细胞组织胶黏剂

摘要

本发明提供一种与交联剂(cross‑linking agent)、阻停剂(quenching agent)的反应活性基团交联的细胞组织胶黏剂。

权利要求

1.一种低毒性的细胞组织胶黏剂，其特征是包括：

一个或多个基质分子(matrix molecule)，其与交联剂(cross-linking agent)产生交联；以及

阻停剂(quenching agent)，其与所述交联剂的官能基键合，其中：

所述交联剂是栀子素(genipin)；

所述阻停剂是聚-L-赖氨酸(poly-L-lysine)，其平均分子量大于20kDa；聚L-赖氨酸的当量浓度大于17.5mN。

2.如权利要求1所述的细胞组织胶黏剂，其中所述聚L-赖氨酸的平均分子量大于或等于99kDa。

3.如权利要求1所述的细胞组织胶黏剂，其中所述聚L-赖氨酸的平均分子量大于或等于212kDa。

4.如权利要求1所述的细胞组织胶黏剂，其中所述基质分子是选自胶原蛋白(collagen)、透明质酸(hyaluronan)、明胶(gelatin)、纤维连蛋白(fibronectin)、弹性蛋白(elastin)、细胞粘合素(tenacin)、基膜素(laminin)、玻连蛋白(vitronectin)、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)、软骨素(chondroitin)、硫酸软骨素(chondroitin sulfate)、角质素(keratan)、硫酸角质素(keratan sulfate)、硫酸皮肤素(dermatan sulfate)、卡拉胶(carrageenan)、肝素(heparin)、甲壳素(chitin)、几丁聚醣(chitosan)、海藻酸盐(alginate)、琼胶(agarose)、洋菜(agar)、纤维素(cellulose)、甲基纤维素(methyl cellulose)、羧甲基纤维素(carboxyl methyl cellulose)或肝醣(glycogen)中的一种或多种。

5.如权利要求1所述的细胞组织胶黏剂，其中所述基质分子是选自胶原蛋白、透明质酸或明胶。

6.如权利要求1所述的细胞组织胶黏剂，其中所述基质分子是胶原蛋白以及透明质酸。

7.如权利要求1所述的细胞组织胶黏剂，其中所述基质分子包含明胶。

8.如权利要求1所述的细胞组织胶黏剂，其还包括营养物质及生物活性剂(bioactive agent)。

9.如权利要求8所述的细胞组织胶黏剂，其中所述营养物质是细胞培养基。

10.如权利要求8所述的细胞组织胶黏剂，其中所述生物活性剂是生长因子，选自表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、纤维母细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、类胰岛素生长因子(insulin-like growth factor,IGF)、神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、群落刺激因子(colony-stimulating factor,CSF)、干细胞因子(stem cell factor,SCF)、角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor,KGF)、白血球生长因子(granulocyte colony-stimulating factor,GCSF)、巨噬细胞群落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor)、神经胶衍生神经滋养因子(glial derived neurotrophic factor,GDNF)、毛状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor)、内皮细胞单核细胞活性多肽(endothelial-monocyte activating polypeptide)、表皮中性球活性多肽(epithelial neutrophil  activating peptide)、红血球生成素(erythropoietin)、骨塑型蛋白(bone morphogenetic protein)、脑衍生神经滋养因子(brain-derived neurotrophic factor)、转换生长因子-β(transforming growth factor beta)、乳腺表现趋化因子(BRAK)或肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor)中的一种或多种。

11.如权利要求8所述的细胞组织胶黏剂，其进一步包括细胞源，该细胞源不包含人类胚胎干细胞。

说明书

细胞组织胶黏剂

[0001] 【先前技术】

[0002] 细胞组织胶黏剂因其粘合特性有着各式各样的应用，传统的胶黏剂多是使用交联剂为制成材料。然而，交联剂对生物体有毒性。则在细胞组织胶黏剂的使用时，必需予以降低交联剂的毒性。【发明内容】

