树突状细胞表达的TGF-β1在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用

摘要

本发明公开了一种树突状细胞表达的TGF‑β1在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用。本发明首先通过cre‑lox技术，成功杂交出树突状细胞(DC)不表达TGF‑β1的小鼠，通过骨髓移植将这种小鼠的骨髓嵌合进动脉粥样硬化的易感小鼠Apoe‑/‑，通过高脂饮食诱导小鼠发生动脉粥样硬化。结果发现，DC不表达TGF‑β1引起血浆总胆固醇增加，动脉粥样硬化斑块面积显著增加。表明DC表达的TGF‑β1可以通过降低血浆胆固醇水平而发挥抗动脉粥样硬化作用。基于DC表达的TGF‑β1抗动脉粥样硬化作用，DC表达的TGF‑β1可用于制备抗动脉粥样硬化的药物，为开发抗动脉粥样硬化药物提供了新的方向。

权利要求

1.树突状细胞表达的TGF-β1在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用。

2.一种抗动脉粥样硬化的药物，其特征在于：包含树突状细胞表达的TGF-β1。

说明书

树突状细胞表达的TGF-β1在制备抗动脉粥样硬化药物中的

应用

技术领域

[0001] 本发明属于医学领域，涉及一种树突状细胞表达的TGF-β1在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用。

背景技术

[0002] TGF-β可由多种细胞分泌，其家族包括三个成员，TGF-β1、2和3。免疫系统表达的最主要的亚型是TGF-β1。大量研究表明，TGF-β1的表达与动脉粥样硬化形成有关。有些研究表明，TGF-β1是一个抗动脉粥样硬化的血管保护性细胞因子，能限制动脉粥样硬化斑块生长、阻止主动脉扩张并稳定斑块结构。然而，也有一些研究认为TGF-β具有促动脉粥样硬化作用，发现TGF-β1能通过增加血管细胞外基质的积聚及脂质的滞留而加速动脉粥样硬化。以上研究结果提示，TGF-β1在动脉粥样硬化过程中确实发挥了非常重要的作用，但研究结果并不一致，分析可能因为TGF-β的细胞来源复杂，不同细胞产生的TGF-β作用可能不同。

[0003] 树突状细胞(Dendritic cell，DC)是体内功能最强的专职性抗原提呈细胞(Antigen presenting cell，APC)，具有刺激初始T细胞增殖的独特功能，在启动获得性免疫和维持免疫耐受中处于中心地位。有研究报道，DC还具有降低血脂的作用，DC降低血脂是否通过表达的TGF-β1发挥作用，最终是否影响动脉粥样硬化斑块的形成，目前尚不清楚。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种树突状细胞表达的TGF-β1在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用。

[0005] 本发明的目的通过下述技术方案实现：

[0006] 本发明首先通过cre-lox技术，成功杂交出树突状细胞(dendritic cells，DC)不表达TGF-β1的小鼠，通过骨髓移植将这种小鼠的骨髓嵌合进动脉粥样硬化的易感小鼠Apoe-/-，通过高脂饮食诱导小鼠发生动脉粥样硬化。结果发现，DC不表达TGF-β1引起血浆总胆固醇增加，动脉粥样硬化斑块面积也显著增加。表明DC表达的TGF-β1可以通过降低血浆胆固醇水平而发挥抗动脉粥样硬化作用。

