一种河豚毒素检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种河豚毒素检测试剂盒，所述河豚毒素检测试剂盒包括以下成分：A、已知浓度的标准品；B、缓冲体系L；C、检测液，所述检测液各组分及其浓度为：pH7.4的PBS缓冲液0.01-0.03mol/L，叠氮钠（防腐剂）0.1-0.3g/L，与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒：其中粒径为30-50nm的胶乳颗粒0.1-0.2g/L，粒径为60-90nm的胶乳颗粒0.2-0.4g/L，粒径为120-200nm的胶乳颗粒0.6-0.8g/L；D、河豚毒素浓缩样品提取液10×各组分及其浓度为：甲醇10-15g/L，乙酸2-5g/L，乙酸铵1-3g/L。本发明具有快速、简便、准确和灵敏度高等特点，可以同时进行大批量样本快速测定，能最大限度地减少操作误差和工作强度。

权利要求

1.一种河豚毒素检测试剂盒，其特征在于：所述河豚毒素检测试剂盒包括以下成分：A、已知浓度的标准品；

B、缓冲体系，所述缓冲体系各组分及其浓度为： pH 7.4 的PBS缓冲液0.01-0.03mol/L，溴化己二甲铵1-3g/L，叠氮钠0.1-0. 5g/L，吐温20 0.5-1.5mol/L，柠檬酸0.8-1.6 g/L，牛血清白蛋白1-3 g/L；

C、检测液，所述检测液各组分及其浓度为：pH 7.4 的PBS缓冲液0.01-0.03mol/L，叠氮钠0.1-0.3g/L，与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒：其中粒径为30-50nm的胶乳颗粒0.1-0.2g/L，粒径为60-90nm的胶乳颗粒0.2-0.4g/L，粒径为120-200nm的胶乳颗粒

0.6-0.8 g/L；

D、10×河豚毒素浓缩样品提取液，所述10×河豚毒素浓缩样品提取液各组分及其浓度为：甲醇10-15g/L，乙酸2-5g/L，乙酸铵1-3g/L。

2.根据权利要求1所述的一种河豚毒素检测试剂盒，其特征在于：标准品浓度分别为

0μg/L, 2μg/L,5μg/L,15μg/L,25μg/L,50μg/L,100μg/L。

3.根据权利要求1所述的一种河豚毒素检测试剂盒，其特征在于：与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒的制备方法如下：（1）、在离心管内分别加入150-180μL 纳米胶乳颗粒，1200-1400μL pH 7.4

0.01-0.03mol/L PBS缓冲液，河豚毒素单克隆抗体3株，300-400μL EDAC水溶液，磁力搅拌3-5小时， 4℃，12000g离心60-80min，弃上清液；所述纳米胶乳颗粒的粒径为30-50nm、

60-90nm或120-200nm；

（2）、沉淀置于冰浴中，超声振荡1-2min；

（3）、步骤（2）处理后的沉淀用等体积PBS缓冲液重悬后加入淬灭剂0.2mol/L甘氨酸溶液300-400μL，搅拌20-30min；

（4）、4℃，10000g离心60-80min，去掉上清液，沉淀用等体积PBS缓冲液重悬后得河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒。

4.根据权利要求3所述的一种河豚毒素检测试剂盒，其特征在于：步骤（2）所述的超声振荡期间，超声1秒，间隔3-4秒。

说明书

一种河豚毒素检测试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及一种试剂盒，特别涉及一种河豚毒素检测试剂盒。

背景技术

[0002] 河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX)是鲀鱼类（俗称河豚鱼）及其它生物体内含有的一种生物碱（氨基全氢喹唑啉型化合物），是自然界中所发现的毒性最大的神经毒素之一；其毒性比剧毒的氰化钠还要高1250多倍，0.5mg即可致死。

[0003] 申请号200410036380.0 的发明专利公开了一种河豚毒素的简便快速的检测方法。该方法用强碱处理河豚毒素，得到与河豚毒素等摩尔量的2-氨基-6-羟甲基-8-羟基喹啉与草酸盐。利用草酸氧化酶将草酸盐催化氧化成过氧化氢。之后通过显色剂与过氧化氢反应显色,通过在520nm比色即可定量河豚毒素的含量。该方法存在的缺陷是：操作复杂，检测时间长，无法进行大批量样品的同时测定。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种河豚毒素检测试剂盒，具有快速、简便、准确和灵敏度高等特点，可以同时进行大批量样本快速测定，能最大限度地减少操作误差和工作强度。

