用于提供唾液酸化寡糖的方法

摘要

本发明涉及用于提供人乳寡糖(HMO)之类似物，特别是包含末端唾液酸之寡糖的方法。所述方法包括以下步骤：a)提供含有至少两个末端结合的b‑连接半乳糖残基的不可消化的低聚半乳糖(GOS)源；b)提供具有(a2‑3)‑唾液酸化O‑聚糖的唾液酸供体；c)在酶反应混合物中，在具有转唾液酸酶活性之酶的存在下，使所述GOS与所述唾液酸供体接角；以及d)从所述酶反应混合物分离级分，其包含基于干物质按重量计至少20％的双唾液酸化低聚半乳糖(双‑Sia‑GOS)。

权利要求

1.用于提供包含含有唾液酸之寡糖的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供含有至少两个末端结合的β-连接半乳糖残基的不可消化的低聚半乳糖(GOS)源；

b)提供具有(α2-3)-唾液酸化O-聚糖的唾液酸供体；

c)在酶反应混合物中，在具有转唾液酸酶活性之酶的存在下，使所述GOS与所述唾液酸供体接触；以及d)从所述酶反应混合物获得级分，其包含基于干物质按重量计至少5％的双唾液酸化低聚半乳糖(双-Sia-GOS)。

2.根据权利要求1的方法，其中所述低聚半乳糖源通过用β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)对乳糖或者乳糖与海藻糖的混合物进行酶处理来获得。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述双-Sia-GOS的聚合度(DP)为DP4至DP10。

4.根据权利要求3的方法，其中所述双-Sia-GOS的聚合度(DP)为DP5至DP8。

5.根据权利要求1或2的方法，其中所述唾液酸供体是天然存在的化合物。

6.根据权利要求5的方法，其中所述唾液酸供体选自与寡糖结合的唾液酸、多糖、多聚唾液酸、糖蛋白和糖脂。

7.根据权利要求5的方法，其中所述唾液酸供体选自糖基化的乳清蛋白和酪蛋白，及其片段。

8.根据权利要求7的方法，其中所述唾液酸供体为来自κ-酪蛋白的糖巨肽(GMP)。

9.根据权利要求5的方法，其中所述唾液酸供体选自糖基化的黏液蛋白质及其片段。

10.根据权利要求9的方法，其中所述唾液酸供体为猪小肠糖蛋白(PSMG)。

11.根据权利要求9的方法，其中所述唾液酸供体从黏蛋白获得。

12.根据权利要求11的方法，其中所述唾液酸供体在随后浓缩含有Sia的黏蛋白多聚体后获得。

13.根据权利要求1或2的方法，其中所述具有转唾液酸酶活性之酶由来自锥虫(Trypanosoma)属之微生物的基因产物编码。

14.根据权利要求13的方法，其中所述具有转唾液酸酶活性之酶由来自克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)或刚果锥虫(Trypanosoma congolense)的基因产物编码。

15.根据权利要求1或2的方法，其中所述酶是重组产生的。

16.根据权利要求1或2的方法，其中所述酶反应混合物的pH为4至6。

17.根据权利要求16的方法，其中所述酶反应混合物的pH为4.8至5.8。

18.根据权利要求1或2的方法，其中所述步骤d)包括基于待分离组分之间电荷差异的分离技术。

19.根据权利要求18的方法，其中所述步骤d)包括阴离子交换色谱。

20.根据权利要求1或2的方法，其中所述步骤d)包括基于待分离组分之间尺寸差异的分离技术。

21.根据权利要求20的方法，其中所述步骤d)包括尺寸排阻色谱。

22.组合物，其包含按重量计至少5％的可通过根据权利要求1-21中任一项所述的方法获得的双唾液酸化低聚半乳糖。

23.根据权利要求22的组合物，其包含至少7wt％的双唾液酸化低聚半乳糖。

24.根据权利要求23的组合物，其包含至少10wt％的双唾液酸化低聚半乳糖。

25.根据权利要求22至24中任一项的组合物，其包含选自以下的一种或更多种双-Sia-GOS种类：Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-4)Glc(α1-1β)Gal(3-2α)Neu5AcNeu5Ac(α2-3)Gal(β1-2)[Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-6)]GlcNeu5Ac(α2-3)Gal(β1-3)[Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-6)]Glc，Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-4)[Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-6)]GlcNeu5Ac(α2-3)Gal(β1-2)[Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-4)]GlcNeu5Ac(α2-3)Gal(β1-4)Gal(β1-4)Glc(α1-1β)Gal(3-2α)Neu5AcNeu5Ac(α2-3)Gal(β1-4)Glc(α1-1β)Gal(4-1β)Gal(3-2α)Neu5AcNeu5Ac(α2-3)Gal(β1-4)Gal(β1-4)Gal(β1-4)Glc(α1-1β)Gal(3-2α)Neu5AcNeu5Ac(α2-3)Gal(β1-4)Gal(β1-4)Glc(α1-1β)Gal(4-1β)Gal(3-2α)Neu5AcNeu5Ac(α2-3)Gal(β1-4)Glc(α1-1β)Gal(4-1β)Gal(4-1β)Gal(3-2α)Neu5AcNeu5Ac(α2-3)Gal(β1-4)Gal(β1-4)Gal(β1-4)Gal(β1-4)Glc(α1-1β)Gal(3-2α)Neu5AcNeu5Ac(α2-3)Gal(β1-4)Gal(β1-4)Gal(β1-4)Glc(α1-1β)Gal(4-1β)Gal(3-2α)Neu5AcNeu5Ac(α2-3)Gal(β1-4)Gal(β1-4)Glc(α1-1β)Gal(4-1β)Gal(4-1β)Gal(3-2α)Neu5AcNeu5Ac(α2-3)Gal(β1-4)Glc(α1-1β)Gal(4-1β)Gal(4-1β)Gal(4-1β)Gal(3-2α)Neu5Ac。

26.根据权利要求22至24中任一项的组合物，其用作营养添加剂、药物添加剂或营养食品添加剂。

27.营养产品，其包含根据权利要求22至26中任一项的组合物。

28.根据权利要求27的营养产品，其中所述营养产品是婴儿配方奶粉。

29.动物饲料产品，其包含根据权利要求22至26中任一项的组合物。

30.根据权利要求29的动物饲料产品，其中所述动物饲料产品配制成用于小猪或牛犊。

31.用于提供婴儿配方奶粉的方法，其包括根据权利要求1-21中任一项的方法分离包含基于干物质按重量计至少5％的双唾液酸化低聚半乳糖(双-Sia-GOS)的级分，并且将所述级分与蛋白质源、脂肪源和碳水化合物源一起配制成婴儿配方奶粉。

32.根据权利要求22至24中任一项的组合物，其用于在有此需要的对象中治疗或预防病原体感染的方法中。

33.根据权利要求32的组合物，其中所述对象为人对象。

34.根据权利要求32的组合物，其中所述对象为早产儿。

35.根据权利要求32的组合物，其中所述病原体是细菌或原生动物。

36.根据权利要求35的组合物，其中所述病原体是溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)。

37.根据权利要求32的组合物，其用于治疗或者预防阿米巴病或坏死性小肠结肠炎(NEC)。

说明书

用于提供唾液酸化寡糖的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及用于提供人乳寡糖(human milk oligosaccharide，HMO)之类似物(特别是包含末端唾液酸(terminal sialic acid)的寡糖(下文中：含有唾液酸的寡糖)，特别是唾液酸化低聚半乳糖(Sia-GOS))的方法。此外，本发明涉及可获得的唾液酸化寡糖及其在特别是婴儿食品和动物饲料中的用途。