[0007] 基于DC表达的TGF-β1可以通过降低血浆胆固醇水平而发挥抗动脉粥样硬化作用，DC表达的TGF-β1可用于制备抗动脉粥样硬化的药物。

[0008] 一种抗动脉粥样硬化的药物，包含DC表达的TGF-β1。

[0009] 本发明首次发现了DC表达的TGF-β1可以通过降低血浆胆固醇水平而发挥抗动脉粥样硬化作用，为开发抗动脉粥样硬化药物提供了新的方向。

附图说明

[0010] 图1是cre-lox技术构建DC不表达TGF-β1小鼠的原理图。CD11c为DC的标志分子，CD11c启动子下游的Cre为重组酶，该重组酶能够催化TGF-β1两端的两个loxp位点进行重组，从而删除loxp位点之间的TGF-β1基因。利用cre-lox技术原理，将CD11c-cre(Jackson 公司，货号：007567)和TGF-β1-flox小鼠(Jackson公司，货号：010721)杂交，经几轮杂交后，通过PCR方法对小鼠基因型进行鉴定，选取CD11ccre和TGF-β1flox均为转基因阳性小鼠为DC不表达TGF-β1的转基因小鼠。

[0011] 图2是CD11ccre-TGF-β1flox小鼠基因鉴定结果。按照Jackson公司小鼠鉴定方法，分别鉴定杂交小鼠的CD11Ccre和TGF-β1flox的基因型。1代表CD11ccre基因鉴定结果，结果显示出现173bp转基因条带和324bp内参基因条带，为转基因阳性；2代表TGF-β1flox基因鉴定结果，结果显示有一条324bp条带，为转基因阳性；M代表标准分子量marker，500bp指示对应的Marker条带的大小；综合两种基因型的鉴定结果，判定该小鼠为DC不表达TGF-β1的双转基因阳性小鼠，命名为CD11ccre-TGF-β1flox小鼠。

[0012] 图3是骨髓嵌合技术制备骨髓嵌合的Apoe-/-小鼠实验流程图。无菌冲构建的cre flox floxCD11c -TGF-β1 小鼠或TGF-β1 小鼠骨髓，制备骨髓细胞，将骨髓细胞通过尾静脉回输经12Gray致死剂量X射线照射的Apoe-/-小鼠，建立骨髓嵌合的Apoe-/-小鼠。

[0013] 图4是骨髓嵌合的Apoe-/-小鼠血浆总胆固醇检测结果图，与对照组TGF-β1flox嵌合的Apoe-/-小鼠相比，CD11ccre-TGF-β1flox嵌合的Apoe-/-小鼠血浆总胆固醇显著升高。

[0014] 图5是骨髓嵌合的Apoe-/-小鼠主动脉根部油红O染色结果图。嵌合小鼠高脂饮食12周，取主动脉根部进行冷冻切片，油红O染色显示主动脉根部动脉粥样硬化斑块位置。

[0015] 图6是骨髓嵌合的Apoe-/-小鼠主动脉根部油红O染色斑块面积的统计结果图。

[0016] 图7是骨髓嵌合的Apoe-/-小鼠主动脉根部油红O染色的斑块面积/官腔面积的统计结果图。

具体实施方式

[0017] 下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

[0018] 实施例1利用cre-lox技术构建DC不表达TGF-β1的小鼠

[0019] cre-lox技术的原理是：Cre为重组酶，能够催化两个loxp位点进行重组，从而删除loxp位点之间的基因。为了利用cre-lox技术构建DC不表达TGF-β1的小鼠，首先从Jackson公司购买两种小鼠，CD11ccre(货号：007567)和TGF-β1flox小鼠(货号：010721)，然后利用cre-lox技术原理，将两种小鼠杂交，杂交原理如图1。将F1代小鼠进行PCR鉴定，挑选后代的基因型为CD11c-cre(转基因)和TGF-β1-flox(杂合子)的小鼠再进行杂交；在F2代小鼠中挑选CD11c-cre为转基因而TGF-β1-flox为纯合子的小鼠再进行杂交来扩大繁殖；F3代中CD11c-cre(转基因，hemizygous)和TGF-β1-flox(纯合子)为构建成功的DC不表达TGF-β1的cre flox flox实验组小鼠，命名为CD11c -TGF-β1 (图2)；而CD11c-cre(野生型)和TGF-β1 (突变体)为DC可表达TGF-β1的对照组小鼠，命名为TGF-β1flox(与图2鉴定标准相似，图略)。