[0003] 本发明是基于一个意外的发现，即一个细胞组织胶黏可借由与一交联剂产生交联，并包括一个阻停剂，能够结合该交联剂所表现之官能基，改善其边界强度和降低毒性。

[0004] 因此，本发明的特征在于一种细胞组织胶黏剂，包括︰一个或多个基质分子(matrix molecule)，其与一交联剂(cross-linking agent)产生交联，以及一阻停剂(quenching agent)，其键合于所述交联剂的一官能基。

[0005] 上述之一个或多个基质分子是选自于由胶原蛋白(collagen)、透明质酸(hyaluronan)、明胶(gelatin)、纤维连蛋白(fibronectin)、弹性蛋白(elastin)、细胞粘合素(tenascin)、基膜素(laminin)、玻连蛋白(vitronectin)、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)、软骨素(chondroitin)、硫酸软骨素(chondroitin sulfate)、角质素(keratan)、硫酸角质素(keratan sulfate)、硫酸皮肤素(dermatan sulfate)、卡拉胶(carrageenan)、肝素(heparin)、甲壳素(chitin)、几丁聚醣(chitosan)、海藻酸盐(alginate)、琼胶(agarose)、洋菜(agar)、纤维素(cellulose)、甲基纤维素(methyl cellulose)、羧甲基纤维素(carboxyl methyl cellulose)及肝醣(glycogen)所组成的群组，但不以此为限。在一实施例中，所述之基质分子包括胶原蛋白，透明质酸和明胶中的任一者。

[0006] 交联剂(cross-linking agent)通常有两个或以上之官能反应基，该官能基可相同或不相同。上述之交联剂是选自于含有环氧化物(epoxide)、二醛基(dialdehyde)、N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide ester)、碳二酰亚胺(carbodiimide)、栀子素(genipin)、核黄素(riboflavin)、类黄酮(flavonoid)、6-马来酰亚胺基己酸活性酯(6-maleimidohexanoic acid active ester)、琥珀酰亚胺辛二酸酯(disuccinimidyl suberate)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸叔丁酯(sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)及双(硫代琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(bis(sulfosuccinimidyl)suberate)所组成的群组，但不以此为限。所述之阻停剂是选自于含有二胺(diamine)、寡胺(oligoamine)、多胺(polyamine)、二羧酸(dicarboxylic acid)、寡羧酸(oligo-carboxylic acid)、聚羧酸(polycarboxylic acid)、多硫醇化合物(polysulfhydryl compound)、多羟基化合物(polyhydroxy compound)及含异双基(heterobifunctional)的化合物所组成的群组，但不以此为限。

[0007] 在一实施例中，所述交联剂是栀子素以及所述阻停剂是聚-L-赖氨酸(poly-L-lysine)。其中所述聚L-赖氨酸的平均分子量大于20kDa，最佳地，大于99kDa或大于212kDa。在另一实施例中，所述交联剂是乙二醇二缩水甘油醚(ethylene glycol diglycidyl ether)，所述阻停剂是水。在又一实施例中，所述交联剂是乙二醇二缩水甘油醚，所述阻停剂是聚赖氨酸(poly-lysine)或r-聚谷氨酸(r-polyglutamic acid)。

[0008] 本发明的细胞织胶黏剂进一步含有一营养物质(例如，细胞培养基)，生物活性剂，和/或细胞(例如，干细胞)。所述之生物活性剂可以是一生长因子，选自于由表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、纤维母细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、类胰岛素生长因子(insulin-like growth factor,IGF)、神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、群落刺激因子(colony-stimulating factor,CSF)、干细胞因子(stem cell factor,SCF)、角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor,KGF)、白血球生长因子(granulocyte colony-stimulating factor,GCSF)、巨噬细胞群落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor)、神经胶衍生神经滋养因子(glial derived neurotrophic factor,GDNF)、毛状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor)、内皮细胞单核细胞活性多肽(endothelial-monocyte activating polypeptide)、表皮中性球活性多肽(epithelial neutrophil activating peptide)、红血球生成素(erythropoietin)、骨塑型蛋白(bone morphogenetic  protein)、脑衍生神经滋养因子(brain-derived neurotrophic factor)、转换生长因子-β(transforming growth factor beta)、乳腺表现趋化因子(BRAK)及肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor)所组成的群组。