[0002] 人乳包含大量和多样(＞100种结构)的具有不同生理功能的寡糖，包括例如益生组分和用于病原微生物的抗黏附组分。特别是含有唾液酸的寡糖(SOS)示出在小肠中抑制病原微生物(包括大肠杆菌(E.coli)和沙门氏菌(Salmonella)属)的黏附。SOS在人乳中丰富地存在(0.6至3.3g/l)并且在泌乳之最初阶段的乳(初乳)中甚至可以达到更高的浓度。然而在牛奶中，SOS仅以非常小的量存在。因此，人乳和基于牛奶的婴儿配方奶粉(infant formula)之间在SOS的丰度方面有很大的差异。

[0003] 在人乳的唾液酸化寡糖中，N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)经通过唾液酸转移酶的作用形成的α2-3或α2-6键连接至倒数第二个半乳糖残基或者经α2-6键连接至内部的N-乙酰葡糖胺残基。多种病原微生物(例如霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)以及流感病毒A和B)识别靶细胞上含有唾液酸的糖类受体；因此人乳中的唾液酸化成分可以发挥可溶性受体类似物的作用以抑制这些病原体对细胞表面受体的附着。已经提出唾液酸用于婴儿脑神经节苷脂和唾液酸化糖蛋白的合成。人乳对于婴儿是唾液酸之丰富来源的事实表明产后第一个月期间脑神经节苷脂的快速形成依赖于乳唾液酸化寡糖和唾液酸化糖缀合物(sialylglycoconjugate)的代谢利用。

[0004] 既然作为一项准则，目的是让婴儿和幼儿食品尽可能地类似于人乳，一些研究者认识到需要(特别是婴儿乳制剂)用含有唾液酸的寡糖充实这类食品。

[0005] 注意力已经主要集中在唾液乳糖(sialyllactose)，因为与其他哺乳动物相比，这些在人乳中以明显更高的浓度存在。已知唾液乳糖对特定的病原菌具有抗黏附性能。例如，唾液乳糖在体外发挥抑制霍乱毒素的作用(Idota等，Biosci.Biotech.Biochem.59：417-419，1995)并抑制幽门螺杆菌(Simon等，Infection and Immunity65：750-757，1997)。

[0006] 鉴于其抗黏附性质，唾液乳糖已经用于治疗或预防多种医学病症。例如，US5,260,280公开了组合物，其包含中和细菌肠毒素之作用的含有唾液酸的寡糖。US5,514,660、US5,
753,630和US5,883,079公开了通过施用有效量的含有唾液酸的寡糖分别用于在胃或十二指肠中治疗或预防溃疡或者抑制幽门螺杆菌感染的方法。US5,620,965涉及组合物，其用于通过施用有效量的某些寡糖来抑制细菌幽门螺杆菌与胃或十二指肠细胞的结合。US5,834,
423描述了促进双歧杆菌之增殖的唾液酸衍生物以及有效量的某些唾液酸化寡糖作为止泻剂的用途。该唾液酸化寡糖包括3′-唾液乳糖和6′-唾液乳糖(唾液酸＝Neu5Ac)。
WO2001060346公开了营养组合物，其包含益生物质低聚果糖和唾液乳糖，其协同地刺激有益的双歧杆菌的生长。WO01/60346公开了营养组合物，例如婴儿配方奶粉，其包含低聚果糖和唾液乳糖。EP1549151描述了低聚果糖、唾液乳糖和益生菌的组合根除病原菌(特别是致肠病的大肠杆菌)的肠道感染，因此可以用于预防致肠病的大肠杆菌引起的腹泻。
US20070104843涉及来自乳的唾液乳糖浓缩物，其用于食品(特别是针对婴儿、儿童或老年人的食品)以及用于医疗或饮食目的的食品和其他食品应用。它还公开了用于生产所述唾液乳糖浓缩物的方法，其包括对含有天然唾液乳糖的乳产品进行超滤，随后对超滤渗余物进行渗滤。本申请人的WO2009/113861涉及用于从乳流(尤其是从乳清流)分离含有唾液酸之寡糖(特别是唾液乳糖)的方法。所述方法生产具有高含量之唾液乳糖和低含量之磷化合物的产品。这种产品高度适合用于补充婴儿食品。WO2010/116317涉及唾液酸化寡糖(特别是6′-唾液乳糖及其盐)的合成方法，其包括在允许其以工业规模使用的条件下通过柯尼希斯-克诺尔(Koenigs-Knorr)反应结合的步骤。

[0007] Thurl等(British J.Nutr.104：1261-1271，2010)报道了在泌乳的前三个月期间获得的大量人乳样品的乳寡糖组成的详细研究。所分析的唾液酸化寡糖为3′-唾液乳糖(3′-SL)、6′-唾液乳糖(6′-SL)、唾液酸-乳酸-N-四糖a-c(LSTa-c)和双唾液酸乳酸-N-四糖(DSLNT)。发现除了唾液乳糖，DSLNT是最主要的唾液酸化寡糖。产后15天DSLNT表现出最大时间曲线。Asakuma等(Biosci.Biotechnol.Biochem.，71：1447-1451，2007)研究了泌乳的头三天期间人初乳中唾液酸化寡糖的浓度改变。在所测定的初乳唾液酸化寡糖中，LSTc以最高浓度存在，随后是DSLNT、3′-SL和6′-SL。

[0008] 因此，本发明的一个目标是提供用于制造(人工)双唾液酸化寡糖的方法，所述双唾液酸化寡糖可用作双唾液酸化HMO’s的类似物。优选地，所述方法可容易地扩大规模以以工业规模生产双唾液酸化寡糖。有益地，所述方法使用相对便宜的来自其他种类产业(例如肉或乳业)的副产品。

[0009] 出人意料地发现，通过用唾液酸修饰低聚半乳糖(GOS)可满足以上目标。GOS是含有多个半乳糖(Gal)单位(DP为2至9)的寡糖，并且通过酶β-半乳糖苷酶由乳糖合成。GOS以工业规模生产并且应用于多种终端产品，例如婴儿配方奶粉和基于乳品的饮料。因为GOS不在人小肠中降解，它们大部分完整地到达结肠，在这里它们作为益生物(prebiotic)刺激益生菌(例如乳杆菌和双歧杆菌)的生长。GOS中Gal/Gal键合类型为(β1-2)、(β1-3)、(β1-4)和/或(β1-6)，取决于所使用的β-半乳糖苷酶的来源。在β-半乳糖苷酶来自产生Vivinal GOS(FrieslandCampina Domo)的环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)的情况下，存在于还原的直链或支链寡糖中的主要的Gal/Gal键合类型为(β1-4)和次要程度的(β1-3)和(β1-6)(表1)。GOS的葡萄糖部分还可以经(α1-1β)键与Gal部分连接，其可进一步用另外的Gal残基延伸(Fransen等，Carbohydr.Res.314：101-114，1998)。本发明人意识到还原的支链寡糖和非还原的直链寡糖二者产生拥有两个末端Gal单元并因此具有两个非还原端的GOS分子，其各自可用唾液酸残基修饰，使用唾液酸供体和转唾液酸酶(TS，trans-sialidase)酶活性。

[0010] 表1.阐明的用环状芽孢杆菌β-半乳糖苷酶制备的GOS结构(Yanahira等，Biosc.Biotech.Biochem.59：1021-1026，1995；Fransen等，Carbohydr.Res.314：101-114，1998；Fransen，PhD thesis Utrecht University，1999；Coulier等，J.Agr.Food Chem.57：
8488-8495，2009