[0005] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

[0006] 一种河豚毒素检测试剂盒，所述河豚毒素检测试剂盒包括以下成分：

[0007] A、已知浓度的标准品；

[0008] B、缓冲体系，所述缓冲体系各组分及其浓度为： pH 7.4 的PBS缓冲液0.01-0.03mol/L，溴化己二甲铵（反应促进剂）1-3g/L，叠氮钠（防腐剂）0.1-0. 5g/L，吐温
20（表面活性剂）0.5-1.5mol/L，柠檬酸0.8-1.6 g/L，牛血清白蛋白1-3 g/L；

[0009] C、检测液，所述检测液各组分及其浓度为：pH 7.4 的PBS缓冲液0.01-0.03mol/L，叠氮钠（防腐剂）0.1-0.3g/L，与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒：其中粒径为30-50nm的胶乳颗粒0.1-0.2g/L，粒径为60-90nm的胶乳颗粒0.2-0.4g/L，粒径为120-200nm的胶乳颗粒0.6-0.8 g/L；

[0010] D、河豚毒素浓缩样品提取液10×各组分及其浓度为：甲醇10-15g/L，乙酸2-5g/L，乙酸铵1-3g/L。

[0011] 本发明的检测原理为胶乳增强免疫比浊法，具体为：河豚毒素浓缩样品提取液稀释至正常浓度提取样品后得样品提取液，缓冲体系中加入样品提取液，然后加入检测液，检测液中与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒上的河豚毒素单克隆抗体与样品提取液中河豚毒素特异性结合形成可溶性抗原抗体复合物，形成的浊度和样品中河豚毒素的含量成正相关关系。

[0012] 与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒分为小粒径颗粒（30-50 nm）、中粒径颗粒（60-90 nm）和大粒径颗粒（120-200 nm）三部分，小粒径颗粒比表面积大，交联的河豚毒素单克隆抗体较多，增加了检测的线性范围。大粒径颗粒较大，结合河豚毒素后容易显现浊度，提高了检测的灵敏度。中粒径颗粒能保证检测线性范围的同时，还能增强浊度显示，保证了检测的稳定性。控制与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒的含量异常重要，对于检测起到了核心作用。大粒径颗粒（120-200 nm）的浓度、中粒径颗粒（60-90 nm）浓度较大容易显现浊度，小粒径颗粒浓度0.1-0.2g/L，保证了检测的线性范围，这样检测效果最佳。

[0013] 作为优选，标准品浓度分别为0μg/L, 2μg/L，5μg/L,15μg/L,25μg/L,50μg/L,100μg/L。

[0014] 作为优选，与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒的制备方法如下：

[0015] （1）、在离心管内分别加入150-180μL 纳米胶乳颗粒，1200-1400μL pH 7.40.01-0.03mol/L PBS缓冲液，河豚毒素单克隆抗体3株，300-400μL EDAC水溶液，磁力搅拌3-5小时， 4℃，12000g离心60-80min，弃上清液；

[0016] （2）、沉淀置于冰浴中，超声振荡1-2min；

[0017] （3）、步骤（2）处理后的沉淀用等体积PBS缓冲液重悬后加入淬灭剂0.2mol/L甘氨酸溶液300-400μL，搅拌20-30min；

[0018] （4）、4℃，10000g离心60-80min，去掉上清液，沉淀用等体积PBS缓冲液重悬后得河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒。

[0019] 纳米胶乳颗粒为市售产品，产品为乳液状，产品中纳米胶乳颗粒含量为20%（w/v）；EDAC水溶液浓度为0.2g/ml。河豚毒素单克隆抗体有三株，三株河豚毒素单克隆抗体与河豚毒素有不同结合位点，这样检测的灵敏度、特异性更好。

[0020] 用河豚毒素单克隆抗体和带氨基的纳米胶乳颗粒进行化学交联，优化缓冲液的浓度、pH、离心参数、超声条件控制等，得到了检测性能佳的与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒。