[0020] 杂交小鼠鉴定方法包括小鼠DNA提取，PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍照和结果分析。下面是具体的操作步骤。

[0021] 1、小鼠DNA提取

[0022] (1)试验准备：

[0023] SNET(裂解缓冲液)：1MTris-HCl(pH8.0)20mL，0.5MEDTA10mL，NaCl23.376g，10％SDS100mL，蒸馏水定容至1L。

[0024] 蛋白酶K：贮存液浓度50mg/mL，终浓度10μg/mL，-20℃保存。

[0025] 饱和NaCl、70％乙醇、异丙醇。

[0026] (2)实验步骤

[0027] 1)用打孔器采4-6周龄的小鼠耳片，也可剪0.5-1cm的尾巴组织，将其放进1.5mL离心管中。

[0028] 2)在50mL离心管中混合裂解缓冲液和蛋白酶K(终浓度10μg/mL)，向装有鼠尾的离心管中每管加入500μL裂解液。

[0029] 3)55℃放置6个小时以上(消化过程中样品的充分混合是非常重要的。判断依据是看不到鼠尾，混合液呈灰色乳状液)。

[0030] 4)取出裂解充分的样品管，每管加入300μL饱和NaCl溶液，颠倒混合6～8次，冰浴15min。

[0031] 5)12000rpm室温离心15min，小心地将上清移至新的1.5mL离心管中(尽量避免沉淀被搅动，保证每管倒出的上清等量)。

[0032] 6)加入700μL的异丙醇(此量根据倒出的上清确定，异丙醇与上清等体积)于各管，颠倒直至形成絮状沉淀(如没有出现絮状沉淀，可将其置于-20℃2小时或者4℃过夜)。

[0033] 7)12000rpm室温离心15min，弃上清(小心观察白色DNA沉淀，确保其没有被倒掉)。

[0034] 8)加入500μL的70％乙醇于各管，颠倒冲洗DNA沉淀。

[0035] 9)10000rpm离心1min，用200μL的枪头将乙醇吸掉，留下DNA沉淀在管内(小心别吸走DNA沉淀，此步所用的枪头在各管间操作不需要更换)。

[0036] 10)自然风干DNA沉淀10min。

[0037] 11)将DNA沉淀重溶于20μL的超纯水中，储存于-20℃冰箱或直接进行PCR。

[0038] 2、PCR鉴定小鼠基因型

[0039] (1)试验准备

[0040] 1)PCR鉴定用2×Taq PCR MasterMix和100bp DNA ladder(Marker)购自北京天根生化科技公司。

[0041] 2)引物由上海生工生物有限公司合成，引物序列如下。

[0042] 鉴定CD11ccre小鼠基因型(货号：007567)引物序列如下：

[0043]引物 序列5'-->3' 引物类型
oIMR0872 AAG TTC ATC TGC ACC ACC G 转基因
oIMR1416 TCC TTG AAG AAG ATG GTG CG 转基因
oIMR7338 CTA GGC CAC AGA ATT GAA AGA TCT 内参上游引物
oIMR7339 GTA GGT GGA AAT TCT AGC ATC ATC C 内参下游引物

[0044] 鉴定TGF-β1flox小鼠基因型(货号：010721)引物序列如下：

[0045]引物 序列5'-->3' 引物类型
9314 AAG ACC TGG GTT GGA AGT G 上游引物
9315 CTT CTC CGT TTC TCT GTC ACC CTA T 下游引物

[0046] 2、试验过程

[0047] (1)PCR反应体系：用微量加样器按下面的反应体系在0.2mLPCR反应管中进行加样。

[0048] 1)CD11ccre小鼠鉴定反应体系：2×Taq PCR MasterMix6μL，DNA2μL，oIMR0872(10μM)0.5μL，oIMR1416(10μM)0.5μL，oIMR7338(10μM)0.5μL，oIMR7339(10μM)0.5μL，超纯水2μL，总体积12μL。