[0011] 二糖  Gal(β1-2)Glc，Gal(β1-3)Glc，Gal(β1-4)Glc，Gal(β1-6)Glc，Gal(β1-3)Gal，Gal(β1-4)Gal，Glc(α1-1β)Gal，Glc(β1-1β)Gal，Gal(β1-4)Fru

[0012] 三糖  Gal(β1-4)Gal(β1-2)Glc，Gal(β1-4)Gal(β1-3)Glc，Gal(β1-4)Gal(β1-4)Glc，Gal(β1-4)Gal(β1-6)Glc，Gal(β1-6)Gal(β1-4)Glc，Gal(β1-6)Gal(β1-6)Glc，Gal(β1-2)Glc(α1-1β)Gal，Gal(β1-4)Glc(α1-1β)Gal，Gal(β1-4)Gal(β1-4)Fru Gal(β1-2)[Gal(β
1-6)]Glc，Gal(β1-3)[Gal(β1-6)]Glc，Gal(β1-4)[Gal(β1-6)]Glc，Gal(β1-2)[Gal(β1-4)]Glc

[0013] 四糖  Gal(β1-4)Gal(β1-4)Gal(β1-4)Glc，Gal(β1-6)Gal(β1-6)Gal(β1-4)Glc，Gal(β1-4)Gal(β1-4)Glc(α1-1β)Gal，Gal(β1-4)Glc(α1-1β)Gal(4-1β)Gal[0014] 五糖  Gal(β1-4)Gal(β1-4)Gal(β1-4)Gal(β1-4)Glc，Gal(β1-6)Gal(β1-6)Gal(β1-6)Gal(β1-4)Glc，Gal(β1-4)Gal(β1-4)Gal(β1-4)Glc(α1-1β)Gal，Gal(β1-4)Gal(β1-4)Glc(α1-1β)Gal(4-1β)Gal，Gal(β1-4)Glc(α1-1β)Gal(4-1β)Gal(4-1β)Gal[0015] 六糖  Gal(β1-4)Gal(β1-4)Gal(β1-4)Gal(β1-4)Gal(β1-4)Glc，Gal(β1-4)Gal(β
1-4)Gal(β1-4)Gal(β1-4)Glc(α1-1β)Gal，Gal(β1-4)Gal(β1-4)Gal(β1-4)Glc(α1-1β)Gal(4-1β)Gal，Gal(β1-4)Gal(β1-4)Glc(α1-1β)Gal(4-1β)Gal(4-1β)Gal，Gal(β1-4)Glc(α1-1β)Gal(4-1β)Gal(4-1β)Gal(4-1β)Gal

[0016] 因此，在一个实施方案中，本发明涉及用于提供包含含有唾液酸之寡糖的组合物的方法，其包括以下步骤：

[0017] a)提供含有至少两个末端结合的β-连接半乳糖残基的不可消化的低聚半乳糖源；

[0018] b)提供唾液酸供体；

[0019] c)在酶反应混合物中在具有转唾液酸酶活性之酶的存在下，使所述低聚半乳糖与所述唾液酸供体接触；以及

[0020] d)从所述酶反应混合物获得级分，其包含基于干物质按重量计至少5％的双唾液酸化低聚半乳糖(双-Sia-GOS)。

[0021] 在一个实施方案中，不可消化的低聚半乳糖源通过用β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)对乳糖进行酶处理来获得。可用来自不同来源(例如真菌、酵母和/或细菌)的β-半乳糖苷酶来产生具有可变链长和不同糖苷键比例的寡聚体的混合物。例如，可使用市售的低聚半乳糖制剂Vivinal GOS(FrieslandCampina Deme)，其包含57％GOS、21％乳糖、以及22％葡萄糖和半乳糖。在DP＞2之级分中GOS部分包含适合量的还原分支的和非还原的低聚半乳糖，其具有两个末端半乳糖单元。在一个实施方案中，用β-半乳糖苷酶处理乳糖和α，α-海藻糖[Glc(α1-1α)Glc]的混合物。

[0022] 可将GOS起始材料预处理以富集具有两个末端结合的β-连接半乳糖残基的那些种类。例如，可以在转唾液酸酶处理前除去DP1和/或DP2种类。在另一个实施方案中，适合使用具有低乳糖含量(例如Vivinal-GOS90)的GOS起始组合物。可以通过本领域已知方法将单独的GOS结构从GOS种类的混合物中分开并分离。例如，可以按照Geulas等(J.Membr.Sc.209：321-335，2002)的描述使用纳米过滤。在一个优选的实施方案中，使用阳离子交换柱将GOS混合物分级，优选地，其中阳离子交换树脂的抗衡离子为钾。WO2008/041843公开了从GOS种类的混合物分离各种DP级分的方法。

[0023] 转唾液酸酶(图1)是具有独特能力的酶，其有效地从多种供体转移唾液酸(Neu5Ac或Neu5Gc)至含有末端β-连接Gal残基的受体底物。最充分研究的TS是来自人寄生虫克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)的TS(TcTS)，同时还已知来自近亲的锥虫种类(例如布氏锥虫(Trypanosoma brucei)和刚果锥虫(Trypanosoma congolense))的TS酶(Schauer和Kamerling，ChemBieChem12：2246-2264，2011)。

[0024] 先前已经示出TcTS仅针对具有(α2-3)-连接的唾液酸(Neu5Ac和Neu5Gc二者)的供体底物有活性(Scudder等，J.Biol.Chem.268：9886-9891，1993；Agustí等，Carbohydr.Res.342：2465-2469，2007)。该酶具有保留机制，这意味着形成的产物也具有(α
2-3)结合的唾液酸(Scudder等，1993)。缺乏合适的受体的情况下，TcTS充当水解酶(唾液酸酶)，从其底物释放游离唾液酸。因为其唾液酸转移能力和广泛的底物范围(供体和受体二者)，TcTS酶广泛地用于糖生物学以合成唾液酸化寡糖(例如，Neubacher等，
Org.Biomol.Chem.3：1551-1556，2005)。能够将唾液酸转移至受体分子的其他酶是唾液酸转移酶类。然而这些酶需要活化的唾液酸(CMP-Neu5Ac)。由于核苷酸糖是昂贵的，唾液酸转移酶不太适合用于在糖生物学中(大规模)应用。

[0025] 受体分子用转唾液酸酶的酶促唾液酸化在本领域是已知的。参见US2007/0004656，其公开了从刚果锥虫分离的新颖酶及其生产用于疫苗、药物、食品(foodstuff)、或食品添加剂之唾液酸化产物的应用。尽管GOS包括在可能的唾液酸受体清单中，但未公开或暗示富含双唾液酸化产物之级分的产生和分离。实际上，本发明观察到GOS的转唾液酸化不仅导致单唾液酸化GOS(单-Sia-GOS)，还导致迄今从未报道的双唾液酸化种类(双-Sia-GOS)。

[0026] 可根据本发明获得的双-Sia-GOS种类的聚合程度(DP)当然会取决于所使用的GOS受体分子的DP或DP范围。如所述的，通常GOS制剂含有DP为2至8的寡糖。对于Vivinal GOS，混合物大致上可描述为Gal(β1-x)Gal(β1-x)....Gal(β1-x)Glc(主要量；还原的直链和支链的(DP＞2)GOS组分)，x＝4(主要地)、3和6；以及Gal(β1-4)Gal(β1-4)....Gal(β1-4)Glc(α1-1β)Gal(4-1β)....Gal(4-1β)Gal(次要量；非还原的GOS组分)(表1)。