[0021] 作为优选，步骤（2）所述的超声振荡期间，超声1秒，间隔3-4秒。

[0022] 作为优选，所述纳米胶乳颗粒的粒径为30-50nm、60-90nm或120-200nm。

[0023] 本发明的有益效果是：具有快速、简便、准确和灵敏度高等特点，可以同时进行大批量样本快速测定，能最大限度地减少操作误差和工作强度。

具体实施方式

[0024] 下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

[0025] 本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

[0026] 本发明的三株河豚毒素单克隆抗体是按照现有技术记载：王健伟等，抗河豚毒素单克隆抗体的制备及其特性的初步研究，卫生研究，1996年，9月第25卷第5期，308-311页记载的方法获得（1G3、4G3、6D9三株）。

[0027] 实施例1：

[0028] 一种河豚毒素检测试剂盒，所述河豚毒素检测试剂盒包括以下成分：

[0029] A、已知浓度的标准品： 0μg/L, 2μg/L,5μg/L,15μg/L,25μg/L,50μg/L,100μg/L。

[0030] B、缓冲体系：所述缓冲体系各组分及其浓度为： pH 7.4 的PBS缓冲液0.01mol/L，溴化己二甲铵1g/L，叠氮钠0.1g/L，吐温20 0.5mol/L，柠檬酸1.6 g/L，牛血清白蛋白1 g/L。

[0031] C、检测液，所述检测液各组分及其浓度为：pH 7.4 的PBS缓冲液0.01mol/L，叠氮钠0.1g/L，与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒：其中粒径为30nm的胶乳颗粒0.1g/L，粒径为60nm的胶乳颗粒0.2g/L，粒径为120nm的胶乳颗粒0.6g/L。

[0032] 与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒的制备方法如下：

[0033] （1）、在离心管内分别加入150μl 纳米胶乳颗粒（市售，产品中纳米胶乳颗粒含量为20%（w/v），粒径为30nm、60nm或120nm分别得到三种规格的与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒），1200μl pH 7.4 0.01mol/L PBS缓冲液，河豚毒素单克隆抗体3株（1G3、4G3、6D9三株），300μl EDAC水溶液（浓度为0.2g/ml），磁力搅拌3小时， 4℃，12000g离心
60min，弃上清液；

[0034] （2）、沉淀置于冰浴中，超声振荡1min，超声振荡期间，超声1秒，间隔3秒；

[0035] （3）、步骤（2）处理后的沉淀用等体积PBS缓冲液（pH 7.4 、0.01mol/L的PBS缓冲液）重悬后加入淬灭剂0.2mol/L甘氨酸溶液300μl，搅拌20min；

[0036] （4）、4℃，10000g离心60min，去掉上清液，沉淀用等体积PBS缓冲液（pH 7.4 、0.01mol/L的PBS缓冲液）重悬后得河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒。

[0037] D、河豚毒素浓缩样品提取液10×各组分及其浓度为：甲醇10g/L，乙酸2g/L，乙酸铵3g/L。

[0038] 实施例2：

[0039] 一种河豚毒素检测试剂盒，所述河豚毒素检测试剂盒包括以下成分：

[0040] A、已知浓度的标准品： 0μg/L, 2μg/L,5μg/L,15μg/L,25μg/L,50μg/L,100μg/L。

[0041] B、缓冲体系：所述缓冲体系各组分及其浓度为： pH 7.4 的PBS缓冲液0.03mol/L，溴化己二甲铵3g/L，叠氮钠0. 5g/L，吐温20 1.5mol/L，柠檬酸0.8g/L，牛血清白蛋白3 g/L。

[0042] C、检测液，所述检测液各组分及其浓度为：pH 7.4 的PBS缓冲液0.03mol/L，叠氮钠0.3g/L，与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒：其中粒径为50nm的胶乳颗粒0.2g/L，粒径为90nm的胶乳颗粒0.4g/L，粒径为200nm的胶乳颗粒0.8 g/L。

[0043] 与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒的制备方法如下：

[0044] （1）、在离心管内分别加入180μl 纳米胶乳颗粒（市售，产品中纳米胶乳颗粒含量为20%（w/v），粒径为50nm、90nm或200nm分别得到三种规格的与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒），1400μl pH 7.4 0.03mol/L PBS缓冲液，河豚毒素单克隆抗体3株，400μl EDAC水溶液（浓度为0.2g/ml），磁力搅拌5小时， 4℃，12000g离心80min，弃上清液；