[0009] 本发明亦提供一种植入细胞(例如干细胞)于一个体的方法，包括︰(i)提供一种细胞植入物(cell implant)，所述细胞植入物包含如上所述的细胞组织胶黏剂及一细胞源；以及(ii)将所述植入物植入于该个体。进一步在本发明的范围内，是利用细胞组织胶黏剂于制造细胞传递使用的植入物单元。

[0010] 本发明于以下的描述，进一步就多个实施例之细节进行说明，系可显而知悉其发明特征与优点。【具体实施方式】

[0011] 本发明提供一种可用于细胞生长的生物兼容性细细胞组织胶黏剂。包含一个或以上的基质分子(见下文)，其与一交联剂产生交联，以及一阻停剂，其键合于所述交联剂的一官能基。本发明的细胞组织凝胶进一步包括一营养物质(例如，细胞培养基)，生物活性剂，和/或细胞(例如，干细胞)。

[0012] 基质分子

[0013] 基质分子(例如，高分子化合物)帮助细胞保持在一植入部位，为一于细胞外基质中的细胞外分子，于此所指涉者例如:胶原蛋白、透明质酸、明胶、纤维连蛋白，弹性蛋白，细胞粘合素、基膜素，玻连蛋白，多肽，硫酸乙酰肝素，软骨素，硫酸软骨素，硫酸角质素，硫酸角质素，硫酸皮肤素，角叉菜胶，肝素，几丁质，脱乙酰壳多醣，藻酸盐，琼脂糖，琼脂，甲基纤维素，甲基纤维素，羧甲基纤维素，糖原或其衍生物,但不限于此。此外，基质分子亦可以是纤维蛋白，纤维蛋白原，凝血酶，及聚谷氨酸，合成聚合物(例如，丙烯酸酯，聚乳酸，聚乙醇酸，或聚(乳酸-共-乙醇酸)，最佳的，本发明中所使用的应用于组织凝胶的基质分子的高分子量物质，以提高凝胶的粘度。

[0014] 任何天然存在的胶原蛋白或其其官能变体(functional variants)，都可用于制备本发明的组织胶。目前，至少已发现28种不同基因物种之胶原蛋白。胶原蛋白可以简单的从人类或动物的富含胶原蛋白组织(如皮肤、肌腱、韧带和骨组织)中分离、纯化出来。分离纯化胶原蛋白方法于此领域中已是众所周知。(可参照例如︰美国专利5,512,291、美国专利申请公开20040138695号公报、Methods in Enzymology,vol.82,pp.33-64,1982、The Preparation of Highly Purified Insoluble Collagen,Oneson,I.,et al着、Am.Leather Chemists Assoc.,Vol.LXV,pp.440-450,1970、美国专利6,090,996)。胶原蛋白亦能使用重组技术制备，如在Advanced Tissue Sciences(La Jolla,Calif.)所描述的，或从不同的供货商购得(如Fibrogen；South San Francisco,Calif.)。以下是一实施例：牛深屈肌腱，除去脂肪及筋膜后用水洗涤，冻结，并以切片器切成0.5毫米(mm)薄片。先将适量切片肌腱用50毫升(mL)的水在室温下萃取24小时。丢弃水溶性部分，然后切片过的肌腱与酸性溶液(如0.2N盐酸)在适当的温度(如室温)下萃取一段适当的时间(如12小时至24小时)。盐酸溶液丢弃后用水来洗去残留在肌腱上的酸液。冲洗过的肌腱使用碱性溶液(如0.75M氢氧化钠)在适当的温度(如室温)进行萃取一段适当的时间(如12小时至24小时)。之后移除碱性溶液，使用酸性溶液(如0.1N盐酸)来中和切片肌腱直到pH值为4至7(如pH 5)，接着重复使用水来洗去残余在肌腱的碱液。之后将肌腱使用醇类(如异丙醇)来于室温中脱脂一段足够的时间(如16小时)。将萃取物倒出并且使用醇类(如异丙醇)于室温中对肌腱作进一步萃取一段时间(如12小时至24小时)，形成含胶原蛋白的溶液，胶原蛋白的溶液在干净的抽风柜中干燥。因此形成的胶原蛋白粉可以溶散于酸性溶液(如0.5M或0.25M醋酸)中，在含有蛋白水解酶(如胰蛋白酶或胃蛋白酶)的存在下于4℃中反应一段适当的时间。使用
100目之不锈钢网筛来过滤混合物，并可以使用5％食盐水使可溶性胶原蛋白沈淀，沈淀出的胶原蛋白可用上述的酸性溶液再溶解，因此形成的溶液可以使用100目不锈钢网筛来过滤，以移除不溶微粒。然后此胶蛋白溶液于纯水中透析来除去溶液中的酸。