[0027] 在一个实施方案中，本发明的一种方法包括分离级分，其包含基于干物质按重量计至少5％，优选至少7％、10％、12％、18％、20％、22％、25％、27％或30％的双-Sia-GOS，其中所述双-Sia-GOS的聚合度(DP)为DP5至DP11，优选DP6至DP8。

[0028] 可基于表1形成的示例性双唾液酸化GOS结构包括以下结构：

[0029] 来自GOS DP3的五糖

[0030] Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-4)Glc(α1-1β)Gal(3-2α)Neu5Ac

[0031] Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-2)[Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-6)]Glc

[0032] Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-3)[Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-6)]Glc，

[0033] Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-4)[Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-6)]Glc

[0034] Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-2)[Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-4)]Glc

[0035] 来自GOS DP4的六糖

[0036] Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-4)Gal(β1-4)Glc(α1-1β)Gal(3-2α)Neu5Ac

[0037] Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-4)Glc(α1-1β)Gal(4-1β)Gal(3-2α)Neu5Ac

[0038] 来自GOS DP5的七糖

[0039] Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-4)Gal(β1-4)Gal(β1-4)Glc(α1-1β)Gal(3-2α)Neu5Ac[0040] Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-4)Gal(β1-4)Glc(α1-1β)Gal(4-1β)Gal(3-2α)Neu5Ac[0041] Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-4)Glc(α1-1β)Gal(4-1β)Gal(4-1β)Gal(3-2α)Neu5Ac[0042] 来自GOS DP6的八糖

[0043] Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-4)Gal(β1-4)Gal(β1-4)Gal(β1-4)Glc(α1-1β)Gal(3-2α)Neu5Ac

[0044] Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-4)Gal(β1-4)Gal(β1-4)Glc(α1-1β)Gal(4-1β)Gal(3-2α)Neu5Ac

[0045] Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-4)Gal(β1-4)Glc(α1-1β)Gal(4-1β)Gal(4-1β)Gal(3-2α)Neu5Ac

[0046] Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-4)Glc(α1-1β)Gal(4-1β)Gal(4-1β)Gal(4-1β)Gal(3-2α)Neu5Ac

[0047] 考虑到所使用的转唾液酸酶的酶特异性，术语“唾液酸供体”指具有一种或更多种(α2-3)-唾液酸化聚糖(糖蛋白、糖肽、糖脂)或合成的唾液酸糖苷(例如2′-(4-甲基伞形基)-α-N-乙酰神经氨酸(4MU-Neu5Ac)的任何化合物(Schauer和Kamerling，ChemBioChem12：2246-2264，2011)。这些包括(α2-3)-连接的N-乙酰神经氨酸(Sia＝Neu5Ac)供体以及(α2-3)-连接的N-乙酰神经氨酸/N-羟乙酰神经氨酸(Sia＝Neu5Ac/Neu5Gc)供体。对于人应用，优选地，唾液酸供体含有(α2-3)-连接的Neu5Ac，但对于饲料应用，唾液酸供体可以含有(α2-3)-连接的Neu5Ac/Neu5Gc。还可以使用不同供体的组合。

[0048] 在一个实施方案步骤b)中，唾液酸供体是天然存在的化合物，优选地选自与寡糖结合的唾液酸、多糖、多聚唾液酸、糖蛋白。例如唾液酸供体选自全动物血浆或衍生自血浆的糖蛋白(是屠宰场的典型产品)，以及来自乳品业的乳糖蛋白，或者糖脂。多种多样的乳糖蛋白存在于牛奶中。N-连接和O-连接的碳水化合物链经常以唾液酸(Sia)家族的成员结束。例如，唾液酸供体选自糖基化的乳清蛋白和酪蛋白，及其片段。

[0049] 用于本发明的高度有利的唾液酸供体是来自κ-酪蛋白的糖巨肽(glycomacropeptide，GMP)，其作为乳品业的副产品产生。GMP用O-聚糖修饰，含有Neu5Ac(α
2-3)Gal(β1-和Neu5Ac(α2-6)GalNAc(α1-单元(van Halbeek等，
Biochim.Biophys.Acta623：295-300，1980)。在本发明的方法中，用GMP作为(α2-3)连接的N-乙酰神经氨酸(Sia＝Neu5Ac)供体，产生的双-Sia-GOS将发现其在除了其他以外婴儿营养和功能性食品中的用途。

[0050] 在另一个优选的实施方案中，唾液酸供体选自糖基化的动物黏液蛋白质及其片段。动物黏蛋白是具有较高碳水化合物含量的糖蛋白。O-连接的碳水化合物链经常末端具有唾液酸(Sia)家族的成员，其中N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)和N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)是最重要的成员。不同的黏蛋白可具有不同的唾液酸化式样。特别感兴趣的是猪和牛小肠黏蛋白糖蛋白(通常是屠宰场的副产品)作为含有唾液酸的材料。例如，根据文献，猪小肠黏蛋白糖蛋白(pig small intestinal mucin glycoprotein，PSMG)的唾液酸化式样包括Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-、Neu5Gc(α2-3)Gal(β1-、Neu5Ac(α2-6)GalNAc(α1-和Neu5Gc(α2-6)GalNAc(α1-单元(Hansson等，Carbohydr.Res.221：179-189，1991)。用PSMG作为(α2-3)-连接的N-乙酰神经氨酸/N-羟乙酰神经氨酸(Sia＝Neu5Ac/Neu5Gc)供体，所产生的双-Sia-GOS将发现其在除了其他以外动物饲料产业中的用途。例如，在生产方法中从黏蛋白获得唾液酸供体，通过所述方法清洗猪肠用于生产肠衣(移除未出生的粪便；挤压黏蛋白，挤压胎膜(caul)，进一步加工肠衣)，随后浓缩和/或进一步纯化/酶促降解含有唾液酸之黏蛋白生物多聚体。

[0051] 因此，在一个实施方案中，本发明涉及酶促转糖基作用，使用从较便宜的从屠宰场和乳品业的副产物获得的唾液酸供体来升级功能性食品。

[0052] 在一个实施方案中，本文公开的方法之步骤c)使用具有转唾液酸酶活性的酶，其是由来自锥虫属之微生物(优选布氏锥虫或刚果锥虫)的基因产物编码的。优选地，所述酶是在宿主细胞(例如诸如大肠杆菌的细菌宿主细胞)中重组生产的。

[0053] 孵育条件可根据酶来源变化。在使用TcTS的一个实施方案中，酶反应混合物的pH为4至6，优选为4.8至5.8。优选的缓冲液包含柠檬酸钠、Pipes和TrisHCl，及其混合物。在一个实施方案中，酶孵育在柠檬酸钠、Pipes和Tris-HCl(各25mM)的pH5.5的混合物中进行。还能够在水溶液中进行酶反应。例如，TcTS与GMP和GOS在水中的孵育产出了与对pH5.0的柠檬酸钠观察到的一样高的转化率。该酶可以通过蛋白组分(例如牛血清蛋白)稳定，但在使用糖蛋白供体的情况下这不是必要的。

[0054] 由于唾液酸从供体转移到受体将是不完全的，理论上可形成GOS、唾液酸化GOS、唾液酸供体和去唾液酸-供体的混合物。例如，在施加Vivinal GOS作为GOS之来源的情况下，产物混合物将包含GOS、唾液酸化-GOS、乳糖、半乳糖、葡萄糖和唾液乳糖(乳糖也是唾液酸的受体)。在GMP的情况下，Sia代表Neu5Ac，在PSMG的情况下，代表Neu5Ac/Neu5Gc。在分离富集双唾液酸化GOS之级分的步骤之前，可以经离心过滤(自旋过滤器)将该混合物分离成高分子量糖蛋白/酶级分和低分子量碳水化合物级分。原则上，可以经凝集素或抗体层析将Neu5Ac/Neu5Gc混合物分离成其Neu5Ac和Neu5Gc组分。