[0049] 2)TGF-β1flox小鼠鉴定反应体系：2×Taq PCR MasterMix6μL，DNA2μL，9314(10μM)0.5μL，9315(10μM)0.5μL，超纯水3μL，总体积12μL。

[0050] (2)PCR反应条件：将上述混合好的PCR管置PCR仪中进行基因扩增，PCR仪设置的反应条件如下：

[0051] CD11ccre小鼠鉴定反应条件：94℃3min；94℃30sec，59.5℃30sec，72℃1min，30循环；72℃5min。

[0052] TGF-β1flox小鼠鉴定PCR反应条件：94℃3min；94℃30sec，56.8℃30sec，72℃1min，30循环；72℃5min。

[0053] (3)琼脂糖凝胶电泳鉴定

[0054] 反应结束后取5μL反应产物，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统拍照。100bp DNA ladder作为标准分子量对照。

[0055] 1)PCR鉴定CD11ccre小鼠基因型标准

[0056] 结果判断：转基因173bp，内参基因324bp。

[0057] 2)PCR鉴定TGF-β1flox小鼠基因型标准

[0058] 结果判断：纯合子277bp，野生型216bp，杂合子277和216bp。

[0059] 实施例2采用骨髓嵌合技术构建DC不表达TGF-β1的Apoe-/-小鼠

[0060] Apoe-/-小鼠是动脉粥样硬化的易感小鼠。本实验以Apoe-/-小鼠为受者小鼠，以上述构建的CD11ccre-TGF-β1flox小鼠为供者小鼠，通过骨髓嵌合技术，建立DC不表达TGF-β1的Apoe-/-小鼠。该技术首先无菌冲出上述构建的CD11ccre-TGF-β1flox小鼠骨髓，制备骨髓细胞，由于TGF-β1flox小鼠的遗传背景与Apoe-/-小鼠遗传背景不同，为防止骨髓移植时的移植排斥反应，制备完的骨髓细胞再进一步通过磁珠分选技术去除T细胞。将磁珠分选后的骨髓细胞通过尾静脉回输经12Gray致死剂量X射线照射的Apoe-/-小鼠，建立DC不表达TGF-β1的Apoe-/-小鼠(图3)。同样的方法制备对照组TGF-β1flox小鼠的嵌合的Apoe-/-小鼠。具体操作过程如下。

[0061] 1、试剂准备

[0062] RPMI1640培养基购自奥地利PAA公司。

[0063] ACK红细胞裂解液的制备：碳酸氢钾(KHCO3)1.0g；氯化氨(NH4Cl)8.3g；EDTA-Na20.037g，加双蒸水至1000mL，即工作液。

[0064] 抗CD16/CD32和抗CD3-biotin抗体购自美国eBioscience公司。

[0065] Streptavidin microbeads和磁珠分选柱均购自德国美天旎公司。

[0066] 2、实验过程

[0067] (1)无菌制备供者小鼠骨髓细胞

[0068] 1)无菌冲骨髓：取上述构建的对照小鼠TGF-β1flox和实验小鼠CD11ccre-TGF-β1flox，分别进行颈椎脱臼法处死，75％酒精消毒皮肤，将小鼠置于超净工作台内，用眼科剪剪开皮肤，用眼科剪、镊剥离股骨、胫骨肌肉后，将胫骨、股骨置于盛无菌1640培养基的6孔培养板中。左手用镊子夹住骨，右手用1mL注射器吸取培养基，分别从股骨、胫骨的两头断端进针，将骨髓冲出，直至骨髓完全变白为止。

[0069] 2)离心收集骨髓细胞：将含有骨髓细胞的培养基2000rpm离心5min，弃上清。

[0070] 3)裂解红细胞：加入2mL无菌ACK(常规配制，过滤除菌)裂解红细胞3min。

[0071] 4)洗涤细胞：加1640培养基至40mL，2000rpm离心5min，弃上清。

[0072] 5)过滤细胞：细胞加入约30mL无菌0.01M、pH7.2的PBS(以下PBS均用这种)，用孔径为70μm的细胞滤网(美国BDFalcon)过滤细胞。