[0015] 本发明所叙之透明质酸泛指天然存在的阴离子型，非硫酸化的糖胺聚醣(glycosaminoglycan)，包括N-乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine)和D-葡糖醛酸(D-glucuronic acid)的复二糖单元，以及它的衍生物。透明质酸可以从天然物中分离出来，如囊状链球菌、鸡冠、软骨、滑膜关节液、脐带、皮肤组织和眼睛的玻璃体，藉由诸如Guillermo Lago et al.Carbohydrate Polymers 62(4):321-326,2005及Ichika Amagai et al.Fisheries Science 75(3):805-810,2009所述之现有技术方法。或者，可向商业的供货商，例如Genzyme Corporation、Lifecore Biomedical,LLC以及Hyaluron Contract Manufacturing购买。天然的透明质酸的衍生品包括但不限于下列透明质酸酯(hyaluronan esters)、己二酸二酰肼-修饰透明质酸(adipic dihydrazide-modified hyaluronan)、透明质酸酰胺产品(hyaluronan amide products)、交联透明质酸(crosslinked hyaluronic acid)、半脂丁二酸(hemiesters of succinic acid)或透明质酸之重金属盐类、部分或全脂化透明质酸、硫化透明质酸(sulphated hyaluronic acid)、N-硫化透明质酸(N-sulphated hyaluronic acid)及胺或二胺修饰透明质酸。透明质酸衍生物亦可藉由一个以上之官能基化学修饰而获得，其中该官能基包括，但不限于羧酸基(carboxylic acid group)、羟基(hydroxyl group)、还原性端基(reducing end group)及N-乙酰基(N-acetyl group)其中羧酸基的修饰反应可藉由碳二酰亚胺(carbodiimide)及双酰肼(bishydrazide)之催化或酯化反应(esterification)来修饰；其中羟基的修饰反应，包括但不限于硫酸化(sulfation)、酯化、异脲耦合(isourea coupling)，溴化氰活化(cyanogen bromide activation)及高碘酸氧化(periodate oxidation)；还原性端基可藉由还原胺化(reductive amination)以修饰还原性端基。透明质酸也可连结于磷脂质、染料(如荧光基团或发色团)以及用以制备亲核性基质的试剂。天然的透明质酸之衍生物也可以借着使用交联剂、分子内酯化(internal esterification)、光交联反应(photocross-linking)或表面电浆处理(surface plasma treatment)而获得，其中使用之交联剂包括，但不限于双环氧化物(bisepoxide)、二乙烯砜(divinylsulfone)、双碳二亚胺(biscarbodiimide)、分子较小的双官能基架桥剂、甲醛(formaldehyde)、异氰酸环己酯(cyclohexyl isocyanide)、离胺酸乙酯(lysine ethyl ester)、金属阴离子、酰肼(hydrazide)或上述之组合。