[0055] 本发明之方法的步骤d)包括从所述酶反应混合物分离包含基于干物质按重量计至少5％的双唾液酸化低聚半乳糖的级分。因为每分子的双唾液酸化寡糖在生理pH下具有两个负电荷，它们适合使用基于待分离的组分间电荷差异的分离技术分离，例如优选阴离子交换色谱。示例性阴离子交换树脂包括Resource Q。例如，GOS DP5与TcTS和作为人工供体的4MU-Neu5Ac孵育21小时后，脱盐后通过MALDI-TOF-MS和NMR光谱学检查，混合物可分为中性GOS DP5、单-Sia-GOS DP5(DP5之还原的直链和支链以及非还原GOS组分的单唾液酸化)、游离的Sia、和双-Sia-GOS DP5级分(DP5之还原的支链和非还原GOS组分的双唾液酸化)。

[0056] 其他适合的分离技术基于待分离的组分间尺寸的差异，优选尺寸排阻色谱。

[0057] 取决于所采用的分离工序和期望的应用，富集双-Sia-GOS的级分可以进一步经历清理处理，例如在已经使用阴离子交换层析的情况下脱盐工序。

[0058] 另一个实施方案涉及组合物，其包含按重量计至少5％的双唾液酸化低聚半乳糖(可通过根据本发明的方法获得)。该组合物优选包含至少7wt％、10wt％、12wt％、18wt％、20wt％、22wt％、25wt％、27wt％，更优选至少30wt％的双唾液酸化低聚半乳糖。在一个实施方案中，组合物包含少于80wt％、优选少于60wt％的单-唾液酸化寡糖。双-唾液酸化与单-唾液酸化寡糖的重量比率为例如1∶20至100∶1，更优选1∶10至9∶1。在另一个优选的实施方案中，组合物基本上没有单-唾液酸化寡糖。组合物优选地不含有(活性)酶。

[0059] 还提供了富含双唾液酸化低聚半乳糖作为活性成分的组合物的用途，例如作为营养添加剂、药物添加剂或营养食品添加剂。

[0060] 在一个实施方案中，本发明提供了营养产品，其包含富集可如本文所述获得的双唾液酸化低聚半乳糖的组合物。除了双-Sia-GOS种类，食物产品可以包含其他寡糖，特别是益生菌寡糖和寡糖混合物。也设想到益生菌的添加。

[0061] 该营养产品可用于人或动物目的。对于人应用，应当防止高浓度的Neu5Gc存在，因为Neu5Gc在人中不存在或几乎不存在。因此，对于用于人的产品，优选使用(α2-3)-连接的N-乙酰神经氨酸(Sia＝Neu5Ac)供体作为唾液酸供体，例如GMP。在使用具有(α2-3)-连接的N-乙酰神经氨酸/N-羟乙酰神经氨酸(Sia＝Neu5Ac/Neu5Gc)的唾液酸供体(例如PSMG)的情况下，含有Neu5Gc的GOS种类应当例如通过凝集素色谱移除。在特定方面中，营养产品是婴儿配方奶粉。例如，添加富含双-Sia-GOS的级分(其中Sia为Neu5Ac)作为常规婴儿配方奶粉的补充以更接近于人乳的组成，从而增强配方奶粉的有益性质。具有本发明之双-Sia-GOS浓缩物的婴儿配方奶粉可用双唾液酸化寡糖以匹配人乳的浓度富集，即双唾液酸化寡糖的浓度可增加至200mg/l至500mg/l，匹配多个泌乳阶段的人乳的浓度。当然，浓缩物还适合用于使结合唾液酸的寡糖之总浓度达到100mg/l至1500mg/l。然而，本发明的范围不限于这一富集的范围，因为人乳组成的巨大变化并且还因为其他(食品)应用可以需要结合(双)唾液酸之寡糖的其他浓度的事实。在本发明中，唾液酸化寡糖浓度已经使用装备UV检测系统和Resource Q柱的高效液相色谱(HPLC)测量，然而可采用具有可接受精度的本领域现有技术。

[0062] 本发明的双-Sia-GOS级分可原样使用，或者其可进一步通过例如反向渗透、结晶、亲和色谱法或其组合处理以除去水和/或盐，或者它可以单独或与一种或更多种载体干燥。可以使用任何载体，例如油、脂肪、乳清、去矿物质的乳清、乳清蛋白浓缩物、乳清蛋白分离物、其他乳清级分、乳清或乳渗透物(permeate)或浓缩物、脱脂乳、全脂乳、半脱脂乳、乳级分、麦芽糊精、蔗糖、乳糖、天然和预胶化淀粉、葡萄糖糖浆、酪蛋白和酪蛋白级分。

[0063] 本发明的双-Sia-GOS级分，包括其干燥的浓缩物，可用于任何营养组合物，例如用于婴儿营养、蛋白棒、运动营养、饮料、保健品(health supplement)的产品，用于医疗目的和临床营养的食品。婴儿营养可以为，但不限于，婴儿配方奶粉、后续配方奶粉(follow-on formula)、婴儿谷物产品或成长乳，即适用于1至3岁儿童的经改良的乳或乳粉。

[0064] 这样的配方乳粉特别适用于向早产婴儿施用，因为富含双-Sia-GOS的级分可以帮助抵抗有害微生物(包括原生动物，例如引起阿米巴病的寄生虫溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica))引起的感染。在一个实施方案中，双-Sia-GOS级分用于通过抑制微生物病原黏附到人小肠上皮细胞来保护身体免受感染。例如，其通过与寄生虫的Gal/GalNAc-凝集素(主要的有毒蛋白，其介导黏附和细胞毒性)相互作用，用于阻断溶组织内阿米巴与宿主细胞的结合。因此，还涵盖了用于提供婴儿配方乳粉的方法，其包括分离级分，其包含基于干物质按重量计至少50％双唾液酸化低聚半乳糖，并且将所述级分与蛋白源、脂肪源、碳水化合物源和其他常规成分(例如维生素和矿物质)一起配制成婴儿配方乳粉。治疗或预防有效量将取决于多种因素，例如，待治疗对象的年龄和体重、待预防或治疗的疾病、剂型的类型等。

[0065] 本发明还涉及包含如本文公开之双-Sia-GOS级分的组合物的医疗用途。例如，其适用于在对象，优选人对象，更优选在早产婴儿对象中治疗或预防坏死性小肠结肠炎(NEC，necrotizing enterocolitis)的方法。NEC是主要在生病或早产新生儿的肠中严重的细菌感染。其可以导致小肠组织的死亡(坏死)以及发展成血液中毒(败血症)。其具有高死亡率，尤其在出生体重非常低的婴儿中。这些婴儿的一些(20％至40％)死亡。NEC在大约10％的体重低于800g(低于2lbs)的新生儿中发生。坏死性小肠结肠炎几乎总是在生命的第一个月发生。需要管饲的婴儿可以具有这种疾病增加的风险。因此，坏死性小肠结肠炎的风险可以通过使用包含如本文提供的含有双-Sia-GOS的配方乳粉之肠营养物而降低。