[0073] 6)离心收集细胞：2000rpm离心5min，弃上清，加入200μL PBS。

[0074] 7)封闭：加入2μL抗CD16/CD32(eBioscience公司)冰上封闭5min。

[0075] 8)标记：加入抗CD3-biotin抗体5μL，涡旋器涡旋后，冰上标记15min；加入20mLPBS，2000rpm离心5min，弃上清；沉淀细胞加入200μL PBS和streptavidin microbeads(德国美天旎公司)30μL，涡旋器涡旋后，冰上标记15min。

[0076] 9)磁珠分选：将磁珠分选器置于超净台内，将分选柱(德国美天旎公司)置于磁珠分选器(德国美天旎公司)磁场中，下面放置50mL无菌离心管收集细胞。加少许PBS润湿分选柱，于分选柱中加上述磁珠标记好的细胞，约3mL，待最后一滴尚未滴下时加入PBS3mL洗涤，共洗涤3次。收集50mL离心管中的细胞。

[0077] 10)细胞计数：将上述收集的细胞加入PBS至30mL，涡旋后取10μL加于血球计数板上，显微镜下计数。

[0078] 11)定容：将细胞进行2000rpm离心5min，加入PBS，将细胞定容至1×107个/mL。

[0079] (2)受者小鼠致死剂量X线照射

[0080] 于超净工作台内，每次将4只Apoe-/-小鼠置于塑料盒内，盖盖，将盛小鼠的塑料盒置于X射线生物学辐照仪(美国Rad Source Technologies，型号：RS2000PRO)箱体内中心位置，照射剂量为6Gray。间隔3小时之后，再用同样的方法照射6Gray，小鼠总的辐射剂量为12Gray。此剂量为致死剂量照射，可清除受者小鼠自身的造血系统细胞。

[0081] (3)尾静脉回输骨髓细胞

[0082] 于超净工作台内，用1mL注射器吸取上述制备好的对照小鼠TGF-β1flox和实验小鼠CD11ccre-TGF-β1flox的骨髓细胞，通过尾静脉注射回输上述经X线照射的小鼠体内，每只小鼠注射200μL，细胞数为2×106个。

[0083] 实施例3通过高脂饮食诱导经骨髓嵌合的Apoe-/-小鼠发生动脉粥样硬化[0084] 于骨髓嵌合后连续6周喂普通饲料，使移植的骨髓细胞得以重建。6周以后，连续进行12周高脂饲料(含胆固醇0.15％，含脂肪21％)以诱导小鼠动脉粥样硬化斑块的形成。饲料为Co60照射，购自北京科奥协力饲料有限公司。于12周检测血浆总胆固醇和甘油三酯含量、主动脉根部动脉粥样硬化斑块面积和斑块/官腔比。具体方法和结果如下。

[0085] 1、试剂准备

[0086] PBS(pH7.2、0.01M)，常规方法配制；EDTA抗凝剂，常规方法配制；油红O染色试剂盒购自南京建成生物工程研究所；包埋组织用的OCT为美国樱花牌产品。

[0087] 2、试验过程

[0088] (1)处死小鼠：于小鼠高脂饮食12周，轻轻地沿脊柱抓起小鼠，抓紧背部的皮肤使眼球突出，用弯头眼科镊摘取眼球放血处死，血液滴于含100μL0.5M EDTA抗凝剂的1.5mL离心管中，3000rpm离心10min，吸上层血浆检测。全自动生化分析仪进行血浆总胆固醇和甘油三酯浓度检测。