[0016] 目前已显示透明质酸，特别是高分子量的透明质酸(即大于5kDa)，可有效地促进血管新成，进而促进伤口愈合。例如美国暂时申请案61/390,789，透明质酸之分子量是50kDa至5,000kDa(如70kDa至1,500kDa、200kDa至1,500kDa、500kDa至1,500kDa或700kDa至
1,500kDa)。

[0017] 进一步，系显示干细胞表现出存活率的改善，当其生长在一含有胶原蛋白和透明质酸于0.01-100(胶原蛋白)：1(透明质酸)重量比的细胞组织胶黏剂。参见美国专利12/974535号公报。在制作本发明所描述之细胞组织胶黏剂，透明质酸之浓度可以是每毫升
0.001至100mg/mL(如:0.01至1mg/mL)；胶原蛋白之浓度可以是0.001至100mg/mL。较佳的，胶原蛋白之浓度为0.1至100mg/mL，透明质酸之浓度是0.01-35mg/mL。更佳的，胶原蛋白之浓度是3-75mg/mL(如6mg/mL或9mg/mL)，透明质酸之浓度是0.2-20mg/mL。

[0018] 交联剂

[0019] 交联剂得与目标分子反应并与目标分子交联在一起，且该交联剂通常包含至少两个可与目标分子之官能基反应的官能反应基，表1列举了官能反应基和官能基，交联剂与官能基为现有技术所熟知。

[0020] 本发明所使用之交联剂可以包括，但不限于亚胺酯(imidoester)、环氧化物(epoxide)[如:乙二醇二环氧丙基醚(ethylene glycol diglycidyl ether)]、戊二醛(glutaraldehyde)、N-羟基丁二酰亚胺酯(N-hydroxysuccinimide ester)[如:2,3-二溴丙酰N-羟基丁二酰亚胺酯(2,3-dibromopropionyl-N-hydroxysuccinimide ester)、磺酸基-N-羟基丁二酰亚胺酯(sulfo-N-hydroxysuccinimide ester)及苯丁酸氮芥N-羟基丁二酰亚胺酯(chlorambucil-N-hydroxysuccinimide ester)]、碳二酰亚胺(carbodiimide)[如:1-乙基-3-[3-二甲氨基]碳二酰亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)]、栀子素(genipin)、马来酰亚胺(maleimide)、迭氮(azide)、卤代乙酰(haloacetyl)、吡啶二硫化物(pyridyl disulfide)、酰肼(hydrazide)、黄素(riboflavin)、生物类黄酮(bioflavonoid)、核类黄酮(flavonoid)及其衍生物[如:原花青素(proanthocyanidin),儿茶素(catechin),表儿茶素(epicatechin),表没食子儿茶素(epigallo catechin),表儿茶素没食子酸酯(epicatechin gallate),没食子儿茶素没食子酸(epigallocatechin gallate),槲皮素(quercetin),查耳酮素(chalcones),芹菜素(apigenin),luteoiin,a polymethoxylated fiavone,quercitoi,山奈酚(kaempferol),杨梅素(myricetin),花青素(anthocyanin),resveritrol,an isoflavanoid,大豆甙元(daidzein),genestiein,川陈皮素(nobiletin),橘皮(tangeretin)及鞣酸(tannic acid)]、6-(马来酰亚胺基)己酸活性酯(6-maleimidohexanoic acid active ester)、双琥珀亚胺酰辛二酸酯或根(disuccinimidyl suberate)、双琥珀酰亚胺辛二酸酯[bis(sulfosuccinimidyl)suberate]、迭氮化物(azide)、双吖丙啶(diazirine)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯[sulfosuccinimidyl-4-(N-
maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate]及其衍生物。该交联剂也可以是一聚丙烯酸钠包含多种相同或不同官能反应基,如聚环氧化合物(polyepoxy compound)及聚(羟基酸)(poly(hydroxy acid))。

[0021] 表1.反应基团与及目标官能基团

[0022]

[0023]