[0045] （2）、沉淀置于冰浴中，超声振荡2min，超声振荡期间，超声1秒，间隔4秒；

[0046] （3）、步骤（2）处理后的沉淀用等体积PBS缓冲液（pH 7.4 、0.03mol/L的PBS缓冲液）重悬后加入淬灭剂0.2mol/L甘氨酸溶液400μl，搅拌30min；

[0047] （4）、4℃，10000g离心80min，去掉上清液，沉淀用等体积PBS缓冲液（pH 7.4 、0.03mol/L的PBS缓冲液）重悬后得河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒。

[0048] D、河豚毒素浓缩样品提取液10×各组分及其浓度为：甲醇15g/L，乙酸5g/L，乙酸铵1g/L。

[0049] 实施例3：

[0050] 一种河豚毒素检测试剂盒，所述河豚毒素检测试剂盒包括以下成分：

[0051] A、已知浓度的标准品： 0μg/L, 2μg/L,5μg/L,15μg/L,25μg/L,50μg/L,100μg/L。

[0052] B、缓冲体系：所述缓冲体系各组分及其浓度为： pH 7.4 的PBS缓冲液0.02mol/L，溴化己二甲铵2g/L，叠氮钠0.3g/L，吐温20 1mol/L，柠檬酸1g/L，牛血清白蛋白2 g/L。

[0053] C、检测液，所述检测液各组分及其浓度为：pH 7.4 的PBS缓冲液0.02mol/L，叠氮钠0.2g/L，与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒：其中粒径为40nm的胶乳颗粒0.15g/L，粒径为70nm的胶乳颗粒0.3g/L，粒径为160nm的胶乳颗粒0.7 g/L。

[0054] 与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒的制备方法如下：

[0055] （1）、在离心管内分别加入170μl 纳米胶乳颗粒（市售，产品中纳米胶乳颗粒含量为20%（w/v），粒径为40nm、70nm或160nm分别得到三种规格的与河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒），1300μl pH 7.4 0.02mol/L PBS缓冲液，河豚毒素单克隆抗体3株，350μl EDAC水溶液（浓度为0.2g/ml），磁力搅拌4小时， 4℃，12000g离心70min，弃上清液；

[0056] （2）、沉淀置于冰浴中，超声振荡1.5min，超声振荡期间，超声1秒，间隔3秒；

[0057] （3）、步骤（2）处理后的沉淀用等体积PBS缓冲液（pH 7.4 、0.02mol/L的PBS缓冲液）重悬后加入淬灭剂0.2mol/L甘氨酸溶液350μl，搅拌25min；

[0058] （4）、4℃，10000g离心70min，去掉上清液，沉淀用等体积PBS缓冲液（pH 7.4 、0.02mol/L的PBS缓冲液）重悬后得河豚毒素单克隆抗体交联的胶乳颗粒。

[0059] D、河豚毒素浓缩样品提取液10×各组分及其浓度为：甲醇12g/L，乙酸3g/L，乙酸铵2g/L。

[0060] 本发明的试剂盒产品具体规格如下：组份名称 剂量
标准品×7瓶* 1ml/瓶
缓冲体系 50ml
检测液 15ml
河豚毒素浓缩样品提取液10× 50ml

[0061] 本发明的试剂盒产品：贮藏条件：保存试剂盒于2~8℃；保存期：该产品有效期为12个月。

[0062] 河豚毒素浓缩样品提取液10×使用时：用去离子水将河豚毒素浓缩样品提取液10×按1:9体积比进行稀释，即：1份河豚毒素浓缩样品提取液+9份去离子水，配好的样品提取液在4℃环境可保存一个月。

[0063] 样品提取方法为：

[0064] 河豚鱼冷冻样品，装于密封塑料袋中于流水下急速解冻，整体鱼用蒸馏水清洗后，用滤纸吸干，然后将鱼分解成肌肉、肝脏、肠道、皮肤、卵巢（雄性为精束）等部分，用蒸馏水洗去血污，再用滤纸吸干，分别将解剖后取得的样品剪碎，充分均质。称取上述均质样品1.0 g ± 0.02g于50 mL聚苯乙烯离心管中，加入样品提取液1mL，涡流混合3min；于4000rpm，离心10min，取50μL分析。

[0065] 样本中的河豚毒素与胶乳颗粒表面的抗体结合，相邻的胶乳颗粒彼此交联，使测