[0066] 对于动物施用，高浓度的Neu5Gc的存在不形成问题。其甚至可以是有益的，因为已经报道特别是含有Neu5Gc的化合物有效地对抗在小猪和牛犊中导致腹泻之特定感染。因此，对于在动物饲料产品中的使用，优选使用包含(α2-3)-连接的N-乙酰神经氨酸和N-羟乙酰神经氨酸(Sia＝Neu5Ac/Neu5Gc)的供体，例如PSMG。本文提供了包含富含双-Sia-GOS之组合物的动物饲料产品，其中Sia是Neu5Ac和/或Neu5Gc，优选Neu5Ac和Neu5Gc。饲料产品优选配制成用于小猪和牛犊并且可以包含一种或更多种有益的成分以增强动物外观、肉质和动物健康。

附图说明

[0067] 图1.通过锥虫转唾液酸酶催化的Neu5Ac(α2-3)Gal-OR1和Neu5Ac(α2-3)Gal-OR2之间(α2-3)-连接的N-乙酰神经氨酸的可逆的转糖基作用。

[0068] 图2.在Bio-Gel P2上将Vivinal-GOS分离成不同DP的8个级分。软化水(demi water)用作洗脱液，40℃，流速1ml/分钟。

[0069] 图3.GOS DP5与4MU-Neu5Ac的TcTS孵育在t(0)(虚线)和孵育21小时后(实线)的HPAEC-PAD谱，其示出单唾液酸化GOS DP5(15至18分钟)和双唾液酸化GOS DP5(20至23分钟)的形成。

[0070] 图4.在Resource Q上分离唾液酸化GOS DP5，使用NaCl梯度并且在214nm下监测。

[0071] 图5.Vivinal-GOS DP5的500MHz1H NMR谱。

[0072] 图6.单-Sia-GOS DP5的500MHz1H NMR谱。

[0073] 图7.双-Sia-GOS DP5的500MHz1H NMR谱。

[0074] 实验部分

[0075] 实施例1：克氏锥虫转唾液酸酶(TcTS)的异源表达和纯化。

[0076] 含有N端6x His-标签的TcTS的DNA克隆从A.C.C.Frasch教授(Buenos Aires，Argentina)获得。为表达该蛋白，稍微改变如文献(Paris等，Glycobiology11：305-311，2001)所描述的生长和诱导条件。将构建体pTrcTS611/2转化到大肠杆菌TOP10或BL21(DE3)中并且将培养物接种在极好的肉汤培养基(terrific broth medium)中，所述培养基补充有氨苄青霉素(100μg/ml)和0.1mM作为诱导物的异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)。
将来自Luria Bertani琼脂板的新鲜克隆直接接种到培养基，然后在30℃下振荡(200rpm)孵育24小时(OD600为0.6)。收获细胞后，将沉淀在裂解缓冲液(细菌蛋白提取试剂/B-PER)中重悬，并允许根据制造商的说明书在室温下裂解。通过在40,000g下超速离心30分钟除去细
2+
胞碎片并且上清液经受重力流Ni -次氮基三乙酸(NTA)柱亲和层析。使用100mM咪唑从柱洗脱重组TcTS，产生不完全纯的酶制剂(SDS-PAGE)。但是，如已知的，酶在纯化的形式中变得不稳定(Turnbull等，Tetrahedron58：3207-3216，2002)，省略进一步的纯化步骤。

[0077] 实施例2：TcTS制剂的活性检测和动力学研究

[0078] 用部分纯化的TcTS(2mU/ml)进行活性测定，1mM2′-(4-甲基伞形基)-α-N-乙酰神经氨酸(4MU-Neu5Ac)作为市售的合成唾液酸模型供体并且乳糖作为受体，随后形成产物Neu5Ac(α2-3)乳糖(3′-唾液乳糖，3′SL)。在乳糖10倍过量的情况下，接近80％的4MU-Neu5Ac的Neu5Ac单元被转移至乳糖。

[0079] 部分纯化的TcTS的动力试验中，4MU-Neu5Ac或工业可得的κ-酪蛋白衍生的糖巨肽(GMP)作为供体并且乳糖作为受体，孵育15和30分钟后定量测定3′SL的形成，利用带有脉冲安培检测的高pH阴离子交换色谱法(HPAEC-PAD)。对于两种供体，从15℃至50℃的一系列温度(5℃的增加)推论，转移反映的最优温度是25℃，其类似于文献中报道的最优温度(Scudder等，J.Biol.Chem.268：9886-9891，1993)。

[0080] 关于TcTS的热稳定性，在15℃至50℃的范围内以5℃的间隔(30分钟处理，在25℃下测定保留的活性)估算，该酶保留其全部活性直到25℃并且随后稳定地降低。在50℃孵育后，仅保留了初始活性的6％。

[0081] 当使用4MU-Neu5Ac作为供体时，蛋白(BSA)的添加对TcTS活性有稳定作用；当使用GMP时，BSA的添加不是必须的。

[0082] 如在BSA的存在下，从TcTS、4MU-Neu5Ac和乳糖(25℃)在50mM柠檬酸钠缓冲液(pH4.5、5.0、5.5)、Pipes缓冲液(pH6.0、6.5、7.0、7.5)和Tris-HCl缓冲液(pH8.0、8.5、9.0)中的孵育中推论出来的，转移反应最佳的pH是pH5.0。如使用含有25mM柠檬酸钠、Pipes和Tris-HCl的混合缓冲剂，pH4.5至9.0的范围推论的，独立于缓冲剂类型的测定的最优pH为5.5。

[0083] 通过用适当的一系列这些底物和固定浓度的作为受体的乳糖进行孵育(4.5mU/ml)，测试了TcTS对唾液酸供体底物4MU-Neu5Ac和GMP的亲和力。对于4MU-Neu5Ac，孵育混合物含有0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0和10.0mM4MU-Neu5Ac和1mM乳糖；发现Km为1.65mM并且Vmax为1.5U/mg。对于GMP，孵育混合物含有0.01、0.025、0.05、0.075、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5和5.0mM GMP和5mM乳糖；发现Km为0.18mM并且Vmax为3.0U/mg。

[0084] 实施例3：供体GMP的唾液酸特异性(specification)的分析

[0085] 使用0.1M HCl(1小时；80℃)进行GMP(MW＝10kDa)的温和酸水解，随后通过HPAEC-PAD定量分析释放的唾液酸，产生4.4％的唾液酸含量，由99％Neu5Ac和1％Neu5Gc建立。

[0086] 从文献已知，GMP的O-聚糖含有具有(α2-3)-和/或(α2-6)-连接唾液酸的寡糖的排列(van Halbeek等，Biochim.Biophys.Acta623：295-300，1980)。这两种连接位置中，仅(α2-3)-连接的唾液酸充当TcTS的有效供体(Schauer和Kamerling，ChemBioChem12：2246-
2264，2011)。如通过用来自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的(α2-3)-特异性唾液酸酶孵育随后进行HPAEC-PAD分析测定的，(α2-3)-连接的Neu5Ac的量为72％。

[0087] TcTS(8mU/ml)与GMP(唾液酸含量：4.4％；1mM总唾液酸，(α2-3)-和(α2-6)-连接的)和10mM乳糖的孵育导致了约60％的总Neu5A转移到3′SL(HPAEC-PAD)中(t＝0小时：0％3′SL，0％游离的Neu5Ac；t＝1小时：42％3′SL，0％游离的Neu5Ac；t＝2小时：53％3′SL，0％游离的Neu5Ac；t＝4小时：58％3′SL，0％游离的Neu5Ac；t＝24小时：51％3′SL，5％游离的Neu5Ac)。考虑到连接特异性，t＝4小时时(α2-3)-连接的Neu5Ac转化成为3′SL的实际效率为81％。