[0024] 阻停剂

[0025] 阻停剂于此所指涉者是与交联剂反应基团反应的试剂，当目标分子与交联剂交联后，阻停剂可与未和目标官能反应基团反应的交联剂反应基团发生反应。借着「耗尽」未反应的反应基团，阻停剂可以完全或部分减少交联剂的毒性。阻停剂可以是一个化合物，包含胺(amine)、巯基(sulfhydryl)、羰基(carbonyl)、乙二醇(glycol)、羧基(carboxyl)、迭氮化物(azide)或光交联基团(photo-crosslinking group)。换句话说，阻停剂包含一官能基系可与该交联剂之官能反应基反应。在一实施例中，当交联剂是含有与胺基反应之基团，阻停剂包含但不限于双胺(diamines),寡胺(oligoamines)和聚胺(polyamines)如多聚赖氨酸(polylysine)及多聚谷氨酰酸(polyglutamine)。在另一实施例中，当交联剂是含有与羧基反应之基团，阻停剂包含二元羧酸、寡羧酸或聚羧酸如聚谷氨酸盐(polyglutamate或polyglutamate acid)。其他实施例之阻停剂包括可以用于抑制的巯基反应基的含polysulfhydryl化合物，及可用于抑制的羟基反应基的含多羟基的化合物。

[0026] 营养物质

[0027] 营养物质于此所指涉者是细胞生长必需的营养来源，其是胺基酸、维生素、矿物质、碳源(如葡萄糖)、脂肪酸或上述的混合物。在一实施例中，所述之营养物质是细胞培养基，其包括但不限于最小必须培养基(Minimum Essential Medium,MEM)、基础依格培养基(Basal Medium Eagle,BME)、杜氏改良英格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's medium,DMEM)、营养混合培养基(Ham's Nutrient Mixtures F-10或F-12)、培养基199(Medium 199)、罗斯微公园研究所培养基(Roswell Park Memorial Institute medium,RPMI medium)、安姆氏培养基(Ames'Medium)、BGJb  Medium(Fitton-Jackson Modification)、克利克培养基(Click's Medium)、CMRL-1066Medium、费雪培养基(Fischer's Medium)、格拉斯哥最小必需培养基(Glasgow Minimum Essential Medium)、Iscove's Modified Dulbecco's Medium、L-15Medium、McCoy's 5A Modified Medium、NCTC Medium、Swim's S-77Medium、Waymouth Medium或William's Medium E。

