中，加入10 mL水浸润样品，静置10 min。取10 mL乙腈到离心管中，于旋涡混合器上以2000 rpm速度振荡1 min，把离心管放入-20 ℃冰箱冷冻10 min。然后向离心管中加入盐析试剂包（含4 g无水硫酸镁，1 g氯化钠，1 g柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸氢二钠），立即于旋涡混合器上以2000 rpm振荡2 min，以5000 rpm离心3 min。取5 mL上清液氮吹浓缩至1 mL。
[0041] 其次，将浓缩好的样品进行固相萃取净化处理，具体操作步骤分为：首先，利用6 mL正己烷和乙酸乙酯的混合液（95:5）对弗罗里硅土小柱进行活化处理；其次，将上一步所获得的1 mL浓缩液注入至弗罗里硅土小柱上；第三步，利用5 ml体积比为95:5的正己烷和丙酮的混合液对小柱进行洗涤，收集全部洗涤液；第四步，注入3 mL空气以排净小柱上残留的液体。对处理液进行浓缩、复溶及0.22 μm有机相滤膜对样品进行过滤。
[0042] 3.标准溶剂配置：
[0043] 配制的四溴菊酯和溴氰菊酯的系列标准溶液浓度为：0.1 μg/mL、0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.5 μg/mL，5.0 μg /mL。
[0044] 4.测定：
[0045] 采用合相色谱分别对标准工作溶液和样品待测液进行分析，紫外检测器进行检测，外标法定量。
[0046] 色谱条件：采用色谱柱为Acquity UPC2 CSH Fluoro-Phenyl色谱柱；ABPR压力为1800 psi；色谱柱温度为60 ℃；进样量为5-10μL；流动相分别为CO2（流动相A）和甲醇（流动相B），流速为1.5 mL/min，流动相梯度洗脱程序如表1；紫外检测波长为215 nm。分析结果见表3。
[0047] 分析结果：
[0048] 表3 实际样品检测结果（单位：mg/kg）
[0049]溴氰菊酯 四溴菊酯
0.56 0.43
[0050] 实例2：
[0051] 如实例1所述，选择另一烟草样品B（烤烟样品），测得样品中2种农药目标物的含量见表4。
[0052] 表4实际样品检测结果（单位：mg/kg）
[0053]溴氰菊酯 四溴菊酯
0.61 —
[0054] 注：“—”代表未检出
[0055] 实例3：选择样品C（一种成品卷烟），将烟只拆分并收集烟丝，粉碎，其他操作如实例1所述，测得样品中2类农药目标物的含量见表5。
[0056] 表5实际样品检测结果（单位：mg/kg）
[0057]溴氰菊酯 四溴菊酯
— —
[0058] 注：“—”代表未检出。