[0088] 实施例4：用受体Vivinal-GOS和4MU-Neu5Ac作为供体获得的唾液酸化产物的评估[0089] 将作为57％具有不同聚合度(DP)的低聚半乳糖(GOS)(即57％GOS)、21％乳糖和22％半乳糖+葡萄糖之混合物的市售Vivinal-GOS在Bio-Gel P2上分离成DP级分2-8(图2)。
通过MALDI-TOF-MS分析检查级分，证明分离的GOS DP池(pool)具有邻近DP的低污染。

[0090] 用GOS DP2至GOS DP6作为受体底物(3μmol)和4MU-Neu5Ac作为供体底物(6μmol)进行重组TcTS孵育(2mU/ml)。除了还原的直链寡糖，DP3至DP6的部分为还原的支链和非还原的直链寡糖，含有两个末端结合的β-连接的半乳糖(Gal)残基(表1)。如通过HPAEC-PAD证明的，在所有情况下可以观察到产物形成，伴随着GOS底物的减少。更高DP的唾液酸化GOS产物除了起始材料之外由两种带电荷的池组成，主要的单唾液酸化池和次要的双唾液酸化池。在图3中作为典型的实例，描述了对于GOS DP5的结果。色谱图示出保留时间为15至20分钟的主要带电荷池，以及保留时间为20至22分钟的次要带电荷池。这些池的进一步结构分析证明单唾液酸化GOS DP5(单-Sia-GOS DP5)和双唾液酸化GOS DP5(双-Sia-GOS DP5)(Sia＝Neu5Ac)的发生。

[0091] 实施例5：通过1H NMR光谱学(spectroscopy)分析TcTS催化的Vivinal-GOS DP5和4MU-Neu5Ac的孵育

[0092] 对于1H NMR分析，TcTS(2mU/ml)与Vivinal-GOS DP5(1μmol)和4MU-Neu5Ac(2μmol)在25℃和pH5下孵育16小时。经阴离子交换色谱收集单电荷和双电荷的级分(图4)，为了验证，通过HPAEC-PAD分析其等分试样。

[0093] 图5、6和7分别地呈现了GOS DP5、单-Sia-GOS DP5和双-Sia-GOS DP5(Sia＝1
Neu5Ac)的H NMR光谱。早期研究(Fransen等，Carbohydr.Res.314：101-114，1998)已经示出GOS DP5的主要组分包含以下结构(4取代的Gal残基多于6取代的残基)：

[0094] Gal(β1-4)Gal(β1-4)Gal(β1-4)Gal(β1-4)Glc

[0095] Gal(β1-6)Gal(β1-6)Gal(β1-6)Gal(β1-4)Glc

[0096] Gal(β1-4)Gal(β1-4)Gal(β1-4)Glc(α1-1β)Gal

[0097] Gal(β1-4)Gal(β1-4)Glc(α1-1β)Gal(4-1β)Gal

[0098] Gal(β1-4)Glc(α1-1β)Gal(4-1β)Gal(4-1β)Gal

[0099] 然而，如在实施例10中示出的，也发生还原的支链结构(对于在GOS DP3和DP4中发生的还原的支链结构，参见实施例8和9)。

[0100] 唾液酸化GOS DP5探针的光谱仅反应了(α2-3)-连接的Neu5Ac的存在。基于Gal H-3和H-4以及Neu5Ac H-3e和H-3ax信号的表面比率，可以进行对单-Sia-GOS DP5和双-Sia-GOS DP5池的分配。基于在Resource Q上的UV响应，单-Sia-GOS DP5和双-Sia-GOS DP5的摩尔比率为约8.5∶1。

[0101] 实施例6：供体PSMG的唾液酸特异性的分析

[0102] 从包装的材料恢复小肠，通过挤压和在44℃至48℃的水中洗涤清洁。

[0103] 随后在增加压力下以2步或3步(取决于安装的设备)中将黏液挤压出小肠。清洁步骤的最后一步是移除黏液膜。

[0104] 收集从这些按压步骤产生的黏液并且添加焦亚硫酸钠水溶液。

[0105] 使用0.1M HCl(1小时；80℃)温和地酸水解工业可得的猪小肠黏蛋白糖蛋白(PSMG)材料(MW＝1.7x103kDa)，随后通过HPAEC-PAD定量分析释放的唾液酸，产生的唾液酸含量为1.4％，由72％Neu5Ac和28％Neu5Gc组成。

[0106] 从文献已知，PSMG的O-聚糖含有一系列具有(α2-3)-和/或(α2-6)-连接唾液酸的寡糖(Hansson等，Carbohydr.Res.221：179-189，1991)。在这两种连接位置中，仅(α2-3)-连接的唾液酸充当TcTS的有效供体。TcTS(2至8mU/ml)与PSMG(0.5mM总Neu5Ac，(α2-3)-和(α2-6)-连接的)和10mM乳糖孵育，24小时后导致总Neu5Ac的至多10％转移到3′Neu5Ac-乳糖(HPAEC-PAD)中。类似水平的Neu5Gc转移到乳糖，产生3′Neu5Gc-乳糖。当使用经Sepharose CL-4B色谱获得并在具有50kDa之截止值的自旋过滤器上浓缩的部分纯化的PSMG，或者乙醇沉淀的PSMG时，转移到乳糖的总Neu5Ac可增加至约20％并且转移到乳糖的总Neu5Gc可增加至约15％。考虑到连接特异性，将(α2-3)-连接的Neu5Ac转变成3′SL(Neu5Ac)的实际转化效率为45％。

[0107] 实施例7：使用GMP作为供体，Vivinal-GOS作为受体和TcTS作为生物催化剂在克级生产Sia-GOS(Sia＝Neu5Ac)

[0108] 将具有pTrcTS611/2的大肠杆菌TOP10细胞接种到含有0.1mM IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的极好的肉汤培养基(50ml)，在旋转摇床上在30℃下培养20小时。通过离心收获细胞并使用细菌蛋白提取试剂(B-PER，Thermo scientific)化学裂解。使用His-标记的固定的金属亲和层析(洗脱液，100mM咪唑)纯化TcTS蛋白。混合从10种不同的50-ml培养物获得的经纯化的蛋白级分并除去咪唑，随后洗涤并使用Amicon50kDa自旋过滤器浓缩。经洗涤的蛋白最终缓冲在含有15％甘油的50mM Tris-HCl(pH8)中。

[0109] 为测定随时间最优的唾液酸转移，在测试实验中添加TcTS(终浓度为2mU/ml)至多种浓度的结合GMP的Neu5Ac(供体；商业GMP产品(唾液酸含量：4.0％；含有10％(w/w)NaCl)和乳糖(受体)。供体底物的过量导致受体的高转变。在测试条件下超过48小时的孵育导致产品的水解(TcTS酶的副反应)。通常Neu5Ac∶乳糖＝5∶1的mM比率在24小时后产生82％3′SL(Neu5Ac)，48小时后100％，以及70小时后76％；并且Neu5Ac∶乳糖＝5∶2的mM比率在24小时后给出56％3′SL(Neu5Ac)，48小时后75％，以及70小时后61％。