[0028] 生物活性剂

[0029] 任何试剂(如胜肽、多胜肽、寡醣、多醣或小分子)，可增进细胞存活能力，提升细胞增生能力或诱导细胞分化都可提供本发明之细胞组织胶黏剂使用。在一实施例中，所述之生化活性分子是生长因子，其包括表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、纤维母细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、类胰岛素生长因子(insulin-like growth factor,IGF)、神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、群落刺激因子(colony-stimulating factor,CSF)、干细胞因子(stem cell factor,SCF)、羟色胺(serotonin)及血管性血友病因子(von Willebrand factor)、转化生长因子(transforming growth factor)、角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor,KGF)、白血球生长因子(granulocyte colony-stimulating factor,GCSF)、巨噬细胞群落刺激因子(granulocyte macrophage  colony-stimulating  factor)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte/macrophage colony stimulating factor)、神经胶衍生神经滋养因子(glial derived  neurotrophic factor,GDNF)、毛状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor)、内皮细胞单核细胞活性多肽(endothelial-monocyte activating polypeptide)、表皮中性球活性多肽(epithelial neutrophil activating peptide)、红血球生成素(erythropoietin)、塑型蛋白(bone morphogenetic protein)、骨脑衍生神经滋养因子(brain-derived neurotrophic factor)。在另一实施例中，该生化活性分子是一细胞素/化学趋化激素(cytokines/chemokine)，其包括但不限于IL-2、胸腺表现化学趋素(breast-expressed chemokine,BRAK)、肾表现化学趋化激素(kidney-expressed chemokine,CXCL14)或上述物质之组合物。该生化活性分子是一细胞分化因子，如:人工合成皮质类固醇(dexamethasone)、丙酮酸钠(sodium pyruvate)、维生素C磷酸盐(ascorbic acid-2-phosphate)、维生素A酸(retinoic acid)、脯胺酸(proline)、胰岛素(insulin)、运铁蛋白(transferrin)、亚硒酸(selenous acid)、亚油酸(linoleic acid)、牛血清白蛋白(bovine Serum Albumin)、转换生长因子-β3(transforming growth factor beta 3,TGF-β3)。在又一实施例中，该分化因子为可促进间叶干细胞的软骨生成的化合物(参见于美国专利5,908,784公报所揭露之内容)、骨新生[如地塞米松(dexamethasone)、维生素C(ascorbic acid)、β-磷酸甘油(β-glycerol phosphate)]、脂肪生成[如胰岛素(insulin)、异丁基甲基黄嘌呤(isobutylmethylxanthine)、地塞米松(dexamethasone)、引朵美洒辛(indomethacin)]、心肌分化[如激活素A(activin A)、骨形态生成蛋白4(bone morphogenetic protein-4,BMP-4)]、内皮细胞分化[如内皮细胞(EBM-2)、地塞米松(dexamethasone)以及血管内皮生长因子(VEGF)]、平滑肌细胞分化[如血小板衍生生长因子(PDGF)]、神经诱导[如碱性纤维母细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、表皮生长因子(EGF)、B27supplement、二甲基亚砜(DMSO)、丁基羟基甲氧苯(butylated hydroxyanisole)、锦紫苏素(forskolin)、丙戊酸(valproic acid)、氯化钾、K252a以及N2supplement]和内胚层谱是分化(endodermal lineage differentiation)[如地塞米松、肝细胞生长因子(HGF)和纤维母细胞生长因子-4(FGF-4)]。在更佳的实施例中，生化活性分子是中草药或是中草药之有效成分。

[0030] 细胞嵌入式组织胶黏剂的制备

[0031] 本文所述之组织胶黏剂的制备，可以通过将上述材料以特定之重量比混合及维持于合适的条件促使混合物形成组织胶黏剂。而制备一细胞嵌入式组织胶黏剂，细胞源可在胶黏剂形成之前与胶黏剂的组成物混合。细胞源可以是由哺乳类动物(如:牛，猪，鼠，马，犬，猫，羊，猴和人)所获得的干细胞。在一实施例中,所述之细胞，其包括但不限于胎盘来源干细胞(placenta-derived stem cells)、骨髓干细胞(bone marrow-derived stem cells)、基质细胞(stromal cells)[如:脂肪基质细胞(dipose-derived stromal cells)]、间充质干细胞(mesenchymal stem cells)、组织源细胞(tissue progenitor cells)、母细胞(blast cells)或成纤维细胞(fibroblasts)

[0032] 前述之细胞组织胶黏剂与细胞源结合所形成之细胞植入物可被植入至人体之位置，以进行组织修复和其它的治疗目的。

[0033] 本领域的技术人员可以根据上面的描述，将本发明利用至最大限度。系提出一具体实施方式，仅为说明性的解释，而不限制公开内容的其余部分。本文引用的所有参考文献都通过引用并入本文。

[0034] 实施例:含有聚-L-赖氨酸交联剂的细胞组织胶黏剂

[0035] (A)材料与方法

[0036] 此处所使用之阻停剂包括精胺(spermine)、鱼胺类(protamine)、1-6己二胺(1,6-hexanediamine)，聚L-赖氨酸则是不同组别的分子量。聚L-赖氨酸的平均分子量分别为3.4kDa、20kDa、99kDa、212kDa以及225kDa。