[0089] (2)小鼠的心脏灌注：小鼠放血处死后，用75％酒精喷雾消毒，放于托盘上，用眼科剪剪破皮肤，用手撕开皮肤，用剪刀把胸腔剪开，暴露心脏，剪破右心耳，找到心尖，用50mL注射器连接头皮针沿心尖左侧刺入左心室，用PBS立即进行心脏灌注，观察肝脏颜色，待肝脏变白停止灌注。此步操作目的是去除心脏红细胞，便于动脉粥样硬化斑块的染色及观察。

[0090] (3)心脏包埋：心脏灌注后剥离心脏，在升主动脉根部剪断，置于吸水纸上，用镊子剥离左右心耳，沿横轴从心脏中间切为二半。将连接升主动脉部分放于包埋槽中，切面朝下加入樱花OCT包埋剂，冻于-20℃，30分钟后收集起来并存放于-80℃冰箱内储存或立即进行切片。

[0091] (4)心脏切片：将冻存于-80℃冰箱内包埋好的心脏取出放于切片机内平衡温度30分钟，将冻好的组织块取出用胶水固定于冷冻头上等待10分钟，待其固定牢固，将冷冻头固定于切片机探头上。调整好切片深浅，刚开始用30μm厚度切片达到修片的目的。待出现主动脉瓣三个瓣叶时开始连续留片，切片厚度为5μm，将切片粘在载玻片上。

[0092] (5)油红O染色：按试剂盒说明书配制油红O工作液，将切片置于油红O工作液中室温染色15min；37℃温水冲洗3次，放于染色架上；将染色架放入苏木素染缸中，室温染色3-5min，自来水冲洗干净；用中性甘油封片，显微镜下观察染色效果及发病情况并拍照。

[0093] (6)CAD软件计算斑块面积

[0094] 采用CAD软件计算每只小鼠主动脉根部的斑块面积。方法如下。建立图层1和2；将图层1设为当前，插入图片。图片小时，点一下鼠标中间滑轮，下方命令显示放大比例为1，点enter，再划动鼠标滑轮，将图片放大；将图层2设为当前，用鼠标圈出斑块面积，关闭图层1，按最下方的命令写上area，点enter。将每只小鼠连续切片留取的主动脉根部最大斑块面积作为小鼠的斑块面积。

[0095] (7)统计学分析及作图：采用GraphPad Prism5软件进行统计学分析并作图，两组比较采用双尾t检验，以P<0.05为具有统计学意义。

[0096] 3、试验结果

[0097] (1)DC不表达TGF-β1引起血浆总胆固醇显著升高

[0098] 对骨髓嵌合的Apoe-/-小鼠血浆总胆固醇检测结果显示，与对照组TGF-β1flox嵌合的Apoe-/-小鼠相比，CD11ccre-TGF-β1flox嵌合的Apoe-/-小鼠血浆总胆固醇显著升高(图4)。而两组小鼠甘油三酯含量无显著差异(图略)。结果表明DC不表达TGF-β1引起血浆总胆固醇显著升高，即DC表达的TGF-β具有降低血浆总胆固醇的作用。

[0099] (2)DC不表达TGF-β1引起主动脉根部动脉粥样硬化斑块面积显著增加

[0100] 对小鼠主动脉根部的油红O染色(图5)及统计显示，与对照组TGF-β1flox嵌合的Apoe-/-小鼠相比，CD11ccre-TGF-β1flox嵌合的Apoe-/-小鼠主动脉根部斑块面积增加(图6)。斑块面积/官腔面积比亦显著高于对照组(图7)。这些结果表明，DC不表达TGF-β1引起主动脉根部动脉粥样硬化斑块面积显著增加，即DC表达的TGF-β1具有抗动脉粥样硬化作用。

[0101] 由于血浆总胆固醇升高是导致动脉粥样硬化的主要原因之一，因此，综合分析小鼠血浆总胆固醇的检测结果，说明DC表达的TGF-β1可以通过降低总胆固醇浓度而具有抗动脉粥样硬化作用。

[0102]

[0103]

[0104]