[0110] 将800-ml反应混合物在25℃下孵育48小时，所述反应混合物包含在50mM柠檬酸钠(pH5)中的5mM(α2-3)-连接的Neu5Ac(约46g/l GMP)、2mM GOS(Vivinal-GOS)和2mU/ml TcTS。使用前，将含有较高量NaCl的粗提GMP经具有3kDa截止值的聚醚砜膜滤器脱盐。加热灭活步骤(在60℃下20分钟)后，部分地去唾液酸化并经过滤步骤(3kDa膜过滤器)除去开始的GMP。定量分析温和酸水解(Neu5Ac的释放)前后的总渗透物，使用AOAC方法(采用来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的β-半乳糖苷酶)定量测量GOS含量，示出存在48％非唾液酸化GOS和52％唾液酸化GOS。将总的渗透物冻干并通过在Bio-Gel P-2上使用软化水作为洗脱液的凝胶过滤脱盐。如通过HPAEC-PAD检查的，第一洗脱级分含有单-Sia-GOS和双-Sia-GOS(Sia＝Neu5Ac)的混合物，基本上不含NaCl，随后是游离的Neu5Ac以及DP降低的非唾液酸化GOS。MALDI-TOF-MS分析示出从GOS获得的至多GOS DP7的唾液酸化GOS产物。

[0111] 实施例8：TcTS催化的Vivinal GOS DP3和GMP的孵育

[0112] TcTS(2.5mU/ml)催化的GOS DP3(3mM)和GMP(唾液酸含量：4.0％；6mM(α2-3)-连接的Neu5Ac)的孵育在25℃和pH5下进行23小时。处理后，寡糖产物经过Resource Q上的阴离子交换色谱，在214nm下检测，产生摩尔比为88∶12的单-Sia-GOS DP3和双-Sia-GOS DP3级分。通过MALDI-TOF-MS和1H NMR光谱法进行验证。双-Sia-GOS DP3级分的进一步分析集中于“支链的还原的”和“非支链的非还原的”形式，利用NaBH4还原步骤继而HPAEC-PAD和MALDI-TOF-MS，示出双-Sia-GOS DP3的主要部分由支链的结构组成。

[0113] 实施例9：TcTS催化的Vivinal GOS DP4和GMP的孵育

[0114] TcTS(2.5mU/ml)催化的GOS DP4(3mM)和GMP(唾液酸含量：4.0％；6mM(α2-3)-连接的Neu5Ac)的孵育在25℃和pH5下进行23小时。处理后，寡糖产物经过Resource Q上的阴离子交换色谱，在214nm下检测，产生摩尔比为91∶9的单-Sia-GOS DP4和双-Sia-GOS DP4级分。通过MALDI-TOF-MS和1H NMR光谱法进行验证。双-Sia-GOS DP4级分的进一步分析集中于“支链的还原的”和“非支链的非还原的”形式，利用NaBH4还原步骤继而HPAEC-PAD和MALDI-TOF-MS，示出双-Sia-GOS DP4的主要部分由支链的结构组成。

[0115] 实施例10：TcTS催化的Vivinal GOS DP5和GMP的孵育

[0116] TcTS(2.5mU/ml)催化的GOS DP5(3mM)和GMP(唾液酸含量：4.0％；6mM(α2-3)-连接的Neu5Ac)的孵育在25℃和pH5下进行23小时。处理后，寡糖产物经过Resource Q上的阴离子交换色谱，在214nm下检测，产生摩尔比为88∶12的单-Sia-GOS DP5和双-Sia-GOS DP5级分。通过MALDI-TOF-MS和1H NMR光谱法进行验证。双-Sia-GOS DP5级分的进一步分析集中于“支链的还原的”和“非支链的非还原的”形式，利用NaBH4还原步骤继而HPAEC-PAD和MALDI-TOF-MS，示出双-Sia-GOS DP5的主要部分由支链的结构组成。

[0117] 实施例11：TcTS催化的Vivinal GOS DP6-8和GMP的孵育

[0118] 根据在实施例8-10中描述的流程，Vivinal GOS DP6、DP7和DP8各自与TcTS和GMP的孵育产生摩尔比为87∶13的单-Sia-GOS DP6和双-Sia-GOS DP6级分，摩尔比为84∶16的单-Sia-GOS DP7和双-Sia-GOS DP7级分，以及摩尔比为81∶19的单-Sia-GOS DP8和双-Sia-GOS DP8级分。

[0119] 实施例12：TcTS催化的Vivinal GOS DP3和DP4与PSMG的孵育

[0120] TcTS(3mU/ml)催化的GOS DP3(3mM)或GOS DP4(3mM)与乙醇沉淀的PSMG(2mM)的孵育在25℃和pH5下进行23小时。处理后，寡糖产物经历MALDI-TOF-MS分析，示出在每个情况下Neu5Ac和Neu5Gc的唾液酸化。

[0121] 实施例13：用于婴儿的营养配方

[0122] 表2示出了根据本发明的三种示例性营养配方的组成(每100ml)，例如用于0至6个月之间的年龄组的婴儿配方，用于支持或增强婴儿的免疫系统。

[0123] 表2：配方的组成(每100ml)

[0124]

[0125] 实施例14：动物饲料配方

[0126] 动物饲料由基本饲料组成，辅以除了其他以外双唾液酸成分。基本饲料[0127]

[0128] 用于年幼猪仔的饲料

[0129] 成分中高水平的唾液酸

[0130]基本饲料 91.52 ％
马铃薯蛋白 0.50 ％
乳清粉 4.37 ％
Soycomill P 0.50 ％
双唾液酸成分 3.00 ％

[0131] 用于年幼猪仔的饲料

[0132] 成分中低水平的唾液酸

[0133]基本饲料 91.52 ％

[0134]马铃薯蛋白 0.50 ％
乳清粉 6.37 ％
Soycomill P 0.50 ％
双唾液酸成分 1.00 ％

[0135] 用于年幼猪仔的饲料

[0136] 成分中低水平的唾液酸

[0137]基本饲料 91.52 ％
马铃薯蛋白 0.50 ％
乳清粉 6.98 ％
Soycomill P 0.50 ％
双唾液酸成分 0.50 ％

[0138] 用于年幼猪仔的饲料

[0139] 成分中最低水平的唾液酸

[0140]基本饲料 91.52 ％
马铃薯蛋白 0.50 ％
乳清粉 7.38 ％
Soycomill P 0.50 ％
双唾液酸成分 0.10 ％

[0141] 用于年幼猪仔的饲料

[0142] 与血液血浆组合

[0143]

[0144] 实施例15：双-Sia-GOS富集的级分对体内病原体黏附的作用

[0145] 坏死性小肠结肠炎(NEC)的新生大鼠模型可用于通过动物的临床行为和肠的宏观外观，客观地评估双-Sia-GOS的富集级分的保护作用。

[0146] 材料和方法：新生大鼠是按期分娩的并且分配为对照组(A)(由母乳喂养组成并且没有应激因子)，或者为NEC组(B)其中NEC通过强饲法+缺氧+口服脂多糖(对于生命的前两天，每日一次4mg/kg/天)诱导，或者为治疗的NEC组(C)其中NEC通过强饲法+缺氧+口服脂多糖(对于生命的前两天，每日一次4mg/kg/天)加双-Sia-GOS诱导。在第4天使用临床疾病评分(一般外观、触摸响应、自然活动、身体颜色；每个变量为0-3)评估临床状况。将新生大鼠在4个不同的时间点处死：第1天、第2天、第3天、第4天。处死时，使用基于以下的评分系统进行肠的宏观评估：颜色(0至2)，一致性(0至2)和扩张程度(0至2)。切除的肠道用苏木精/伊红染色，并由2位独立的盲法评分者(其中包括一名顾问组织病理学家)进行显微镜评估。可以用组织学结果来验证宏观肠道评估。结果通过ANOVA和线性回归分析进行比较。

[0147] 参考文献

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