[0037] 将等当量的聚L-赖氨酸与300mg/mL之明胶在磷酸盐缓冲液中混合，以形成聚L-赖氨酸-明胶溶液，再将等体积且浓度为20mg/mL的栀子素溶液与上述的聚胺-明胶溶液混合以形成细胞组织胶黏剂，再加到猪皮样品[其尺寸大小是10x30x0.7至0.9立方毫米(mm3)]的真皮侧。两片猪皮样品以真皮面相对，中间为细胞组织胶黏剂(10x 10mm2)，将50克重的砝码放在两片猪皮样品的上方30分钟，并以LRX材料测试是统(Lloyd Instruments Ltd.,England)以每分钟10厘米(mm/min)速率的拉力下，分离两片猪皮样品以测试细胞组织胶黏剂的链接强度。

[0038] 将10μL之细胞组织胶黏剂加入24孔盘之培养皿中央，再种入2x104个细胞/孔(cell/well)之纤维母细胞，并培养于5％二氧化碳(CO2)、37℃环境下历经38小时。存活的细胞数量由血球计数板来定量，进行毒性评估的测量。

[0039] 藉由RheoStress RS 150(Haake,Germany)可测量含有及未含聚L-赖氨酸的细胞组织胶黏剂的流变性质，并实时记录弹性储存模数(elastic storage modulus,G')及反应温度于固定剪应力(fixed shear stress)为1帕(Pa)以及频率为1赫兹(Hz)之震荡测试条件下之数据。

[0040] (B)链接强度测试

[0041] 结果显示当聚L-赖氨酸的分子量高于20kDa时可增进细胞组织胶黏剂的链接强度，选用分子量为212kDa的聚L-赖氨酸做进一步研究，且含有聚L-赖氨酸的细胞组织胶黏剂的链接强度会随着聚L-赖氨酸浓度的上升而增强，直到聚L-赖氨酸浓度高达46.8mN。对于使用17.5mN聚L-赖氨酸制成的细胞组织胶黏剂以及未使用聚L-赖氨酸的胶黏剂进行的研究显示，含有聚L-赖氨酸的细胞组织胶黏剂之链接强度的最大值大于未使用聚L-赖氨酸的细胞组织胶黏剂。

[0042] 无论栀子素的浓度，随着聚L-赖氨酸含量的升高，细胞组织胶黏剂的链接强度将上升；此外，连结强度也随着栀子素浓度的提高而增强。

[0043] (C)毒性评估

[0044] 无聚L-赖氨酸的细胞组织胶黏剂的毒性随着栀子素浓度的上升而提高。加入聚L-赖氨酸可显着的减少栀子素的毒化效应。当使用7.5mg/mL的栀子素与46.8mN的聚L-赖氨酸时，观察不到显着的细胞毒性效应(cytotoxic effect)。

[0045] (D)流变性质(rheological properties)

[0046] 为了进一步理解聚L-赖氨酸对胶黏剂的物理和化学性质的影响，弹性储存模数(G’)(the elastic storage modulus)的数值被实时监控测定。经过固定剪应力(fixed shear stress)(1Pa)和频率(1Hz)的振动试验，试验结果显示，弹性储存模数(G’)的数值随着细胞组织胶黏剂从液态的形成而增加。弹性储存模数(G’)的数值随着聚L-赖氨酸加入到细胞组织胶黏剂中而显着提高。弹性储存模数之数值在不同反应温度的变化中侦测，并且当反应在50℃下进行，反应时间为90分钟时显示弹性储存模数的数值有急剧的上升。此相转移现象显示聚L-赖氨酸参与了细胞组织胶黏剂的交联反应，并且增加了细胞组织胶黏剂的弹性储存模数。不添加聚L-赖氨酸时则没有观察到相转移现象。

[0047] 【其他实施方式】

[0048] 所有在说明书中公开之特征可以由任何形式进行组合。在说明书中公开的每个特征可被用于相同，等效或类似目的的替代特征所置换。因此，除非另有说明，否则每个公开之特征仅是一般系列的等效或类似特征的一个实施例。

[0049] 从上面的描述，本领域技术人员可以容易地确定本发明的必要特征，并且不脱离本发明精神和范围出发进行各种改变，使其适用于不同用途和条件。因此，其它实施例也在权利要求中。